BÀI 1 KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ CÁCH SỬ DỤNG

NGUYÊN TẮC: Kính hiển vi KHV quang học là thiết bị không thể thiếu đối với phòng thí nghiệm nghiên cứu sinh học, cho phép quan sát trong giới hạn của nó các vật thể rất nhỏ là công cụ đắ

BÀI 1: KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ CÁCH

SỬ DỤNG

1 NGUYÊN TẮC:

Kính hiển vi (KHV) quang học là thiết bị không thể thiếu đối với phòng thí nghiệm nghiên cứu sinh học, cho phép quan sát trong giới hạn của nó các vật thể rất nhỏ là công cụ đắc lực để ghi nhận các kết quả thí nghiệm cũng như quan sát mô tả

1.1 Cấu tạo kính hiển vi:

a Các bộ phận quang học:

- Thị kính, vật kính, tụ quang: để tập trung ánh sáng vào vật

- Hệ thống đèn chiếu sáng hoặc gương phản quang

- Các vật kính sử dụng trong KHV quang học có độ phóng đại x10, x20, x40, x60, x90, x100

- Thị kính thường có độ phóng đại x10 hoặc x15

Vì vậy độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính

Hình 1 Kính hiển vi quang học

b Các bộ phận cơ học:

Chân kính, trụ mang ống kính, bàn kính (bàn mang mẫu vật), ốc điều chỉnh sơ cấp (ốc chỉnh thô) và ốc điều chỉnh thứ cấp (ốc chỉnh tinh) để điều chỉnh rõ nét ảnh của vật

1.2 Cách sử dụng:

Để bảo vệ kính hiển vi và tiêu bản, khi dùng kính phải thận trọng, vặn

ốc phải từ từ, nhẹ nhàng và tiến hành thứ tự theo các bước sau:

- Cắm điện, bật công tắc nhìn vào thị kính, điều chỉnh nguồn sáng để ảnh sáng đều thị trường

- Bao giờ cũng xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trước

- Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng tâm nguồn sáng

- Nhìn dưới kính mang vật (lame), vặn nhẹ ốc sơ cấp xuống đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm nhẹ lame

- Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ốc sơ cấp lên đến khi nhìn thấy rõ hình ảnh mẫu vật Nếu chưa rõ chi tiết vặn nhẹ ốc vi cấp để thấy rõ)

- Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn (x40) thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường Nhìn bên ngoài lame, vặn sang vật kính lớn (x40) sao cho không đụng lame là được Khoảng cách giữa vật kính (x40) và lame rất nhỏ nên chỉ vặn nhẹ ốc sơ cấp lên hoặc chỉ dùng ốc vi cấp để chỉnh rõ hình ảnh

- Khi sử dụng vật kính có độ phóng đại x100, người ta dùng vật kính dầu để giảm sự tán sắc của ánh sáng khi đi qua lame và lamelle để vào vật kính Đầu tiên cũng dùng vật kính có độ phóng đại nhỏ để xác định vị trí cần tìm trên tiêu bản như phần trên Sau đó nhỏ giọt dầu cede lên tiêu bản đổi vật kính sang độ phóng đại lớn (x100) Nhúng đầu vật kính chìm vào giọt dầu điều chỉnh ốc vi cấp nhẹ nhàng để nhìn thấy ảnh của mẫu vật khi vật kính vẫn chìm trong giọt dầu

1.3 Những điểm cần lưu ý khi sử dụng KHV:

- Không sờ vào thấu kính Khi thấu kính bẩn lau nhẹ bằng vải bông mềm, sạch và tránh làm xước thấu kính

- Khi quan sát, cần thường xuyên nhấp nháy ốc vi cấp để thấy được đầy đủ các mặt phẳng khác nhau của vi phẫu

ốc vi cấp chuyển động được cả 2 chiều, mỗi chiều ít nhất được 2 vòng Nếu đang vặn mà thấy bị kẹt thì phải dừng lại và quay theo chiều ngược lại Tuyệt đối không dùng sức mạnh để vặn tiếp vì sẽ làm hỏng bộ phận này Trong trường hợp đó, phải dùng ốc sơ cấp để nâng hay hạ mâm kính cho phù hợp rồi mới điều chỉnh ốc vi cấp cho rõ nét

