Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ đậu tương đen và đánh giá khả năng kháng tế bào ung thư trực tràng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM SÙNG A KHUA Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT POLYPHENOL TỪ ĐẬU TƯƠNG ĐEN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ TRỰC TRÀNG ” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Đại học (Chính quy) Ngành/chun ngành: Cơng nghệ sinh học Lớp: K51-CNSH Khoa: Công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm Khóa học: 2018-2023 Thái Nguyên – 2023 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM SÙNG A KHUA Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT POLYPHENOL TỪ ĐẬU TƯƠNG ĐEN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ TRỰC TRÀNG ” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Đại học (Chính quy) Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: K51-CNSH Khoa: Cơng nghệ sinh học cơng nghệ thực phẩm Khóa học: 2018-2023 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên – 2023 i LỜI CẢM ƠN Được đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, thời gian nghiên cứu đã thực đề tài: “Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ đậu tương đen đánh giá khả ức chế tế bào ung thư trực tràng" Trang của khóa luận em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm đã tận tình bảo, giúp đỡ hướng dẫn em thời gian thực đề tài Cuối cùng,em xin chân thành cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất ln chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian nghiên cứu, cảm ơn các anh chị, em bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ em suốt thời gian qua Lời cuối em xin kính chúc thầy, cô giáo nhà trường, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, bạn đồng nghiệp sức khỏe, thành công sống Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, ngày 30 tháng Năm 2023 Sùng A Khua ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT chữ viết tắt Chữ viết thường g Gam mg Miligam ng Nanogram ml Mililit SRB Sulforohodamine B mm Milimet µg Micogram TPC Hàm lượng phenolic TFC Flavonoid tổng số iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần của đậu tương Bảng 2.2 Thành phần acid amin protein đậu tương Bảng 2.3 Thành phần carbohydrat đậu tương Bảng 2.4 Thành phần carbohydrat đậu tương Bảng 2.5 Thành phần vitamin đậu tương Bảng 2.6 Tình hình sản xuất đậu tương giới (giai đoạn 2008 – 2013) 19 Bảng 2.7 Sản lượng đậu tương Việt Nam (giai đoạn 2010 – 2018) 27 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của loại dung mơi có khả chiết xuất TPC TFC của đậu tương đen 31 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ acetone đến khả chiết xuất TPC TFC của đậu tương đen 32 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu/dung môi số lần chiết đến khả chiết xuất TPC TFC từ đậu tương đen 33 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến chiết xuất TPC TFC từ đậu tương đen 34 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả trích ly TPC TFC của đậu tương đen 35 Bảng 4.6 Khả ức chế tế bào ung thư trực tràng của dịch chiết nước cồn 70% (IC50 (μg/ml) 36 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Giới thiệu natto 11 Hình 2.2 giới thiệu đậu hũ thối 12 Hình 2.3 Giới thiệu tempeh 12 Hình 2.4 cấu trúc của polyphenol 13 Hình 2.5 Flavonoid 13 Hình 2.6 Axit phenlici 14 Hình 3.1: Hạt đậu tương đen 28 Hình 4.1 Hình ảnh dịch chiết polyphenol tổng số aceton nồng độ khác 32 Hình 4.2 Biểu đờ thể tỷ lệ tế bào ung thư HT29 sống sót sau xử lý với từ dịch chiết cồn (A) nước (B) 37 Hình 4.3 Hình thái tế bào ung thư trực tràng HT29 sau thử với mẫu chiết với EtOH 70% 38 v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỤC LỤC v TÓM TẮT BẰNG TIÊNG ANH………………………………………… vi TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu đề tài 1.3 Yêu cầu của đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.4.1.Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩ thực tiễn của đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu đậu tương 2.2 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng của hạt đậu tương 2.2.1 Thành phần hóa học 2.2.2 Giá trị dinh dưỡng 2.2.3 Các công dụng y học của đậu tương 2.2.4 Một số sản phẩm từ đậu tương đen 11 2.3 Giới thiệu chung polyphenol 13 2.3.1 Định nghĩa phân loại của hợp chất polyphenol 13 2.3.2 polyphenol ứng dụng thực phẩm 14 2.4 Phân bố polyphenol thực vật 15 2.4.1 Một số loại thực phẩm giàu polyphenol 15 2.4.2 Tác dụng sinh học của chất polyphenol 16 2.5 Ứng dụng của polyphenol số ngành nông nghiệp 16 vi 2.5.1 chuyển hoá của polyphenol thể người động vật 16 2.5.2 Ứng dụng polyphenol ngành công nghiệp 17 2.6 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 18 2.6.