Đồ án tốt nghiệp thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn serratia marcenscens sh1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH o H hi C ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP h in M ity C THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 ni U CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ity rs ve Ngành: of Te Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG :TRẦN LÂM TÚ QUYÊN Lớp: 10DSH01 lo no MSSV: 1051110139 ch Sinh viên thực gy TP Hồ Chí Minh, 2014 Đồ án tốt nghiệp LỞI CẢM ƠN o H Em xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm - Môi trường, trường Đại học Cơng nghệ TP.HCM nhiệt tình giúp đỡ, hi C truyền đạt kiến thức tảng, kinh nghiệm quý báu cho em suốt trình học tập làm đồ án tốt nghiệp M Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hồi Hương, người h in đáng kính, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em nội dung kỹ năng, phương pháp, cách thức tiến hành thí nghiệm để em hồn thành đồ ity C án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành thầy Nguyễn Trung Dũng U tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình em thực đồ án ni phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường ve Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh gian đọc nhận xét đồ án tốt nghiệp em ity rs Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô hội đồng phản biện dành thời of Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ủng hộ, thương yêu dành cho điều tốt đẹp suốt trình học tập no ch Xin chân thành cảm ơn! Te sống TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 gy lo Sinh viện thực Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN o H Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, số liệu kết trung thực hi C Nếu phát có gian lận nào, tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung đồ án Trường Đại học Cơng Nghệ TP HCM không liên quan h in M đến vi phạm tác quyền, quyền gây trình thực TP.Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 ity C Sinh viên thực ity rs ve ni U of gy lo no ch Te Đồ án tốt nghiệp Mở Đầu Tính cấp thiết đề tài o H Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn thực vật, vi sinh vật, động vật có xương sống khơng xương sống nguồn có giá trị hợp chất hi C hoạt tính sinh học Một số lượng lớn loại thuốc phát triển ngành y từ sản phẩm tự nhiên (Amador cộng 2003) Kể từ phát thành công việc điều trị peniciline, vi sinh vật sử dụng M nguồn đặc biệt tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng ứng h in dụng điều trị chất chuyển hóa vi sinh vật cung cấp hội cho việc phát kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch cấy C ghép, tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain mevastatin) tác nhân ity chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin pentostatin) U Từ khoa học đại bắt đầu, hợp chất thứ cấp tự nhiên chiết ni xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ từ vi sinh vật sử dụng việc làm ve thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm , Nhưng sau đó, hợp chất thứ cấp tự nhiên rs nghiên cứu sâu cấu trúc hóa học cách tổng hợp ity phương pháp hóa học, người ta cho chúng bền hơn, sản xuất quy mơ lớn chi phí sản xuất thấp Tuy nhiên, vấn đề ô nhiễm môi trường of ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây hợp chất tổng hợp hóa học bắt đầu Te quan tâm ch So với hợp chất thứ cấp từ thực vật động vật hợp chất từ vi sinh no vật ngày quan tâm phát triển, vi sinh vật yếu tố tự nhiên an toàn để sử dụng, sản xuất quanh năm điều kiện địa lý lo khác tăng trưởng nhanh chóng vi sinh vật nên làm giảm thời gy gian sản xuất xuống vài ngày So với nguồn khác từ thực vật động vật hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật dễ dàng kiểm soát dự đoán sản lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984) Trong sắc tố từ vi sinh vật hợp chất prodigiosin biết đến với ý nghĩa quan trọng Đồ án tốt nghiệp Một số lồi Serratia, đặc biệt lồi Serratia marcenscens