- Ảnh thấy trong KHV luôn ngược chiều với vật quan sát Vì vậy, để cho hình ảnh trong kính thuận chiều, dễ quan sát thì khi đặt tiêu bản lên bàn mang vật phải để tiêu bản ngược chiều muốn xem, khi di chuyển tiêu bản cũng phải di chuyển theo hướng ngược chiều mình mong muốn

- Nên mở cả 2 mắt khi quan sát Mắt trái nhìn vào kính, mắt phải nhìn vào giấy vẽ đặt bên phải kính (ngược lại nếu thuận tay trái) Như vậy vừa

có thể quan sát vừa vẽ mà không cần di chuyển thân mình

- Ở độ phóng đại càng lớn thì cần ánh sáng càng nhiều

- SV cần kiên nhẫn, tự điều chỉnh mẫu để xem, tránh làm vỡ lame

Không được tự ý mở tháo kính, bật tắt làm cháy bóng đèn Sau mỗi buổi học phải lau kính sạch sẽ, tắt điện, sắp xếp KHV ngay ngắn

2 THỰC HÀNH

2.1 Quan sát dưới KHV tìm ảnh thực

- Dùng bút lông viết lên miềng lame các chữ có kính thước ≤ 1mm: A

B C D E F G

- Đặt lame có chữ lên KHV Quan sát ảnh dưới vật kính x4 và x10

- Tìm ảnh thực qua KHV

2.2 Quan sát tế bào vảy hành tây

- Vật liệu: củ hành tây

- Hóa chất: dung dịch lugol (I2 trong KI)

- Thực hành:

 Dùng dao lam rạch 1 ô vuông cạnh 1/2cm ở mặt trong vảy củ hành tây còn tươi Dùng kim mũi giáo lột nhẹ một lớp mỏng biểu bì rồi cho vào

giọt nước sẵn trên lame Đậy lamelle lại bằng cách nghiêng 45o, hạ từ từ xuống để tránh bọt khí có trong kính

 Quan sát ở vật kính nhỏ các tế bào dài, vách mỏng Chuyển sang vật kính lớn hơn nhận diện màng tế bào, tế bào chất và nhân

 Dùng lại miếng biểu bì trên, hoặc bóc 1 miếng biểu bì củ hành khác Cho vào 1 giọt dung dịch lugol Các thành phần của tế bào được quan sát rõ hơn Vẽ hình

BÀI 2: CẤU TRÚC TẾ BÀO

1 NGUYÊN TẮC:

Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của đa số sinh vật (trừ những dạng sống tiền tế bào như virus) Những sinh vật đơn bào như vi khuẩn,

cơ thể chỉ gồm 1 tế bào Các sinh vật đa bào cấu tạo từ nhiều tế bào; ví dụ con người gồm khoảng 1014 tế bào

Trong bài thực tập này, chúng ta sẽ làm quen với các đối tượng thường được dùng trong nghiên cứu và có thể ứng dụng trong sinh học phân tử và công nghệ sinh học Để tiện cho việc tìm hiểu, trước hết chúng ta quan sát các tế bào Eukaryote Đây là những tế bào có kích thước lớn nên dễ quan sát Sau đó, ta sẽ tìm hiểu các tế bào Prokaryote để nhận thấy sự khác biệt căn bản giữa hai loại tế bào này

a Tảo Nannochloropsis: thuộc ngành tảo lục (Chlorophyta), một sinh

vật đơn bào, nhân chuẩn Mỗi một tế bào chứa một lục lạp Tế bào phân chia thành 2, 4, 8 hay 16 chúng tập hợp thành từng nhóm trong một vách chung

b Sự chuyển động của dòng nguyên sinh chất trong tế bào lá rong

Elodea: Nguyên sinh chất trong tế bào luân chuyển để giúp việc chuyên

chở các chất hòa tan được mau lẹ hơn, tạo thành dòng nguyên sinh

c Tế bào xoang miệng thuộc biểu mô phủ, bao phủ mặt trong xoang miệng

d Vi khuẩn Bacillus subtilis: là Prokaryote, hình que di động Có kích thước 2.5 x 1.5um B subtilis là một trong những đối tượng được dùng để

nghiên cứu biến nạp

2 VẬT LIỆU – HÓA CHẤT

- Vật liệu: Tảo Nannochloropsis, rong Elodea

- Hóa chất: dung dịch lugol

3 THỰC HÀNH:

3.1 Tảo Nannochloropsis:

Cách lấy mẫu tế bào tảo để quan sát: Lắc đều dịch môi trường, dùng que cấy vòng lấy dịch tảo cho dịch lên lame, đậy lamelle

Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40X

3.2 Sự chuyển động của dòng nguyên sinh chất trong tế bào lá rong

Elodea:

Đặt một lá rong Elodea đã được phơi nắng trong 1 giọt nước trên

lame Quan sát dưới KHV tìm các tế bào có chứa nhiều hạt lục lạp màu xanh lục, hình bầu dục, đang tạo thành một dòng chuyển động chậm

3.3 Tế bào xoang miệng:

Dùng đầu tăm cạo nhẹ mặt trong xoang miệng phết lên lame có để sẵn

1 giọt lugol Đậy lamelle quan sát dưới KHV Vẽ hình các tế bào xoang miệng là những tế bào lát đơn, dẹt, có nhân

BÀI 3: SỰ THẨM THẤU

1 NGUYÊN TẮC:

Sự di chuyển của nước qua màng thấm chọn lọc từ chỗ có nồng độ chất thấp hơn đến chỗ có nồng độ chất cao hơn gọi là sự thẩm thấu

Khi tế bào được đặt trong dung dịch ưu trương, không bào chứa dịch

tế bào là dung dịch nhược trương sẽ bị mất nước nên co lại, màng tế bào tách khỏi vách, ta có hiện tượng co nguyên sinh

Nếu đặt tế bào này lại trong dung dịch nhược trương, nước sẽ di chuyển vào tế bào làm tế bào chất diễn ra, không bào to dần, ta có hiện tượng hồi nguyên sinh Nước tiếp tục vào không bào làm áp suất thẩm thấu của không bào tăng lên, màng tế bào trở nên căng cứng, tạo thành hiện tượng tế bào trương nước

Đối với nhiều loại tế bào khác không có vách như tế bào hồng cầu cho nước, đường và anion thấm qua nhưng ít thấm với cation Chất điện phân (chủ yếu là NaCl) là nguyên nhân chủ yếu tạo ra áp suất thẩm thấu (P) trong hồng cầu P của huyết tương và P của hồng cầu tương quan cân bằng nhau Chính vì vậy khi pha chế dung dịch sinh lý cần đảm bảo P của dung dịch sinh lý bằng P trong hồng cầu biết nồng độ của chất điện giải trong huyết tương là 0.9%

- Trong dung dịch ưu trương, một phần nước trong hồng cầu đi qua màng tế bào ra ngoài, do đó hồng cầu co lại

- Trong dung dịch đẳng trương, hồng cầu được bảo toàn hình dạng

và số lượng (dung dịch sinh lý 0.9% NaCl)

- Trong dung dịch nhược trương, các hồng cầu sẽ thay đổi kích thước vì nước từ dung dịch vào hồng cầu làm hồng cầu phồng lên Nếu:

+ Trong dung dịch ít nhược trương thì tất cả hồng cầu phồng lên nhưng không vỡ

+ Trong dung dịch nhược trương tương đối lớn hơn, hồng cầu phồng lên và một số bị phá hủy làm cho Hemoglobin tan ra và hòa trong dung dịch dẫn đến sự tiêu huyết Trường hợp này là sự tiêu máu không hoàn toàn

2 VẬT LIỆU-HÓA CHẤT:

- Vật liệu: lá lẻ bạn, máu chuột (ếch), củ dền

- Hóa chất: CaCl2, NaCl, NaNO3, KNO3, nước cất

3 THỰC HÀNH:

3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ dung dịch đẳng trương dựa trên sự biến đổi kích thước mô

