Nuôi cấy tế bào và tái tạo mô sẹo từ huyền phủ tế bào cây thông đỏ himalaya

Nuôi cấy tế bào và tái tạo mô sẹo từ huyền phủ tế bào cây thông đỏ himalaya

NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ TÁI TẠO MÔ SẸO TỪ HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY THÔNG ĐỎ

HYMALAYA (THÔNG ĐỎ LÂM ĐỒNG) (Taxus wallichiana Zucc.)

Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn Khiêm, Phan Xuân Huyên

Phân viện sinh học tại Đà lạt

TÓM TẮT

Thông đỏ Taxus wallichiana là loài cây trong vỏ có chứa nhiều Taxol, được dùng để chữa ung

thư buồng trứng và ung thư vú Đây cũng là loài thực vật rất khó nuôi trồng Trong nghiên cứu này,

chúng tôi thiết lập điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo T wallichiana Điều kiện tốt để

khởi tạo huyền phù tế bào là môi trường B5 cơ bản có bổ sung 20% nước dừa tươi, 60 g/L sucrose,

4 mg/L 2,4-D và 1mg/L kinetin Tuy nhiên, môi trường này không thích hợp cho sự tăng trưởng mô sẹo Tế bào nuôi cấy tăng trưởng tốt trong 24 ngày khảo sát, trong đó tám ngày đầu là giai đoạn phát triển chậm (phase lag) Chúng tôi thu tế bào từ huyền phù nuôi cấy vào nhiều thời điểm và trải lên các môi trường thạch khác nhau để khảo sát sự hình thành mô sẹo Mô sẹo tái tạo tốt nhất là từ huyền phù 25 ngày trải lên môi trường thạch B5 cơ bản có bổ sung 4 mg/L 2,4-D, 1 mg/L kinetin,

20 g/L sucrose và nuôi cấy trong điều kiện tối Tế bào và mô sẹo thu được từ nghiên cứu này là nguyên liệu cho nuôi cấy trên quy mô lớn, đồng thời phục vụ việc tách chiết và định lượng taxoid

Từ khóa: Mô sẹo, huyền phù tế bào, Taxol, Taxus wallichiana Zucc

TỔNG QUAN

Thông đỏ (Taxus) là một chi gồm nhiều loài

phân bố ở các vùng ôn đới của bắc bán cầu Trong

những thập niên gần đây, thông đỏ được coi là một

nguồn dược liệu quan trọng sau việc khám phá một

hợp chất diterpene amide chống ung thư mới với tên

thương mại là “Taxol” từ vỏ cây thông đỏ Thái Bình

Dương (Taxus brevifolia) (Wani et al., 1971;

Edgington 1991) Hợp chất này còn được gọi là

paclitaxel, hay tên đầy đủ theo IUPAC (Liên đoàn

hóa học thuần túy và ứng dụng quốc tế) là

5-α-20-

epoxy-1,2-α-4,7-β-10-β-13-α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4,10-diacetate-2-benzoate-13-ester Taxol

đã được Cục quản lý thực phẩm & dược phẩm Hoa

Kỳ (FDA) chứng nhận khả năng chữa ung thư buồng

trứng và ung thư vú; ngoài ra, hợp chất này còn có

khả năng chống các khối u ác tính, ung thư phổi và

một số dạng khối u rắn khác (Wickremesinhe và

Arteca, 1993, 1994) Taxol cũng đã được tách chiết

từ nhiều bộ phận của nhiều loài thông đỏ khác nhau

bao gồm hạt phấn, hạt, lá, thân non, thân gỗ, vỏ và rễ

(Wani et al., 1971; Witherup et al., 1990; Vidensek

et al., 1990; Fett-Neto et al., 1992; Wickremesinhe

và Arteca, 1994) Nguồn cung cấp Taxol cho nhu

cầu chữa trị phụ thuộc phần lớn vào cây thông đỏ,

gần 7 tấn vỏ cây mới sản xuất được 1 kg Taxol

(Cragg et al., 1993) Vì thông đỏ tăng trưởng rất

chập và thời gian ngủ của hạt kéo dài từ 1,5 đến 2

năm (Steinfeld, 1992) nên việc tìm kiếm các nguồn nguyên liệu để tách chiết Taxol khác ngoài vỏ cây là

điều rất cần thiết Nuôi cấy mô Taxus spp được coi

như một cách tiếp cận rất khả quan trong việc cung cấp nguồn nguyên liệu quý này vì nó có thể tạo ra một lượng lớn cây trong thời gian ngắn ở điều kiện

có thể kiểm soát được

Tuleke (1959) là một trong những nhà khoa học

tiên phong trong nuôi cấy in vitro giao tử thể và hạt phấn Taxus mặc dù con người vẫn chưa biết đến