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất đậu tương giới…….……… … 18 2.6.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 26 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 28 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 3.1.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ thực hành 28 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành thí nghiệm 28 3.3 Nội dung nghiên cứu 28 3.4.Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 29 3.4.2 Phương pháp phân tích 29 3.4.3 Phân tích thống kê số liệu…………………………………………… 30 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Xác định được loại dung mơi thích hợp sử dụng cho trích ly polyphenol từ đậu tương đen 31 4.2 Xác định được nờng độ dung mơi thích hợp sử dụng cho trích ly polyphenol từ đậu tương đen 32 4.3: Xác định được tỷ lệ mẫu với dung môi cho hiệu trích ly cao 33 4.4 Xác định được nhiệt độ thời gian trích ly đến khả tách hợp chất 34 4.5 Đánh giá khả kháng tế bào ung thư trực tràng của dịch chiết……….35 PHẦN 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 vii SUMMARY OF RESEARCH RESULTS SUBJECT General information: Project title: "Research to extract polyphenols from black soybean and evaluate the ability to inhibit rectal cancer cells" - Subject leader: SUNG A KHUA - Phone: 0869620914 - Email: Khuaba1234@gmail.com - Lead agency: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry - Coordinating agencies and individuals: Faculty of Biotechnology and Food Technology Objectives of the topic: Extraction of polyphenol compounds from black soybean can be used in functional foods Evaluation of some growth and yield-related criteria of some T3-generation transgenic soybean lines under experimental conditions at the University of Agriculture and Forestry Main content: - Content 1: Determine the suitable solvent to use for the extraction of polyphenols from black soybean - Content 2: Determine the appropriate solvent concentration to use for the extraction of polyphenols from black soybean - Content 3: Determine the ratio of sample to solvent for the highest extraction efficiency - Content 4: Determine the extraction temperature and time to the ability to separate compounds - Content 5: Evaluation of the anti-cancer ability of black soybean extract Soybean nutrition Soybean is recognized as an oilseed that contains a number of useful nutrients including protein, carbohydrates, vitamins and minerals Dried soybean contains 36% protein, 19% oil, 35% carbohydrates (17% of which fiber), 5% minerals and some other ingredients including vitamins Soy protein is one of the least expensive dietary sources of protein, a good substitute for animal protein, and viii their nutritional profile except for the sulfur amino acids (methionine and cysteine) is almost similar to that of animal protein because soybean protein contains most of the essential amino acids required for animal and human nutrition Studies in rats indicate that the biological value of soy protein is similar to that of many animal proteins such as casein if enriched with the sulfurcontaining amino acid methionine On the other hand, soybean oil is another product of soybean processing that is used in many industrial applications Soybean oil contains approximately 15.65% saturated fatty acids, 22.78% monounsaturated fatty acids, and 57.74% polyunsaturated fatty acids (7% linolenic acid and 54% linoleic acid) Furthermore, soybean contains several bioactive compounds such as isoflavones among others, which have many beneficial effects on animal and human health Soybean is important for vegetarians and vegans because it is rich in a number of beneficial nutrients In addition, it can be processed into another fermented and non-fermented soybean food Asians consume about 20 – 80 g of common soy foods daily in a variety of forms including soybean sprouts, toasted soybean protein powder, soy milk, tofu and many others Fermented soybean food products that are also consumed include tempeh, miso, natto, soybean paste and soy sauce among others This daily intake of soybeans is equivalent to 25 and 100 mg of total isoflavones and to 50 g of soy protein Westerners on the other hand consume only about 1-3 g of soy foods daily mainly soy drinks, breakfast cereals and soy burgers among other forms of processed soy foods Efficiency and applicability Create products that are safe, secure and highly effective for users increase product commercialization 28 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Nguyên liệu: Hạt đậu tương đen Hình 3.1: Hạt đậu tương đen - Tế bào ung thư trực tràng HT29 được cung cấp đánh giá phịng thí nghiệm của giáo sư Michael Hsiao, trung tâm nghiên cứu hệ gen Sinica, Đài Loan 3.1.