có khả tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams Qadri, 1980, Kobayashi El-Barrad, 1996; o H Press cộng sự, 1997; Someya cộng sự, 2000; Roberts cộng sự, 2005) Prodigiosin sắc tố màu đỏ, có hoạt tính kháng vi sinh vật bắt đầu hi C nghiên cứu từ năm 1960, thu hút nhiều quan tâm khả sử dụng làm màu tự nhiên ứng dụng lĩnh vực bảo vệ thực vật hoạt M chất kháng ức chế miễn dịch chống khối u (D’Alessio Rossi, 1996; Azuma h in cộng sự, 2000; Bennet Bentley, 2000; Melvin cộng sự, 2000, Tsuji cộng sự, 1990; Kataoka cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia cộng sự, 1997) C Dựa sở lợi ích quan trọng hợp chất prodigiosin tách từ việc ity nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, đề tài “THIẾT LẬP MÔI TRƢỜNG U DINH DƢỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN ni TỪ VI KHUẨN S MARCESCENS SH1” tiến hành nhằm tìm mơi Mục tiêu nghiên cứu rs ve trường điều kiện nuôi cấy để tổng hợp prodigiosin cao ity Khảo sát loại môi trường tổng hợp prodigiosin cao Khảo sát điều kiện nuôi cấy tổng hợp prodigiosin cao of Ý nghĩa khoa học Te Tìm mơi trường ni cấy tốt để tổng hợp prodigiosin nhiều Thiết lập điều kiện nuôi cấy tối ưu để tổng hợp prodigiosin nhiều ch no Ý nhĩa thực tiễn lo Prodigiosin hợp chất thứ cấp vi sinh vật nghiên cứu phát triển dược gy phẩm nên bán thị trường với giá cao Thành công đề tài góp phần vào việc tìm mơi trường tốt điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất ứng dụng hợp chất prodigiosin Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1 Hợp chất thứ cấp o H Hợp chất thứ cấp chất tạo từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, thường gọi chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ hi C sinh thái chủ thể với tác động lên chủ thể môi trường xung quanh Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật hợp chất vi sinh vật tạo từ q M trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp h in 1.1.2 Triển vọng tiềm sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật sử dụng thời gian dài cho sản xuất phân tử C sinh học thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine tác nhân thị Có ity quan tâm ngày tăng ngành công nghiệp thực phẩm việc sử dụng thành phần tự nhiên Các thành phần, chẳng hạn hợp chất thứ cấp, U ni xem tự nhiên xuất phát từ nguồn gốc sinh học động vật, thực vật ve vi sinh vật Hợp chất thứ cấp vi sinh vật sử dụng ngành cơng nghiệp chế biến cá, ví dụ để tăng màu hồng cá hồi nuôi Hơn nữa, số hợp chất rs tự nhiên có tiềm thương mại để sử dụng chất chống oxy hóa Ngành ity cơng nghiệp sản xuất số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng of thực phẩm, mỹ phẩm vật liệu dệt Trong tự nhiên phong phú hợp chất vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men vi khuẩn) Trong sắc tố tự Te nhiên vi sinh vật cung cấp số lượng hợp chất lớn như: ch carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin cụ thể monascin, violacein indigo (Dufosse, 2009) Các loại hợp chất có tiềm khai thác no cao, trình sản xuất đơn giản, đa dạng di truyền vi sinh vật, có lo thể dễ dàng tối ưu hóa quy trình cơng nghệ (Juailova cộng sự, 1997) gy Bên cạnh đó, số vi sinh vật có khả sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm chi Monascus (Hajjaj cộng sự, 2000) Serratia (Williams cộng sự, 1971a) Các chi vi sinh vật khác như: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia Phaffia có khả sản xuất số lượng lớn hợp Đồ án tốt nghiệp chất thứ cấp (Krishna, 2008), kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả gây chết kìm hãm vi sinh vật phát triển, số vi sinh vật (fungi, actmomycetes, bacteria) tạo ra, thành tựu quan trọng việc o H sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng Bảng 1.1 tóm tắt số hợp chất thứ cấp sản xuất vi sinh vật hi C Bảng 1.1 Danh sách số hợp chất thứ cấp sản xuất vi sinh vật M Hợp chất thứ Vi sinh vật Ứng dụng Kiểu tác động ức chế Ức chế tụ cầu Ức chế tạo polymer Penicillium khuẩn, nhiễm vách tế bào vi khuẩn, trùng kỵ khí, ức chế hấp thu