- Đổ khoảng 10ml các dung dịch CaCl2 có nồng độ khác nhau (0.02M; 0.08M; 0.15M; 0.3M) vào các ống nghiệm và ghi số để tránh nhầm lẫn

- Cắt củ dền thành các đoạn bằng nhau dài 3cm, rộng 1cm, dày 0.5cm Mỗi dung dịch ngâm 3 đoạn mẫu

- Sau 45 phút ngâm mẫu, lấy các mẫu ra và đo lại chiều dài của chúng Xác định nồng độ dung dịch đẳng trương (dung dịch không làm thay đổi kích thước mẫu)

3.2 Thí nghiệm 2: Quan sát cả 2 hiện tượng co và hồi nguyên sinh với tế bào có không bào chứa sắc tố như tế bào biểu bì dưới của lá lẻ bạn

- Dùng dao lam tách một lớp mỏng biểu bì ở mặt dưới (màu tím) lá lẻ bạn Đặt trong 1 giọt nước trên lame, đậy lamelle Quan sát và vẽ hình qua kính hiển vi vài tế bào với không bào có chứa sắc tố màu tím anthocyanin

ở khắp các tế bào

- Đặt miếng biểu bì trên trong một giọt nước muối NaCl 5% Quan sát hiện tượng co nguyên sinh Mô tả, giải thích, vẽ hình

- Thấm ráo nước muối dưới lamelle của miếng biểu bì, thêm một giọt nước vào mép lamelle Quan sát sự hồi nguyên sinh Mô tả, giải thích, vẽ hình

3.3 Thí nghiệm 3: Sự vận chuyển nước qua màng tế bào hồng cầu

- Lấy 6 ống nghiệm đặt trên giá và đánh số thứ tự từ 1 đến 6

- Cho vào từng ống nghiệm nước cất và dung dịch NaCl 1.5% theo đúng chỉ dẫn của bảng sau, ta sẽ pha chế được 6 ống nghiệm có dung dịch NaCl có các nồng độ khác nhau từ cao đến thấp, lắc đều

STT

các ống

nghiệm

Dung dịch

NaCl 1.5% (ml)

Nước cất (ml) Nồng độ dung dịch NaCl thu

được (%) (V = 5ml)

- Dùng ống nhỏ giọt, nhỏ 1 giot máu không có sợi huyết vào các ống nghiệm Lắc các ống nghiệm chứa dung dịch cho đều rồi đặt vào giá theo thứ tự (khoảng 20 giây) Quan sát hiện tượng, ghi nhận kết quả, giải thích

BÀI 4: THÀNH PHẦN HỮU CƠ CỦA TẾ BÀO

1 NGUYÊN TẮC:

1.1 Protide:

1.1.1 Phản ứng Ninhydrin đặc trưng cho các α-acid amin

Tất cả các α-acid amin của protein đều phản ứng với Ninhydrin Ngoài

ra, các protein, peptide, muối amoni và ammoniac cũng tạo thành màu với Ninhydrin Vì vậy muốn nhận biết α-acid amin có trong dung dịch, ta đem thủy phân dung dịch này Dùng dung dịch Ninhydrin để nhận biết

phức hợp màu xanh tím (vàng đối với prolin)

1.1.2 Phản ứng Biuret đặc trưng cho liên kết peptide (-CO-NH-)

Các chất có chứa từ 2 liên kết peptide trở lên (3 acid amin liên kết) đều

có phản ứng Biuret)

Trong môi trường kiềm mạnh, các liên kết peptide phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu Màu của phản ứng phụ thuộc vào lượng

Cu và số lượng các liên kết peptide trong phân tử chất tham gia phản ứng

1.2 Hydratcarbon

1.2.1 Tinh bột

Là polysaccharide tiêu biểu, dự trữ chủ yếu trong thực vật (trong củ, quả, hạt) Thường chiếm tỷ lệ khá cao từ 60 - 80%; cũng tồn tại trong than

lá nhưng chỉ một phần nhỏ Tích tụ trong tế bào thực vật với các hình thái khác nhau như hình cầu, bầu dục, đa giác với kích thước khác nhau từ 0.02 – 0.12mm