Taxol vào thời điểm đó Nhiều nghiên cứu vi nhân

giống Taxus spp khác đã được thực hiện rộng rãi như các nghiên cứu sự nảy mầm của phôi T baccata,

đặc biệt chú trọng đến việc khảo sát sự ngủ của hạt (Lepage-Degivry, 1973; Lepage-Degivry và Garello, 1973), các phương pháp nuôi cấy phôi để giảm thời

gian ngủ của hạt T brevifolia (Flores và Sgrignoli,

1991; Chee, 1994), và phương pháp nuôi cấy đoạn

cắt thân để tạo cây con T brevifolia (Eccher, 1988;

Chee 1994) Đã có nhiều báo cáo về các phương

pháp sản xuất Taxol từ mô Taxus spp trong nuôi cấy

mô sẹo và huyền phù tế bào (Fett-Neto et al., 1992;

Wickremesinhe và Arteca, 1994) Để tăng hàm lượng các hợp chất thứ cấp, các nhà khoa học cũng nghiên cứu việc bổ sung các hợp chất kích thích

(elicitor) (Christen et al., 1991; Zhong et al., 1995)

hay các tiền chất của paclitaxel như kalium acetate, mevalonolactone, glucose, leucine và phenylalanine

(Strobel et al., 1992; Fett-Neto et al., 1994; Shuler et

al., 1994) vào môi trường Phương pháp nuôi cấy

lỏng đã cho thấy nhiều ưu thế vượt trội trong việc

thu nhận tế bào so với phương pháp nuôi cấy trên

môi trường thạch truyền thống vì nó cho phép việc

tối ưu hóa tốc độ tăng trưởng, cho phép thu nhận tế

bào bằng cách lọc, và quan trọng là tế bào trong nuôi

cấy lỏng vẫn giữ được khả năng phát triển thành mô

sẹo (Phillips et al., 1996) Nuôi cấy tế bào trong các

bình phản ứng sinh học (bioreactor) cũng đã được

thực hiện để thu một lượng lớn sinh khối và Taxol

(Park et al., 1994; Yoon và Park, 1994)

Loài thông đỏ T wallichiana đã được CITES

(Công ước quốc tế về buôn bán các loài động thực

vật nguy cấp) coi là mộ loài đang nguy cấp Loài cây

này có hàm lượng cao các taxoid (0.01–0.02%) và

10-deacetyl baccatin III trong vỏ và lá (Nhut et al.,

chưa công bố) Người ta dự đoán rằng loài thông đỏ

này sẽ hoàn toàn biến mất khỏi thiên nhiên trong vài

thấp niên tới do sự khai thác ngoài tầm kiểm soát

Taxol và gỗ; sự nguy cấp đối với loài này còn có

nguyên nhân từ bản chất đơn tính và thời gian ngủ kéo

dài của chồi Nguyễn Thị Thanh Hiền et al (2005) đã

tạo mô sẹo thành công từ thân non và chồi của T

wallichiana Tuy nhiên, các loại nguyên liệu khác như

huyền phù tế bào và mô sẹo tái tạo vẫn có thể được

thu nhận để góp phần bảo tồn loài và tách chiết Taxol

Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu về việc thiết

lập quy trình sản xuất lượng lớn sinh khối Taxus ở

dạng mô sẹo và huyền phù tế bào nhằm phục vụ cho

các nghiên cứu tương lại về tách chiết và định tính

taxoid, đồng thời góp phần bảo tồn loài T

wallichinana đang trong tình trạng nguy cấp Bài báo

mô tả chi tiết điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo

mô sẹo từ huyền phù

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguồn mẫu thực vật

Để tạo mô sẹo, chúng tôi nuôi cấy các đoạn cắt

từ chồi 14 đến 25 ngày tuổi của cây Taxus wallichiana trồng tại Phân viện sinh học tại Đà Lạt

(Đà Lạt, Lâm Đồng) Môi trường nuôi cấy được ký

hiệu là C3, là môi trường B5 cơ bản (Gamborg et al.,

1968) có bổ sung 4 mg/L 2,4-D (acid 2,4-dichlorophenoxyacetic) và 1 mg/L kinetin Mô sẹo tạo thành được tiếp tục duy trì trên cùng môi trường dưới ánh sáng cường độ 45 μmol/m2/s (12 giờ chiếu sáng/ngày) và sử dụng làm mẫu cấy tiếp theo

Môi trường và điều kiện thí nghiệm

Môi trường với các thành phần khoáng và vitamin B5 được dùng làm môi trường cơ bản cho tất

cả các thí nghiệm Ảnh hưởng của 2,4-d, kinetin, nước dừa tươi và sucrose được khảo sát bằng cách

bổ sung các thành phần này vào môi trường với các nồng độ khác nhau (Bảng 1) Môi trường được làm rắn với 9 g/L thạch (Agar Hải Phòng) Chúng tôi dùng bình nuôi cấy 250 mL (40 mL môi trường/bình) để tạo mô sẹo, bình tam giác Erlenmeyer 250 mL (60 mL môi trường/bình) để nuôi cấy huyền phù, và bình 500 mL để tái tạo mô sẹo Môi trường được điều chỉnh pH 5,8–5,9 trước khi hấp khử trùng ở 121oC, 1 atmtrong 30–40 phút

Bảng 1 Thành phần của các môi trường thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trong phòng nuôi

cấy, 25 ± 2oC, độ ẩm tương đối 80%, cường độ sáng

45 μmol/m2

/s (12 giờ/ngày) Các mẫu nuôi cấy trong

tối cũng có cùng điều kiện nhiệt độ và độ ẩm

Các mảnh mô sẹo được lắc trong bình 250 mL

trên máy lắc SO1 (Stuart Scientific, Anh) với tốc độ

110 vòng/phút Đèn ống huỳnh quang trắng (Rạng

Đông) được dùng cho các thí nghiệm có chiếu sáng

Thiết kế thí nghiệm Nước dừa đối với tăng trưởng mô sẹo

Các mô sẹo xanh trên môi trường C3 được chuyển sang môi trường đặc C3 và C3∙CW có 20 g/L sucrose Lượng mô sẹo ban đầu là 7.25 mg/mL môi trường Sau 5 tuần, trọng lượng tươi và khô cùng

hình thái mô sẹo được ghi nhận Thí nghiệm được

lặp lại ba lần

Một số yếu tố tác động đến việc khởi tạo huyền phù

Chúng tôi khảo sát các yếu tố như: nguồn mô

sẹo (nuôi cấy trong tối và sáng); nồng độ 2,4-D và

kinetin; nước dừa; điều kiện sáng (trong tối hoàn

toàn và cường độ sáng 45 mol/m2

/s; nồng độ sucrose (20–80 g/L) Lượng mô sẹo ban đầu là 2,30

g Các thí nghiệm được lặp lại 4 lần Mật độ tế bào

được ghi nhận sau hai đến ba tuần nuôi cấy

Tăng trưởng huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào được chuyển sang môi trường

mới (50% thể tích) Mật độ và trọng lượng tươi tế

bào trong huyền phù được ghi nhận 4 ngày/lần trong

24 ngày Thí nghiệm được lặp lại ba lần

Tái tạo mô sẹo từ huyền phù

Môi trường thạch bổ sung 2,4-D và kinetin được

dùng để trải 2 mL huyền phù tế bào Sự tái tạo mô

sẹo được ghi nhận sau 1, 2, 3, và 4 tháng Mỗi

nghiệm thức được tiến hành với 30 bình nuôi cấy

Đo sinh khối

Trọng lượng tươi và khô của mô sẹo và tế bào

huyền phù thu bằng cách lọc qua giấy lọc được đo

bằng cân phân tích (Sartorius, Đức)

Để tính mật độ tế bào, chúng tôi trải 10 µL

huyền phù tế bào lên một lamelle úp ngược trên một

lame kính lõm Số lượng tế bào được đếm với một

buồng đếm dưới kính hiển vi (Olympus, Hoa Kỳ)

với độ phóng đại 10 X

Phân tích số liệu

Số liệu được phân tích bằng phương pháp kiểm tra Duncan (Duncan, 1995)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nước dừa đối với tăng trưởng mô sẹo

Mô sẹo T wallichiana tăng trưởng tốt trên các

môi trường không có nước dừa, trong đó môi trường C3 trong tối là điều kiện tối ưu, cho các mô sẹo mềm

và màu trắng ngà (Hình 1) Trong môi trường có nước dừa (C3∙CW medium), một ít mô sẹo chuyển sang màu nâu rồi chết dần (Bảng 2) Tỷ lệ mô sẹo hóa nâu là 7.45% dưới điều kiện sáng và 3.88% trong tối Mô sẹo trong tối tăng trưởng tốt hơn mô sẹo dưới điều kiện sáng do tác động ức chế của ánh

sáng đối với mô sẹo (Gibson et al., 1993) Ảnh

hưởng của nước dừa đối với sự tăng trưởng và phát

triển in vitro của thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi nhưng riêng cho đối với nuôi cấy Taxus và tách

chiết Taxol thì vẫn chưa có nhiều công trình Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy nước dừa ở nồng độ

20% là không phù hợp cho sự tăng trưởng mô sẹo T wallichiana cho dù nước dừa có tác động tốt đến

nhiều loài khác

Ảnh hưởng của nguồn mô sẹo, ánh sáng, nồng độ sucrose đối với sự hình thành huyền phù

Huyền phù từ nguồn mô sẹo sinh trưởng trong tối sẽ cho màu đỏ đặc trưng, trong khi mô sