Đồ án tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ aspergillus spp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSANASE TỪ ASPERGILLUS SPP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGÔ ĐẠI NGHIỆP Sinh viên thực MSSV: 0851110196 : PHẠM MINH SANG Lớp: 08DSH6 TP Hồ Chí Minh, 2012 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ix DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương chitin chitosan .6 1.1.1 Lịch sử phát .6 1.1.2 Phân bố đặc điểm sinh hóa 1.1.2.1 Phân bố 1.1.2.2 Đặc điểm sinh hóa .7 1.1.3 Phương pháp thu nhận Chitosan oligomer từ Chitin 10 1.1.4 Ứng dụng Chitosan dẫn xuất thủy phân từ Chitosan 13 1.2 Đại cương hệ enzyme Chitosanase 16 1.2.1 Định nghĩa .16 1.2.2 Nguồn gốc phân loại 16 1.2.3 Các đặc tính hệ enzyme chitosanase 19 1.2.3.1 Trọng lượng phân tử 19 1.2.3.2 Tính đặc hiệu chất 19 1.2.3.3 Đặc tính thủy phân 20 1.2.3.4 Đặc tính động học .21 i Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 1.2.3.5 Ảnh hưởng pH nhiệt độ lên hoạt động chitosanase 22 1.2.3.6 Chất hoạt hóa chất ức chế 24 1.2.4 Cảm ứng tổng hợp, tinh chế xác định hoạt tính chitosanase 24 1.2.4.1 Cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase 24 1.2.4.2 Tinh chế chitosanase 25 1.2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính chitosanase 26 1.2.5 Ứng dụng chitosanase 26 1.2.6 Tình hình nghiên cứu chitosanase Thế giới Việt Nam 27 1.3 1.2.6.1 Tình hình nghiên cứu chitosanase giới 27 1.2.6.2 Tình hình nghiên cứu chitosanase Việt Nam 28 Khái quát lên men bán rắn 29 1.3.1 Định nghĩa lên men .29 1.3.2 Lên men bán rắn .29 1.3.3 So sánh lên men bán rắn với lên men chìm 30 1.4 Khái quát Aspergillus spp 32 1.4.1 Giới thiệu Aspergillus spp .32 1.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Aspergillus spp .33 1.4.3 Một số ứng dụng Aspergillus spp .34 1.5 Khái quát nguồn nguyên liệu cám gạo vỏ trấu nước .35 1.5.1 Nguồn cám gạo nước 35 1.5.2 Nguồn vỏ trấu nước 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 38 2.1.1 Chủng giống 38 ii Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 2.1.2 Cơ chất cảm ứng .38 2.1.3 Cơ chất nuôi cấy 38 2.1.4 Hóa chất thiết bị 38 2.1.4.1 Hóa chất 38 2.1.4.2 Thiết bị .39 2.1.5 2.2 Môi trường .39 2.1.5.1 Môi trường giữ giống 39 2.1.5.2 Môi trường nhân giống .39 2.1.5.3 Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme 40 2.1.5.4 Môi trường lên men bán rắn .41 Phương pháp 41 2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu 41 2.2.2 Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử 42 2.2.2.1 Cấy nhân sinh khối 42 2.2.2.2 Xác định số lượng bào tử phương pháp đếm buồng đếm hồng cầu …………………………………………………………………… 42 2.2.3 Phương pháp cấy điểm môi trường thạch đĩa chọn chủng nấm mốc có hoạt tính chitosanase cao .43 2.2.3.1 Nguyên tắc 43 2.2.3.2 Tiến hành 43 2.2.4 Phương pháp khuếch tán thạch đĩa .44 2.2.5 Phương pháp mơ tả hình thái vi sinh vật .44 2.2.5.1 Quan sát đại thể 44 2.2.5.2 Quan sát vi thể 44 iii Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 2.2.6 Phương pháp nuôi cấy môi trường bán rắn 44 2.2.7 Phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic) xác định hoạt tính chitosanase .45 2.2.7.1 Nguyên tắc 45 2.2.7.2 Tiến hành 45 2.2.8 Phương pháp Bradford – xác định hàm lượng protein .47 2.2.8.1 Nguyên tắc 47 2.2.8.2 Tiến hành 47 2.2.9 Phương pháp trích ly enzyme chitosanase .48 2.2.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý thống kê 49 2.2.10.1 Bố trí thí nghiệm 49 2.2.10.2 Xử lý thống kê 49 2.2.11 Bố trí thí nghiệm .49 2.2.11.1 Thí nghiệm khảo sát chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitosanase cao…………………………………………………………………………… 49 2.2.11.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ chất cảm ứng 49 2.2.11.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng độ thống khí 50 2.2.11.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng độ ẩm môi trường 50 2.2.11.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống 50 2.2.11.6 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 51 2.2.11.7 Nuôi cấy thu enzyme chitosanase 51 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 Khả sinh tổng hợp chitosanase từ năm chủng nấm mốc khảo sát 52 3.1.1 Định tính khả sinh tổng hợp chitosanase .52 iv Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 3.1.2 3.2 Định lượng khả sinh tổng hợp chitosanase 53 Hình thái đại thể vi thể chủng O2 54 3.2.1 Hình thái đại thể .54 3.2.2 Hình thái vi thể 55 3.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả sinh tổng hợp chitosanase .55 3.4 Ảnh hưởng độ thống khí đến khả sinh tổng hợp chitosanase 58 3.5 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến khả sinh tổng hợp chitosanase .61 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến khả sinh tổng hợp chitosanase 64 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitosanase .67 3.8 Kết lên men bán rắn thu nhận enzyme 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận .71 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC v Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC Carboxy Methyl Cellulose GlcN Glucosamine GlcNAc N – acetyl glucosamine kDa Kilo Dalton O1 Aspergillus oryzae – O2 Aspergillus oryzae – N1 Aspergillus niger – N3 Aspergillus niger – N7 Aspergillus niger – NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PGA Potato Glucose Agar LSF Liquid state fermentation SSF Solid state fermentation vi Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp DANH MỤC CÁC BẢNG TT Bảng 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 10 11 12 1.6 1.7 1.8 1.9 2.1 2.2 2.3 13 2.4 14 3.1 15 3.2 16 3.3 17 3.4 18 3.5 19 3.6 20 3.7 21 3.8 22 3.9 23 3.10 24 3.11 25 3.12 26 3.13 Nội dung Trang Các phương pháp hóa học sử dụng để tạo 10 oligomer chitosan Các chitosanase Họ 46 thuộc enzyme thủy phân liên 17 kết glycoside Trọng lượng phân tử chitosanase thu nhận từ loài khác 18 Đặc điểm thủy phân số chitosanase vi sinh vật 20 Hằng số Michaelis Vmax chitosanase số loài 20 tiêu biểu Giá trị pH tối ưu số chitosanase 22 Nhiệt độ tối ưu số chitosanase 23 So sánh trình lên men lỏng rắn 30 Thành phần xơ giá trị dinh dưỡng nguyên liệu 35 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucosamine 36 bước tiến hành xác định hoạt tính mẫu thí nghiệm 37 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn albumine 38 Các nghiệm thức khảo sát nồng độ chất cảm ứng lên khả 39 sinh tổng hợp Chitosanase) Đường kính vành khuyên phân giải chitosan theo phương 42 pháp cấy điểm chủng O1, O2, N1, N3, N7 Bán kính vịng thủy phân hoạt tính chitosanase 43 chủng nấm mốc sau 24 nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả sinh 46 tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến hàm lượng 47 protein Ảnh hưởng độ thoáng khí đến khả sinh tổng hợp 49 chitosanase Ảnh hưởng độ thống khí đến hàm lượng protein 50 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến khả sinh tổng 51 hợp chitosanase Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein 53 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến khả sinh tổng hợp 54 chitosanase Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein 56 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng 57 hợp chitosanase Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 58 Điều kiện tối ưu lên men bán rắn thu nhận chitosanase với 60 chủng O2 vii Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp DANH MỤC CÁC HÌNH TT 10 11 12 Nội dung Hình Trang 1.1 Cơng thức cấu tạo chitin 1.2 Công thức cấu tạo chitosan 1.3 Công thức biểu diễn công thức xác chitosan Cơ chế xúc tác chitosanase phản ứng phân cắt 1.4 chitosan Đặc điểm trình lên men bán rắn (SSF) (Moo – Young cộng sự, 1983) – xếp hạt chất rắn ẩm 1.5 30 pha khí liên tục hệ thống SSF với hệ nấm sợi (bên trái) sinh vật đơn bào (bên phải) Hình thái đại thể chủng O2, mặt khuẩn lạc (bên trái) 3.1 54 mặt khuẩn lạc Khuẩn ty (trái) cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 3.2 chưa nhuộm - ảnh quan sát ghi nhận vật kính 55 40 Khuẩn ty (trái) cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 3.3 nhuộm Methylene Blue - ảnh quan sát ghi nhận 55 vật kính 40 PL1 Khuẩn lạc đường kính vành khun phân giải PL2 Bình nhân giống chủng O2 môi trường lúa PL3 Đường chuẩn D - glucosamine PL4 Đường chuẩn Albumine viii Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Biểu đồ 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 10 3.10 11 3.11 Nội dung Trang Bán kính vịng thủy phân hoạt tính chitosanase 53 chủng nấm mốc sau 24 nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả 56 sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến hàm lượng 58 protein Ảnh hưởng độ thoáng khí đến khả sinh tổng 59 hợp chitosanase Ảnh hưởng độ thống khí đến hàm lượng protein 60 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến khả sinh 61 tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein 63 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến khả sinh tổng 65 hợp chitosanase Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein 66 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh 68 tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 69 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TT Sơ đồ 1.1 Nội dung Trang Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer 12 (Tokutake cộng sự, 1986) ix Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Chitin, chitosan polymer hữu phổ biến thiên nhiên; động vật thủy sản đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiêm tỷ lệ cao, từ 14-35% so với trọng lượng chất khô Hiện chitin, chitosan dẫn xuất chúng ứng dụng rộng rãi nhiêu lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y dược, Do dó, việc nghiên cứu sản xuât chitin, chitosan dẫn xuất chúng vấn đề quan tâm nghiên cứu Các sản phẩm từ loài giáp xác tồn giới ước tính tới 1,9 triệu năm, phần lớn sản phẩm từ tôm sản xuất từ nước châu Á có Việt Nam Mỗi năm ngành công nghiệp thải 1,4 triệu chất thải với chủ yếu vỏ đầu tôm Phương thức xử lý phần thừa thông dụng chủ yếu đốt bỏ, thải biển tập kết đến nơi xử lý rác Cách làm làm ô nhiễm vượt mức cho phép khu vực có kinh doanh khai thác chế biến loại giáp xác Ở nước ta, sản lượng phế phụ phẩm từ nhà máy chế biến thủy hải sản lớn Theo ước tính năm riêng nhà máy chế biến thủy, hải sản thải mơi trường 70 nghìn phế liệu vỏ tôm, cua loại Nếu phế phẩm chế biến thành sản phẩm có giá trị, ngồi việc mang lại nguồn lợi cao, cịn góp phần giải vấn đề nhiễm chi phí phát sinh trình xử lý chất thải Chitin, chitosan thủy phân để tạo thành chất có hoạt tính sinh học cao phương pháp hóa học (acid HCl đậm đặc) phương pháp sinh học (dùng enzyme papain, hemicellulase,…) Việc thủy phân chitin, chitosan phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm chi phí cao, hiệu suất thấp, gây nhiễm mơi trường, gây hao mịn máy móc thiết bị cao quan trọng sản phẩm thu có hoạt tính khơng cao Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất dẫn suất thủy phân từ chitin chitosan phương pháp sinh học Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp hướng có nhiều triển vọng điều kiện phản ứng nhẹ, gây nhiễm mơi trường sản phẩm thu có chất lượng tốt Bên cạnh đó, nấm mốc nguồn cung cấp hệ enzyme ngoại bào vô phong phú, khả sinh trưởng mạnh nguồn chất khác Vì vậy, việc nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme chitosanase nấm mốc việc làm cần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho ngun liệu, hóa chất quan trọng dễ dàng đưa vào ứng dụng sản xuất với điều kiện nước Vì lý trên, định chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.” khóa luận tốt nghiệp Tình hình nghiên cứu Trong nước: + Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griceus, Phạm Hồng Ngọc Thùy – Khoa chế biến trường đại học Nha Trang (03/2008) + Thu nhận mơ tả đặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1, Nguyễn Thị Phương Nhung – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội (2012) + Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ mẫu đất Phước Long – Nha Trang; Nguyễn Trọng Thăng Ngô Xuân Mạnh; Khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (2011) + Lâm Ngọc Tuyết, Đỗ Anh Tuấn, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thước (2003), Tạo dịng biểu gen mã hóa chitosanase E Coli, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, Nghiên cứu Sinh học, Nông nghiệp Y học, Bộ Khoa học Công nghệ, Hội đồng Khoa học tự nhiên, Ngành Khoa học sống, Huế + Cao Thị Ngọc Phượng, Ngô Phước Hậu, Đỗ Anh Tuấn, Trần Linh Thước, Jügen Pleiss (2003), Xây dựng sở liệu protein phục vụ nghiên cứu sinh Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp học: trường hợp chitinase chitosanase, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, Bộ Khoa học Công nghệ, Hội ngành Sinh học Việt Nam, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia, Hà Nội Nước ngoài: + J S PRICE and R STOCK; Production, Purification, and Characterization of an Extracellulase Chitosanase from Streptomyces; Journal of Bacteriology (12/ 1975) + Tamo Fukamizo, Yuji Honda, Sachio Goto, Isabelle Boucher and Ryszard Brzezinski; Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp N174; Biochem J (1995) Great Britain + Xiao-E Chen, Xu-Bo Fang Wen-Sui Xia; Strain imvironment and optimization of the media composition of chitosanase-producing fungus Aspergillus sp CJ 22-326; African Journal of Biotechnology Vol (14), 18 July, 2008 + Chih-Yu Cheng, Chu-Han Chang, Yue-Jin Wu, Yaw-Kuen Li; Exploration of Glycosyl Hydrolase Family 75, a chitosanase from Aspergillus fumigatus; The Journal of Biological Chemistry Vol 281, NO 6, February 10, 2006 U.S.A Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp - Làm phong phú thêm nguồn thu nhận chitosanase từ vi sinh vật - Tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát khả sinh tổng hợp chitosanase từ chủng Aspergillus ban đầu, chọn chủng có khả sinh tổng hợp chitosanase cao để tiến hành nghiên cứu - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên q trình lên men - Tiến hành ni cấy xác định hoạt tính chitosanase chủng chọn mơi trường tối ưu hóa Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp Phương pháp nghiên cứu Trong nuôi cấy vi sinh vật, khả khả sinh hoạt chất cao giống yếu tố định đến hiệu suất trình Vì vậy, trước thực hiện, cần tiến hành khảo sát từ chủng mốc giống cung cấp để chọn chủng cho kết khảo sát tối ưu môi trường thực khảo sát Sau chọn chủng tiến hành nghiên cứu, thực việc nghiên cứu chủng chọn yếu tố môi trường ảnh hưởng lên khả sinh tổng hợp enzyme như: tỷ lệ chất, độ ẩm, độ thống khí, tỷ lệ tiếp giống, thời gian ni cấy… Trong thí nghiệm này, thông số thay đổi mức yếu tố tiêu theo dõi hoạt tính enzyme hàm lượng protein thu mức yếu tố khảo sát Các kết đạt đề tài - Đã chọn chủng từ chủng giống cung cấp - Đã tối ưu hóa số điều kiện ni cấy ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chitosanase - Đã tiến hành ni cấy xác định hoạt tính enzyme mơi trường tối ưu hóa Kết cấu đồ án - CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU – nội dung chương đề cập đến nội dung có liên quan đến đề tài nghiên cứu - CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP – nội dung chương đề cập đến dụng cụ thiết bị đặc biệt phương pháp thực nghiệm dùng đồ án - CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN – nội dung chương đưa kết mà đề tài thực đưa biện chứng cho kết thu Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp - CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ – nội dung