- Phản ứng của tinh bột với dung dịch lugol: khi tác dụng với iod, tinh bột cho màu tím xanh đặc trưng

- Nếu thủy giải tinh bột bằng enzyme hoặc acid, màu xanh đặc trưng dần dần biến mất cho đến khi tinh bột bị thủy giải hoàn toàn thành glucose

1.2.2 Cellulose

Là polysaccharide phổ biến nhất trong giới thực vật Nó là thành phần chủ yếu tham gia vào cấu tạo của màng tế bào và thành tế bào thực vật Người ta có thể thủy phân cellulose bởi acid sulfuric đậm đặc tạo thành glucose, hoặc ở mức độ nhẹ thì thu được cellobiose

1.3 Lipid

Trong các hạt có dầu, ngoài protein và tinh bột thì lipid cũng thường được tích tụ nhiều để cung cấp năng lượng cho sự phát triển của phôi thành cây con

Lipid trong tế bào có thể ở nhiều dạng: triglyceride (mỡ, dầu), phospholipid, glycolipid, steroid Dễ quan sát hơn cả là những giọt dầu trong tế bào các loại mô dự trữ ở thực vật

2 VẬT LIỆU - HÓA CHẤT

2.1 Vật liệu:

Khoai tây, đậu xanh, củ carot, đậu phộng đã ngâm nước (hoặc cơm dừa)

2.2 Hóa chất:

-Glycine 0.02%, albumin 1%, NaOH 10%, CuSO4 1%

- Dung dịch hồ tinh bột, dung dịch lugol, HCl đậm đặc, H2SO4 75%

- Soudan III, cồn 20%, glycerin, cồn tuyệt đối

3 THỰC HÀNH

3.1 Protide

Phản ứng Biuret: Lấy 3 ống nghiệm:

- Ống 1 (ống thí nghiệm): 1ml albumin 1% + 1ml NaOH 10% + vài giọt CuSO4 1%

- Ống 2 (ống chứng): 1ml nước cất + 1ml NaOH 10% + vài giọt CuSO4 1%

- Ống 3: 1ml glycine + 1ml NaOH 10% + vài giọt CuSO4 1%

Lắc đều 3 ống nghiệm, quan sát hiện tượng và giải thích

3.2 Hydratcarbon

3.2.1 Tinh bột

- Cạo nhẹ lên miếng khoai tây Cho phần bột vừa cạo vào một giọt nước sẵn trên lame Đậy lamelle Quan sát ở số bội giác nhỏ thấy các hạt tinh bột như các bọt nước chuyển động Chuyển sang số bội giác lớn hơn

để thấy rõ các vân tăng trưởng và tâm Vẽ hình Thực hành như trên với tinh bột hạt đậu xanh

- Cho 1 giọt dung dịch lugol (iod trong KI) lên lame Cho 1 giọt dung dịch hồ tinh bột vào dung dịch lugol  màu tím xanh đặc trưng

- Đun sôi cách thủy ống nghiệm chứa 2 ml hồ tinh bột và 10 giọt HCl đậm đặc Sau mỗi 2 phút thủy giải, lấy 1 giọt dung dịch trong ống thử và nhỏ lên trên 1 giọt lugol đã để sẵn trên lame

Trong lúc thủy giải ta có những màu gì? Kết luận? Để thực hiện sự thủy phân hoàn toàn cần thời gian bao lâu? Mấy lần thử?

3.2.2 Cellulose

Quan sát dưới KHV 1 lát mỏng củ carot trong 1 giọt dung dịch lugol

Vẽ hình vách tế bào tẩm lugol

Dùng giấy thấm hút ráo dung dịch lugol, cẩn thận nhỏ 1 giọt H2SO4 75% vào 1 cạnh của lamelle Để tự acid ngấm vào lát cắt carot Quan sát lại trạng thái vách tế bào Vẽ hình

3.3 Lipid

Emulsion test: Gĩa nhuyễn hạt đậu phộng trong 10 ml cồn tuyệt đối trong cối sạch Sau đó cho qua giấy lọc, thu lấy phần nước (khoảng 5ml) cho vào ống nghiệm Thêm 5ml nước, lắc đều Quan sát và giải thích hiện tượng