amino giang mai, hen acid protein, ức chế suyễn tạo enzyme Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối Gram âm ram số amino acid vào dương Trị bệnh protein, tác động lên lao, bệnh viêm hệ enzyme vi màng não, ho gà khuẩn tham gia chrysogenum Penicillin ity C Penicillium notatum, ity h in cấp rs ve ni U Streptomyces griceus Streptomycin of chuyển pyruvate vào Te chu trình Creb… Ức chế venezuelae bệnh lỵ, sốt cao, khuẩn liên quan đến peptidyl transferase lo Chloramphenicol tổng hợp protein vi no sốt phát ban Ức chế đặc hiệu sinh ch Steptomyces gy tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide Đồ án tốt nghiệp Streptomyces aureomycin Tetracilin Ức chế phổ rộng Ức chế tổng hợp vi khuẩn Gram protein âm, Gram dương o H Streptomyces erythraeus hi C Erythromycin Chữa bệnh tụ ức chế vi khuẩn Gram cầu khuẩn âm Gram dương streptococcal gây M Streptomyces fradiae h in Neomycin khuẩnn Gram âm Gram dương ity C Streptomyces kanamycetius Kanamycin U ve lavendulae Điều trị lao, ức Tác động giống chế vi khuẩn streptomycin Gram âm neomycin Gram dương ni Streptomyces Hơi độc Tác dụng vi Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách tế bào ity rs 1.2 Tổng quan prodigiosin of 1.2.1 Khái niệm prodigiosin Prodigiosin tripyrrole phát lần khuẩn lạc đặc Te trưng vi khuẩn Serratia marcescens Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc ch từ “prodigious” có nghĩa điều kỳ diệu Prodigiosin tìm thấy dạng túi bên tế bào tế bào liên kết, dạng hạt bên tế no bào (Kobayashi Ichikawa, 1991) lo gy Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin chất chuyển hóa thứ cấp, sản xuất vi khuẩn Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra o H xạ khuẩn Gram dương, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli Streptomyces longisporus (Khanafari cộng sự, 2006) Hình 1.1 trình bày cấu trúc hi C hóa học hợp chất đại diện prodigiosin h in M ity C ity rs ve ni U of ch Te 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin lo no Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) gy Mãi đến năm 1960, cơng thức hóa học xác prodigiosin tổng hợp Serrattia marcescens biết đến (Rapoport Holden, 1962) Do tiến nhanh chóng khoa học phân tích quang phổ năm tiếp theo, mà cấu trúc prodigiosin dần nghiên cứu rõ ràng (Hesse, 2000) Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có cơng thức phân tử C20H25N3O trọng lượng phân tử 323,44 Da (Harris cộng sự, 2004; Song cộng o H sự, 2006; Williamson cộng sự, 2006) hi C Prodigiosin alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vịng pyrrole tạo thành khung pyrrolylpyrromethane, hai vịng đầu liên kết trực tiếp với nhau, vòng thứ ba gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri Williams, M 1972; Gerber, 1975) Cấu trúc prodigiosin có bảy liên kết đôi miêu tả h in tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008) C Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng không tan nước Prodigiosin ity tan tương đối alcohol ether; bên cạnh đó, dễ tan chloroform, methanol, acetonitrile DMSO (Grimont cộng sự, 1977; Khanafari ni U cộng sự, 2006) Tên sắc tố phân tử prodigiosin công thức of Serratia marcescens Norprodigiosin H25 N30 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da hydroxy-prodigiosene 2-Nonly-6- C10 H23N3O methoxyprodigiosene 363,5 Da C23H31 N3O gy madurae methoxy prodigiosene lo Nonylprodigiosin 323,4 Da C20 no Nocardia 2-Methyl-3-amyl-6- ch Prodigiosin Te Serratia marcescens (Actinomadura) Trọng lƣơng Danh pháp ity Loài rs ve Bảng 1.2 Xác định cấu trúc số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) o H hi C 120 100 100 80 60 45.9 30.2 40 40 34.7 38.1 20 M Phần trăm hàm lƣợng prodigiosin môi trƣờng (%) Đồ án tốt nghiệp MT2 h in MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + Sor Man Mal Suc TB Môi trƣờng MT2 nguồn đƣờng C Hình 3.15 Kết hàm lượng prodigiosin loại đường ity Qua kết hình 3.15 cho thấy hàm lượng prodigiosin môi trường U không thêm đường cao so với tất môi trường bổ sung đường, môi