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ thực hành - Thiết bị: tủ ủ, tủ lạnh, tủ sấy - Dụng cụ: Bình định mức, bình tam giác, cân phân tích, đĩa peptri, cân điện tử, cồn khử trùng, túi đựng, nước, ống đong, cốc đong, giấy lọc 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành thí nghiệm Địa điểm: Phịng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thời gian tiến hành: 01/202023 – 6/2023 3.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xác định được loại dung mơi thích hợp sử dụng cho trích ly polyphenol từ đậu tương đen - Nội dung 2: Xác định được nồng độ dung mơi thích hợp sử dụng cho trích ly polyphenol từ đậu tương đen 29 - Nội dung 3: Xác định được tỷ lệ mẫu với dung môi cho hiệu trích ly cao - Nội dung 4: Xác định được nhiệt độ thời gian trích ly đến khả tách hợp chất - Nội dung 5: Đánh giá khả kháng tế bào ung thư trực tràng của dịch chiết từ đậu tương đen 3.4.Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Bố trí thí nghiệm Nghiên cứu loại dung mơi ảnh hưởng TPC, TFC hoạt tính chống oxy hóa được thực với ba loại dung mơi methanol, acetone ethanol (70%, v/v) Nghiên cứu của nờng độ dung mơi TPC, TFC hoạt tính chống oxy hóa được thực với nờng độ của dung môi tương ứng 40, 50, 60, 70, 80 90 (%, v/v) Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành dung môi (01:04, 01:06, 01:08 01:10) số chu kỳ trích ly (2, lần) TPC, TFC hoạt tính chống oxy hóa được thiết kế hình thức thí nghiệm hai yếu tố Tương tự vậy, các tác động của thời gian trích ly (2, giờ) nhiệt độ (30, 40, 50 60oC) TPC, TFC 3.4.2 Phương pháp phân tích Xác định TPC chiết xuất: TPC được ước tính phương pháp Folin-Ciocalteu (Susu Giang et al., 2013) Hàm lượng polyphenol tổng của mẫu được thể qua mg đương lượng acid galic gram chất khô (mg GAE/g) Xác định hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) TFC được xác định phương pháp đo màu mô tả của Ozsoy et al (2008) Các kết được thể qua mg đương lượng quercetin (QE) g chất khô mẫu phân tích (mg QE/g) Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của hóa chất có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ đậu nành được đánh giá cách đo hoạt tính trung hịa gốc tự thơng 30 qua phản ứng màu tím của dung dịch 1,1–diphenyl–2– picrylhydrazyl (DPPH) methanol Khảo nghiệm quang phổ sử dụng gốc tự DPPH ổn định thuốc thử đã được mô tả Anshu et al (2011) Xác định khả ức chế sinh trưởng tế bào ung thư Tế bào dòng ung thư đại trực tràng HT29 được nuôi với mật độ 4.000 tế bào/ giếng thử của khay 96 giếng (Hãng Corning) môi trường nuôi cấy tế bào Mccoy’s 5A có bổ sung 10% huyết bị, 1% kháng sinh penicilin/streptomycin Ủ 24 tiếng tủ nuôi với điều kiện % CO2, 37oC Sau 24 tiếng, tế bào ung thư được ủ với thuốc thử với nồng độ khác từ 125 µg/ml đến 2.000 µg/ml 24 tiếng, 48 tiếng 72 tiếng sau thêm thuốc Tế bào được thu thời điểm thử nghiệm, sau được cố định với 10% acid trichloroacetic (TCA, Sigma, cat SI-T6399-250G) qua đêm 4oC, đổ bỏ dung dịch cố định, rửa nước máy lần, để khơ nhiệt độ phịng 100 µl dung dịch nhuộm chất nhuộm màu sulforhodamine B (SRB, Sigma, cat S1402) được thêm vào giếng, ủ tiếng nhiệt độ phòng Rửa dung dịch nhuộm acid acetic 1% (J.T baker, cat JT-9508-03) 3-4 lần Để khơ nhiệt độ phịng Chất nhuộm SRB được hồ tan hồn tồn 200 µl dung dịch Trisbase 10 mM (Amresco, cat.CPT-0826), đo giá trị OD bước sóng 510 nm máy đo khay nhiều giếng (Infinite 200 PRO) 3.4.3 Phân tích thống kê số liệu Tất kết thực nghiệm được phân tích phần mềm Statgraphics Centurion (Phiên 15.2.11.0) Mỗi khảo nghiệm đã được thực ba lần Phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) với kiểm định LSD được sử dụng để xác định khác biệt ý nghĩa (p 80% tháp 2000 1575 788,3 > 2000 1640 915,7 Mẫu Dịch chiết từ cờn 70% Dịch chiết nước 37 Hình 4.2 Biểu đồ thể tỷ lệ tế bào ung thư HT29 sống sót sau xử lý với từ dịch chiết cồn (A) nước (B) 38 Hình 4.3 Hình thái tế bào ung thư trực tràng HT29 sau thử với mẫu chiết với EtOH 70% Dòng tế bào HT29 bình thường mọc thành cụm/đảo, với nhiều tế bào nhỏ đảo (hình 4.2, đối chứng) Sau thử mẫu, với nồng độ 500 𝜇g/ml khơng ảnh hưởng nhiều đến số lượng hình thái tế bào Khi mẫu thử có nờng độ 1000 𝜇g/ml, làm giảm số lượng tế bào tăng sinh, gây chết tế bào Kích thước của các đảo nhỏ với số lượng tế bào đảo Với các đảo khơng nhìn rõ tế bào, tế bào quá trình chết (Hình 4.2) 39 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ các kết nghiên cứu rút kết luận sau: - Xác định được nhiệt độ trích ly polyphenol : 60°C - Xác định được nồng độ của acetone là: 90% - Xác định được yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly của hợp chất polyphenol từ đậu tương đen - Xác định được nồng độ dung mơi trích ly là: cờn 70% - Xác định được tỷ lệ mẫu: dung mơi: 1/10 (g/ml),thí nghiệm được tiến hành lần lặp lại - Xác định được nồng độ của acetone là: 70% - Xác định được nhiệt độ trích ly cao là: 60°C - Xác định được thời gian trích ly cao là: 4h - Dịch chiết polyphenol từ đậu tương đen có khả ức chế tế bào ung thư trực tràng HT29 nồng độ 1000 𝜇g/ml sau 72 xử lý 5.2 kiến nghị Do thời gian thực có hạn nên đưa số kiến nghị sau: Trong thời gian thực đề tài điều kiện phịng thí nghiệm khơng đủ máy móc thiết bị tiến hành thí nghiệm tơi có số đề nghị sau: - Nghiên cứu sâu các yếu tố ảnh hưởng tới trình tách chiết hợp chất polyphenol hạt đậu tương đen - Tiến hành đánh giá thêm số hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư khác ung thư gan, dày, 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Huỳnh Thị Ái Chi (2010), Nghiên cứu đề xuất sản xuất sữa từ đậu nành nảy mầm Trần Văn Điền(2007), Giáo trình đậu tương, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Đỗ Tất Lợi(2004) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà Xuất Y học Lại Việt Thắng (2009), Nghiên cứu quy trình cơng nghệ thu nhận bột đậu tương nảy mầm giàu isoflavones, khóa luận tốt nghiệp, khoa Cơng nghệ sinh học, Đại học mỏ Hà Nội Phan Hữu Hãn, Ngô Văn Giáo, Nguyễn Đăng Khoa (1984), Kỹ thuật trồng chế biến đậu nành Phạm Văn Thiều ( 1996), Cây đậu tương – kỹ thuật trồng chế biến số sản phẩm, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Thành Đạt (2004), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Sư phạm Nguyễn Văn Bá (2005), Giáo trình mơn nấm học Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh, Vi sinh vật Công nghiệp, NXB Đại học Quốc Gia TPHCM 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học NXB Giáo dục, năm 1998 11 TCVN 3215 – 79, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215:1979 sản phẩm thực phẩm – phân tích cảm quan- phương pháp cho điểm Ủy ban Khoa học Kỹ thuật Nhà nước ban hành 12 TCVN 4295 – 86, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4295: 1986 đậu hạt – phương pháp thử Ủy ban Khoa học Kỹ thuật Nhà nước ban hành 41 13 Hà Thị Thanh Bình (2006), “Nghiên cứu số đặc điểm hoả học tác dụng sinh học của hợp chất polyphenol chè Tân Cương (Thái Nguyên) Xuân Mai (Hà Nội)”, Luận án tiến sĩ sinh học 14 Lý Ngọc Tâm (2002), “Nghiên cứu quy trình cơng nghệ tách chiết hợp chất từ phế thải chè, rau nhằm ứng dụng thực phẩm”, báo cáo tổng hợp kết đề tài cấp bộ, Viện Công Nghiệp thực phẩm Hà Nội II Tài liệu nước tiếng anh 15 Claudine Manach, Augustin Scalbert, Christine Morand, Christian Rémésy and Liliana Jiménez (2004), "Polyphenols: food sources and bioavailability".American Journal of Clinical Nutrition, 79(5), 727-747 16 Jeremy P E Spencer (2003), "Metabolism of Tea Flavonoids in the Gastrointestinal Tract", The American Society for Nutritional Sciences J Nutr., 133,32553261 17 Scalbert A, Williamson G (2000), "Dietary intake and bioavailability of polyphenols", J Nutr., 130, 2073S-2085 18 Tu Youying (2004), "Functional food ingredients from tea and other plant sources", Food Ingredients Asia-China 19 Chien HL, Huang HY, Chou CC Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentation of soymilk with lactic acid bacteria and bifidobacteria Food Microbiol 2006;23(8):772‐778 doi:10.1016/j.fm.2006.01.002 20 Hachmeister KA, Fung DY Tempeh: a mold-modified indigenous fermented food made from soybeans and/or cereal grains Crit Rev Microbiol 1993;19(3):137‐188 doi:10.3109/10408419309113527 21 A Special Report on The History of Traditional Fermented Soyfoods A Chapter from the Unpublished Manuscript, History of Soybeans and Soyfoods: 1100 B.C to the 1980s by William Shurtleff and Akiko Aoyagi 42 PHẦN PHỤ LỤC XÁC NHẬN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái nguyên, ngày… tháng … năm 2023 Người nhận xét phản biện (chữ ký ghi rõ họ tên) Người hướng dẫn (chữ ký ghi rõ họ tên)