chương tóm tắt lại kết mà đề tài đạt đệ trình phần cần thực thêm đề tài Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 1.1 Đại cương chitin chitosan 1.1.1 Lịch sử phát Chitin Braconnot phát lần vào năm 1811 cặn dịch chiết loại nấm ông đặt tên “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm Năm 1823, Odier phân lập chất từ bọ cánh cứng ông gọi “chitin” hay “chitine” có nghĩa lớp vỏ Nhưng khơng phát có mặt Nitơ, cuối Braconnot Odier cho cấu trúc chitin giống cấu trúc cellulose [3] Năm 1929, Karrer đun sôi chitin với dung dịch KOH 5% 24 đun tiếp 160oC với kiềm bảo hòa 50 phút, ông thu sản phẩm có phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử, sản phẩm chitosan [3] Việc nghiên cứu dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng chitosan công bố từ năm 30 kỷ X Nhật, Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc Pháp nước thành công lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan Năm 1973, Nhật Bản nước sản xuất chitosan thương phẩm với sản lượng 20 tấn/năm, lên tới 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất 300 tấn/năm Theo Know (1991), thị trường có nhiều triển vọng chitin, chitosan Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức Nhật Bản coi nước dẫn đầu công nghệ sản xuất buôn bán chitin, chitosan Theo ước tính nhà phân tích, năm tới sản lượng chitosan đạt tới 118000 tấn/năm, đó, Nhật Mỹ nước sản xuất [1] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan ứng dụng sản xuất phục vụ đời sống vấn đề tương đối mẻ Vào năm 1978 – 1980, trường đại học Thủy sản Nha Trang công bố quy trình sản xuất chitosan tác giả Đỗ Minh Phụng Điều mở đầu bước ngoặc quan trọng việc nghiên cứu, nhiên chưa có ứng dụng thực tế sản xuất [1] Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 1.1.2 Phân bố đặc điểm sinh hóa 1.1.2.1 Phân bố Chitin polymer hữu phổ biến tự nhiên sau cellulose, tổng hợp với suất trung bình 20 g/năm/m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên, chitin diện động vật thực vật Ở động vật, chitin tìm thấy lớp vỏ ngồi tơm, cua lồi giáp xác; thành phần cấu trúc quan trọng vỏ số loài động vật không xương sống côn trùng, nhuyễn thể giun trịn Ở thực vật, chitin có thành tế bào nấm số tảo Chlorophiceae [11] 1.1.2.2 Đặc điểm sinh hóa Chitin chất rắn vơ định hình, bền, khơng tan nước, acid, kiềm, cồn dung môi hữu khác Tuy nhiên, chitin bị thủy giải acid vơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan) enzyme vi sinh vật [7] Ngồi ra, chitin diện trạng thái tự do, thường dạng phức hợp với protein, CaCO3 hợp chất hữu khác [3] Chitin polysaccharide mạch thẳng cấu tạo từ đơn phân N – acetyl glucosamine (GlcNAc), xem dẫn xuất cellulose, nhóm (– OH) C2 thay nhóm acetyl amino (-NHCOCH3) Như vậy, chitin poly N – acetyl – – amino – – deoxy – β – D – glucopyranose liên kết với liên kết 1,4 – β – glycoside Trong đó, mắc xích chitin đánh số glucose [3] Công thức phân tử: [C8H13NO5]n Mchitin = (203,186)n Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo chitin Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp Phụ thuộc vào nguồn gốc đặc điểm vùng, chitin có hai loại cấu trúc đặc trưng, gọi dạng α β Sự khác hai dạng nhận biết phương pháp phổ nghiệm phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chụp trạng thái rắn kết hợp với phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) Dạng thứ ba phổ biến γ – chitin, xuất phát từ số liệu phân tích, theo số nhà phân tích dạng thứ ba dạng khác cấu trúc α – chitin α – chitin dạng phổ biến tự nhiên, có mặt vỏ tơm, cua, lồi nhuyễn thể thức ăn cá voi biểu bì loại côn trùng… dạng β – chitin, tìm thấy protein mực ống [7] Chitin nguyên liệu bền, giúp loài giáp xác chống lại tác nhân gây hại áp suất mơi trường Để thủy phân hồn tồn chitin, vi sinh vật có khả thủy phân chitin hầu hết có hệ gồm loại enzyme thủy phân chitinase chitobiase (β – N – acetylglucosaminidase β – N – acetylhexosaminidase) [13] Chitosan dẫn xuất deacetyl hóa chitin, nhóm (–NH2) thay nhóm (–NHCOCH3) vị trí C2 Chitosan có cấu trúc mạch thẳng hình thành từ đơn phân D – glucosamin liên kết với liên kết 1,4 – β – glycoside, chitosan gọi poly 1,4 – β – – amino – – deoxy – D – glucose hay poly 1,4 – β – D – glucosamin Công thức phân tử: [C6H11NO4]n Mchitosan = (161,151)n Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo chitosan Chitosan tạo thành từ trình hóa học hay enzyme khơng bị khử hồn tồn nhóm acetyl Tỷ lệ acetyl cịn lại chitosan khác tùy theo Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp phương pháp khử acetyl tính nhạy cảm enzyme Sự phân bố N – acetyl glucosamine (GlcNAc) glucosamine (GlcN) mạch chitosan ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme thủy phân chúng Chitosan có hai dạng dị liên kết GlcNAcGlcN, GlcN – GlcNAc hai đồng liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcN – GlcN Do vậy, thủy phân liên kết chitosan enzyme khác [13] Trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen mạch cao phân tử chitosan (khoảng 10%) Vì vậy, cơng thức xác chitosan thể Hình 1.3, tỷ lệ m/n phụ thuộc vào độ deacetyl hóa chitin [8] Hình 1.3 Cơng thức biểu diễn cơng thức xác chitosan Độ deacetyl hóa – DD (Degree of deacetylation), tỷ lệ thay nhóm – NHCOCH3 nhóm –NH2 phân tử chitin (Hình 1.4.) Nếu DD < 50% chitin, DD ≥ 50% chitosan [7] Hình 1.4 Cơ chế xúc tác chitosanase phản ứng phân cắt chitosan Độ deacetyl hóa xác định dựa vào:  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H – NMR) Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp  Phổ hồng ngoại IR  Chưng cất chitin, chitosan với acid phosphoric  Phản ứng tạo màu với ninhydrin  Xác định theo Nitơ [32] Khi hòa tan dung dịch acid acetic loãng tạo thành dung dịch keo dương, nhờ mà khơng bị tủa có mặt số ion kim loại nặng như: Pb 2+, Hg+… chitosan polymer mang điện tích dương nên xem heteropolymer “polycation”, có khả bám dính bề mặt có điện tích âm protein, amino polysaccharide (alginate), acid béo phospholipid nhờ có mặt nhóm amino (-NH2) [12] Trong hầu hết polysaccharide tự nhiên cellulose, dextran, pectin, agar, agarose… trung tính hay có tính acid chitosan (chitin) lại có tính base cao [32] Nhiệt độ nóng chảy chitosan 309 – 311oC Trọng lượng phân tử chitosan thay đổi từ vài kDa đến hai ngàn kDa, tùy thuộc vào nguồn gốc chúng Trong tự nhiên, chitosan tìm thấy vách tế bào số loài nấm Zygomycetes, tảo lục Chlorella sp., lớp vỏ côn trùng, tôm, cua [33] 1.1.3 Phương pháp thu nhận Chitosan oligomer từ Chitin Nguyên liệu giàu chitin có nguồn gốc từ lồi giáp xác như: tơm, cua, mực, sam… rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ ngâm dung dịch acid loãng (HCl – 12%) để loại bỏ khoáng canxi tạp chất Hỗn hợp nấu với dung dịch NaOH loãng (8 – 15%) để loại protein tạp; sau ngâm hỗn hợp dung dịch KMnO4 0,5% H2SO4 10% (1:1), oxalic acid 3% để tẩy màu, thu nhận sản phẩm chitin Để thu nhận chitosan phải qua q trình khử nhóm acetyl chitin cách đun với dung dịch NaOH (40 – 50%) [9] Việc thủy phân chitin thành oligomer thực phương pháp dùng acid [29], enzyme [3] Sự thủy phân mạch polysaccharide chitosan acid cắt đứt liên kết glycoside phân tử đường D – glucosamin 10 ... tài ? ?Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp. ” khóa luận tốt nghiệp Tình hình nghiên cứu Trong nước: + Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thu? ??t từ Streptomyces... MỤC CÁC SƠ ĐỒ TT Sơ đồ 1.1 Nội dung Trang Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer 12 (Tokutake cộng sự, 1986) ix Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp MỞ ĐẦU Tính... sản phẩm thu có hoạt tính khơng cao Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất dẫn suất thủy phân từ chitin chitosan phương pháp sinh học Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp hướng