ni trường bổ sung Sorbitol cho hàm lượng prodigiosin thấp ve Theo Khanafari cộng (2006), trình sản xuất prodigiosin Serratia rs macecens giảm glucose loại đường lên men khác có giảm pH ity canh trường ni cấy, kết thí nghiệm với kết of Khanafari cộng Từ đây, người thực đề tài định không bổ sung đường vào môi trường huyền phù đậu phộng peptone Te Như số nguồn cacbon bổ sung, 1% dầu hướng dương làm tăng ch hàm lượng prodigiosin cao (32,5% so với đối chứng) Do mơi trường lên no men thu prodigiosin chọn MT3 = MT1 (10% đậu phộng) + 5% peptone + lo 1% dầu hướng dương Môi trường MT3 sử dụng cho khảo sát gy 70 Đồ án tốt nghiệp 3.5 Xác định điều kiện lên men tổng hợp prodigiosin 3.5.1 Xác định tỉ lệ cấy giống môi trường MT3 o H Tỉ lệ cấy giống quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến trình tăng trưởng tế bào vả sản xuất sắc tố hi C Sau 48 tăng sinh, thu mẫu, tiến hành trích ly dung mơi Ethanol:HCl (95:5), sau đo OD535nm dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng M prodigiosin mẫu thu Kết tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến trình h in tổng hợp prodigiosin thể bảng 3.8 hình 3.16 ity C Bảng 3.8 Hảm lượng prodigiosin môi trường MT3 qua tỉ lệ cấy giống 5% 9,4a± 0,12 85 Te 80 60 68 ch 40 20 1% 3% 5% 7% Hình 3.16 Kết hàm lượng prodigiosin qua tỉ lệ cấy giống 71 gy Tỉ lệ cấy giống lo no Hàm lƣợng prodigiosin (% so với đối chứng) 100 5,57d ± 0,52 of 100 114 7% ity 140 120 7,03c±0,54 rs 8,24b±0,58 ve prodigiosin (mg/ml) 3% ni 1% U Hàm lượng Tỉ lệ cấy giống Đồ án tốt nghiệp Trong nghiên cứu này, quan sát thấy tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến trình sản xuất prodigiosin chủng SH1 Một loạt thử nghiệm tỉ lệ cấy giống 1%, 3%, 5%, 7% cho thấy khác biệt hàm lượng prodigiosin, kết thấy tỉ o H lệ cấy giống 3% ≈ 3,84x108 (cfu/ml) cho hàm lượng prodigiosin cao đạt 9,4 ± 0,12 (mg/ml) hi C Vì vậy, từ kết nghiên cứu người thực đề tài định chọn tỉ lệ cấy giống 3% làm thí nghiệm tỉ lệ cấy giống tốt M h in 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng vận tốc lắc đến q trình tổng hợp prodigiosin mơi trường MT3 C Mỗi vi sinh vật có điều kiện oxi khác nhau, có chủng hiếu khí, có chủng ity kị khí có chủng kỵ khí tùy nghi, biết điều kiện cần ni U thiết góp phần làm tăng q trình sinh trưởng vi sinh vật Oxy ảnh hưởng đến trình tổng hợp prodigiosin S.marcescens, có ve ghi nhận prodigiosin sản xuất tốc độ lắc 150 vòng/phút (Krishna, 2008) 200 ity rs vòng/phút (Wei cộng sự, 2005) Từ đây, người thực đề tài thí nghiệm vịng lắc cho kết bảng of 3.9 hình 3.17 150 180 no Khơng lắc ch Vận tốc lắc (vòng/phút) Te Bảng 3.9 Hàm lượng prodigiosin môi trường MT3 qua vận tốc lắc 5,06b±0,31 6,11a ± 0,07 lo Hàm lượng gy prodigiosin (mg/ml) 180/150 2,75d±0,35 3,65c± 0,23 72 o H hi C Hàm lƣợng prodigiosin (% so với đối chứng) Đồ án tốt nghiệp 167 139 100 75 h in M 180 160 140 120 100 80 60 40 20 không lắc 150 180 180->150 ity C Vận tốc lắc (vòng/phút) Hình 3.17 Kết hàm lượng prodigiosin qua vận tốc lắc U Kết hình 3.17 cho thấy có khác biệt hàm lượng prodigiosin thu ni vận tốc lắc khác Không lắc hiển nhiên hàm lượng prodigiosin tổng ve hợp 75% so với đối chứng 100%, giảm 25% Ở tốc độ lắc 180 vòng/phút rs hàm lượng prodigiosin tăng 39% so với đối chứng 150 vòng/phút Điều cho ity thấy môi trường chứa huyền phù đậu phộng độ nhớt cao môi trường lỏng thông thường nên nhu cầu oxy cao Khi giữ nguyên vận tốc lắc 180 of vòng/phút 24 đầu giảm 150 vòng/phút 24 sau hàm lượng Te prodigiosin cao tăng 67% so với đối chứng Có thể giải thich rằng: prodigiosin hợp chất thứ cấp, trình tổng hợp xảy hai pha: pha tăng ch trưởng pha tổng hợp Trong pha tăng trưởng cần cung cấp oxy cho tế bào, mà độ no nhớt môi trường NB thấp độ nhớt mơi trường đậu phộng cao lo gấp nhiều lần so với NB chình vỉ để thu sinh khối tốt cần tăng vận tốc lắc gy lên 180 vịng/phút Ở giai đoạn sau, q trình tổng hợp prodigiosin có gắn kết protein lên lớp màng ngồi tế bào (Allen cơng sự, 1983), vận tốc lắc lớn ảnh hưởng đến gắn kết nên cần giảm vận tốc xuống 150 73 Đồ án tốt nghiệp vòng/phút Kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu trước o H Vì vậy, từ kết nghiên cứu người thực đề tài định chon điều kiện 24 đầu lắc 180 vòng/phút 24 sau lắc 150 vòng/phút làm thí nghiệm tiếp hi C theo 3.6 Động học q trình tổng hợp prodigiosin mơi trƣờng MT3 M Kết khảo sát động học tổng hợp prodigiosin chủng vi khuẩn SH1 h in thể hình 3.18 C Kết tính tốn tốc độ sinh trưởng cực đại μmax = 0,157 (h-1) ity pha log từ đến 12 Thời gian thu prodigiosin từ 36 không trễ 48 Trong tổng hợp prodigiosin bắt đầu tứ 10 thực (mg/ml/h) ve ni U mạnh từ 36 – 48 với tốc độ tổng hợp prodigiosin cực đại qpmax= 0,3 Quá trình tổng hợp sắc tố chủng vi sinh vật xảy khơng song song với rs q trình tổng hợp sinh khối, mà trễ pha Như tế bào vào pha cân ity động trình tổng hợp mạnh prodigiosin thực bắt đầu Đến 48 of trình tổng hợp sinh khối bắt đầu giảm mạnh q trình tổng hợp prodigiosin nằm pha cân Chỉ sau 54 sắc tố giảm mạnh Te pH môi trường thay đổi làm cho cấu trúc sắc tố thay đổi lo no ch gy 74 o H 9.00 8.00 10 7.00 9.5 6.00 5.00 8.5 4.00 hi C Log mật độ tế bào (Log cfu/ml) 10.5 M 7.5 3.00 h in 2.00 1.00 C 0.00 ity 20 40 60 Hàm lƣợng prodigiosin mẫu (mg/ml) Đồ án tốt nghiệp 80 Series2 Log mật độ tế bào Hàm lượng prodigiosin(mg/ml) Series1 rs ve ni U Thời gian (giờ) ity Hình 3.18 Đường cong tăng trưởng tế bào tổng hợp prodigiosin SH1 môi trường MT3 of lo no ch Te gy 75 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Điều kiện nhân giống chủng Serratia marcescens mơi trường NB có pH o H nằm khoảng 6,2 đến 8,2, có điều kiện hiếu khí lắc 150 vịng/phút có tỉ lệ cấy giống 1% hi C Trong trình lên men thu prodigiosin, môi trường huyền phù đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lượng prodigiosin 248,4% so với môi trường peptone M glycerol 100% h in Bổ sung gelatin không làm tăng mà giảm prodigiosin tổng hợp đáng kể tăng độ nhớt môi trường C Bổ sung peptone 5% vào môi trường MT1 (10%) làm tăng hàm lượng ity prodigiosin tổng hợp lên đến 150,4%, tăng 50,4% so với môi trường MT (10%) Trong số nguồn C bổ sung, đường không làm tăng prodigiosin tổng hợp, U bổ sung dầu hướng dương 1% làm tăng prodigiosin tổng hợp lên đến ni 132,5%, tăng 32,5% so với môi trường MT2 (MT1 bổ sung 5% peptone) ve Tỉ lệ cấy giống 3% tương đương 3,84x108 (cfu/ml) tỉ lệ cho hàm lượng rs prodigiosin tăng 14% so với tỉ lệ 1% làm đối chứng ity Vận tốc pha tăng trưởng (24 đầu) 180 vòng/phút pha tổng hợp (24 67% so với vận tốc 150 vòng/phút làm đối chứng of sau) 150 vòng/phút làm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp lên đến 167%, tăng Te Đường cong tăng trưởng tế bào tổng hợp prodigiosin cho thấy ni ch cấy vi khuẩn thu prodigiosin môi trường chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton 1% dầu hướng dương, tỉ lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút 24 no đầu sau giảm cịn 150 vịng/phút Thời điểm thu hồi prodigiodin bắt đầu lo từ 36 kết thúc không muộn 48 gy Kết hợp tất yếu tố điều kiện tốt cho q trình ni cấy chủng SH1 sản xuất prodigiosin 76 Đồ án tốt nghiệp 4.2 Kiến nghị Cần nghiên cứu thêm số vấn đề sau: - Khảo sát thêm nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy để sản xuất o H prodigiosin nhiều - Thử nghiệm môi trường điều kiện ni cấy thu điều kiện kiểm sốt hi C nhiệt độ để hàm lượng prodigiosin tổng hợp ổn định - Tối ưu hóa quy trình trích ly tinh prodigiosin M - Khảo sát kháng nấm nhiều loại nấm bệnh khác phù hợp h in - Prodigiosin thu dạng thơ, cần nghiên cứu trình tinh prodigiosin dạng tinh để có giá trị cao ity thư C - Prodigiosin sau tinh sạnh đem thử nghiệm khả diệt tế bào ung - Prodigiosin sau tinh sạnh đem khảo sát khả miễn dịch ity rs ve ni U of lo no ch Te gy 77 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Hiếu Dân, (2013) Khảo sát hoạt tính sinh học vi khuẩn Serratia o H marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN hợp chất màu dạng prodigiosin tổng hợp vi khuẩn Đồ án tốt nghiệp hi C Nguyễn Hoàng Anh Kha, (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN Đồ án tốt nghiệp M TÀI LIỆU TIẾNG ANH h in Amaya D.B.R (2001) A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, OMNI Research, ILSI Press, United States of America, pp -71 M.M and C Aguilera Smart J.R (1993) Development, reproduction, and ity pathogenicity of Steinernema scapterisci in monoxenic culture with different species of bacteria, J Invertebr, Pathol, 62: 289-294 U Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr ni (2006) Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, ve Online Journal of Biological Sciences, (1): 1-13 rs Bauernfeind J.C (1981) Natural food colors Carotenoids as Colorants and ity Vitamin A Precursors, Bauernfeind J.C., Academic Press, New York, 1-45 Bizio B (1823) Lettera di Bartolomeo Bizio al chiarissimo canonico Angelo of Bellani sopra il fenomeno della polenta porporina Biblioteca Italiana o sia Te Giornale di Letteratura, Scienze e Arti, 30: 275-295 ch Brigida P.V de Q and Itamar S de M (2006) Antagonism of Serratia marcescens towards Phytophithora parasitica and its effects in promoting no the growth of Citru s, Brazilian Journal of Microbiology, 37: 448-450 lo Casullo de Araújo, Helvia W., K Fukushima, and Galba M Campos Takaki resources as a low cost substrate." Molecules 15.10 (2010): 6931-6940 78 gy "Prodigiosin production by Serratia marcescens UCP 1549 using renewable- Đồ án tốt nghiệp Chang, Chia-Che, et al "Development of natural anti-tumor drugs by microorganisms." Journal of bioscience and bioengineering 111.5 (2011): 501-511 o H Chidambaram K.V., Perumalsamy L (2009) An Insightful Overview on Microbial Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, Vol 5(3): 49-61 hi C Counsell J.N., Jeffries G.S and Knewstubb C.J (1979) Some other natural colors and their applications, Natural Colors for Foods and Other Uses, Counsell M J.N and Dunastable J.A., Eds Applied Science, London, 122-151 h in Dauenhauer S.A., Hull R.A and Williams R.P (1984) Cloning and expression in Escherichia coli of Serratia marcescens genes encoding prodigiosin C biosynthesis, Journal of Bacteriology, 158: 1128-1132 ity David R Caprette (2012) Enterobacteriaceae: Serratia marcescens Rice University Houston, Texas, US U Estrada, Castro, Regina Basurto-Ríos, Jorge Toledo, Jorge E Ibarra (2012) ni Phoresis between Serratia marcescens and Steinernema carpocapsae ve (Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of Galleria mellonella rs (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae, Florida Entomologist, 95(1):120-127 ity Feng J.S., Webb J.W and Tsang J.C (1982) Enhancement by sodium dodecyl sulfate of pigment fonnation in Serratia marcescens O8, Appl, Environ, of Microbiol, 43: 850-853 Te Florencio J.A., Soccol C.R., Furianetto L.F., Bonfim T.M.B., Krieger N., Baron M ch and Fontana J.D (1998) A factorial approach for a sugarcane juicebased low cost culture medium: increasing the astaxanthin production by no the red yeast Phaffia rhodozyma, Bioprocess Eng, 19,161-164 lo Fodor A., Fodor A.M., Forst S., Hogan J.S., Klein M.G., Lengyel K., Saringer G., gy Stackebrandt E., Taylor R.A.J and Lehoczky E (2010) Comparative analysis of antibacterial activities of Xenorhabdus species on related and non-related bacteria in vivo, J Microbiol, Antimicrob, 2: 36-46 79 Đồ án tốt nghiệp Furstner A (2003) Chemistry and biology of roseophilin and the prodigiosin alkaloids: A survey of the last 2500 years, Chem Int Ed Engl, 42: 3582-3603 Khanafari, Anita, Mahnaz M Assadi, and Fatemeh A Fakhr "Review of o H prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens." Online Journal of Biological Sciences 6.1 (2006): hi C Gargallo D., Loren J.G., Guinea J., Vinas M (1987) Glucose-6-phosphate dehydrogenase alloenzymes and their relationship to pigmentation in M Serratia marcescens, Appl Environ Microbiol, 53: 1983-1986 h in Gaughran E.R.L (1969) From superstition to science the history of a bacterium,Transactions of the New York Academy of Sciences, 31:3-24 C Gauthier, M J "Alteromonas rubra sp nov., a new marine antibiotic-producing 459-466 ity bacterium." International Journal of Systematic Bacteriology 26.4 (1976): U Gillen A.L and Gibbs R (2011) Serratia marcescens: The Miracle Bacillus, ni Department of Biology and Chemistry, Liberty University ve Giri, Anuradha V., et al "A novel medium for the enhanced cell growth and rs production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil." BMC ity microbiology 4.1 (2004): 11 Goldschmidt M.C and WiIliams R.P (1968) Thiamine-induced Formation of of the Monopyrrole Moiety of Prodigiosin, J Bacteriol, 96: 609-616 Te Grimont, Patrick AD, and Francine Grimont "The genus Serratia." Annual Reviews ch in Microbiology 32.1 (1978): 221-248 Gulani, Chandni, Sourav Bhattacharya, and Arijit Das "Assessment of process no parameters influencing the enhanced production of prodigiosin from Serratia gy potentials." Malaysian Journal of Microbiology 8.2 (2012): 116-122 lo marcescens and evaluation of its antimicrobial, antioxidant and dyeing Han S.B., Park S.H., Jeon Y.J., Kim Y.K., Kim H.M., Yang K.H (2001) Prodigiosin blocks T cell activation by inhibiting interleukin - 2Rα 80 Đồ án tốt nghiệp expression and delays progression of autoimmune diabetes and collagen induced arthritis, J Pharm Exp Ther, 299: 415-425 Hardjito L., Huq A., Colwell R.R (2002) The influence of environmental o H conditions on the production of pigment by Serratia marcescens, Biotechnol Bioprocess Eng, 7: 100-104 hi C Harris K.P., Williamson R., Slater H., Cox A., Abbasi S., Foulds I., Simonsen T., Leeper J and Salmond P.C (2004) The Serratia gene cluster encoding M biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, shows species and strain h in dependent genome context variation, Microbiol, 150: 3547-3560 Helvia W.C de A., Fukushima K and Gallba M.C.T (2010) Prodigiosin C Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using Renewable-Resources as ity a Low Cost Substrate, Molecules, 15: 6931-6940 Hiroaki M., Hiroyuki A., Masakatsu F., Takeji S., Teisuya T (1996) Industrial U production of optically active intermediate in the synthesis of dialtizem ni with lipase, Seibutsu kogaku, 74: 273-288 ve Kataoka T., Magae J., Kasamo K., Yamanishi H., Endo A., Yamasaki M., Nagai K rs (1992) Effects of prodigiosin 25-c on cultured cell lines: Its similarity to ity monovalent polyether ionophores and vacuolar type H+-ATP ase inhibitor, J Antibiot, 45: 1618-1625 of Khanafari A., Assadi M.M and Fakhr F.A (2006) Review of prodigiosin, Te pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13 ch Krishna J.G (2008) Pigment production by marine Serratia sp BTWJ8, PhD dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology no Cochin University of Science and Technology, Kerala, India lo Lawanson A.O and Sholeye F.O (1975) Inhibition of prodigiosin formation gy in Serratia marcescens by adenosine triphosphate, Experientia, 32: 439-440 Lewis S.M., Corpe W.A (1964) Prodigiosin producing bacteria from marine sources, Appl Microbiol, 12: 13-17 81 Đồ án tốt nghiệp Iranshahi M., Shahverdi A.R., Mirjani R., Amin G., Shafiee A (2004) Umbelliprenin from Ferula persica roots inhibits the red pigment production in Serratia marcescens, Z Naturforsch, 59: 506-508 o H Johnson E.A., Lewis M.J and Grau C.R (1980) Pigmentation of Egg Yolks with Astaxanthin from the Yeast Phaffia rhodozyma Poultry Science, hi C 59,1777-1782 Malpartida F., Niemi J., Navarrete R and Hopwood D.A (1990) Cloning and M expression in a heterologous host of the complete set of genes for the h in biosynthesis of the Streptomyces coelicolor antibiotic undecylprodigiosin, Gene, 93: 91-99 C Mandarville R.A (2001) Synthesis, Proton affinity and Anticancer properties of the ity prodigiosin group of natural product, Curr Med Chem, 1: 195-218 Ortega-Estrada, María De Jesús, et al "Phoresis between Serratia marcescens and U Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of mellonella ni Galleria (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae." Florida ve Entomologist95.1 (2012): 120-127 rs Pérez-Tomás R and Viñas M (2010) New insights on the antitumoral properties of ity prodiginines, Curr Med Chem., 17: 2222-2231 Pfander H., Riesenz R and Nigglil U (1994) HPLC and SFC of carotenoids of - scope and limitations, Pure Appl, Chem 66: 947-954 Te Phonnok, Sirinet, Wanlaya Uthaisang-Tanechpongtamb, and Benjamas Thanomsub ch Wongsatayanon "Anticancer and apoptosis-inducing activities of microbial metabolites." Electronic Journal of Biotechnology 13.5 (2010): 1-2 no Qadri S.M.H and Williams R.P (1972) Induction of Prodigiosin Biosynthesis gy marcescens, Appl Microbiol, 23: 704-709 lo after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia Ramina M Samira Y.Y (2009) The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok, vol 12: 268-274 82 Đồ án tốt nghiệp Rosenzwcig W.D and Stotzky G (1980) Prodigiosin and the inhibition of Aspergillus niger by Serratia marcescens in soil, Soil Bioi Biochent, 12: 295296 o H Shahitha S and Poornima K (2012) Enhanced Production of Prodigiosin Production in Serratia Marcescens, Journal of Applied Pharmaceutical hi C Science, 02 (08): 138-140 Slater H., Crow M., Everson L and Salmond G.P.C (2003) Phosphate availability M regulates biosynthesis of two antibiotics, prodigiosin and carbapenem, in h in Serratia via both quorum sensing-dependent andindependent pathways, Mol Microbiol, 47: 303-320 C Tariq A.L and John J.P (2010) Molecular Characterization of Psychrotrophic ity Serratia marcescens TS1 Isolate form Apple Garden at Badran Kashmir, Journal of Agriculture and Biological Sciences, 6(3): 364-369 U Thomson R.H (1962a) Melanins, Comparative Biochemist'y, Florkin M and ni Mason H.S., Vol III: Constituents of Life Part A, Academic Press, New rs ve York, 727-753 Turner J.M and Messenger A.J (1986) Occurrence, biochemistry, and physiology ity of phenazinc pigment production, Adv Microbial Physiol, 27, 211-275 Venil, Chidambaram Kulandaisamy, and Perumalsamy Lakshmanaperumalsamy of "An insightful overview on microbial pigment, prodigiosin." Electronic Te Journal of Biology 5.3 (2009): 49-61 ch Wei Y.H., Chen W.C (2005) Enhanced production of prodigiosin-like pigment from Serratia marcescens SMΔR by medium improvement and oil no supplementation strategies, J Biosci Bioeng, 99: 616-622 lo Williams R.P., Gott C.L and Qadri S.M.H (1971) Induction of pigmentation in amino acids, J Bacteriol, 106,444-448 gy non proliferating cells of Serratia marcescens by addition of single Williams R.P (1973) Biosynthesis of prodigiosin, a secondary metabolite of Serratia marcescens, Appl Microbiol, 25: 396-402 83 Đồ án tốt nghiệp Williamson N.R., Simonsen H.T., Ahmed R.A., Goldet G., Slater H., Woodley L., Leeper F.J., Salmond P.C (2005) Biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, in Serratia: identification of a novel 2-methyl-3-n-amyl- o H pyrrole (MAP) assembly pathway, definition of the terminal condensing enzyme, and implications for undecylprodigiosin biosynthesis in hi C Streptomyces, Mol Microbiol, 56: 971-989 Williamson N.R., Fineram P.C., Leeper F.J., Salmond G.P.C (2006) The M biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines Nat Rev Microbiol, 4: h in 887-899 Zhang J., Shen Y., Liu J and Wei D (2005) Antimetastatic effect of prodigiosin TÀI LIỆU WEB ity C through inhibition of tumor invasion, Biochem Pharmacol., 69: 407-414 http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/prodigiosin-serratia- U marcescens,EMD_BIO-529685 ni http://www.scbt.com/datasheet-202298-prodigiosin.html ve http://www.biovision.com/prodigiosin-6686.html rs http://www.bioaustralis.com/productorder.php?prodid=BIA- ity P1194&name=Prodigiosin&searchtermf=Antitumor http://www.biomerieux- of usa.com/servlet/srt/bio/usa/dynPage?doc=USA_PRD_LST_G_PRD_USA_5& Te pubparams.sform=0 lo no ch http://localhost/jsp/ident/index.jsp gy 84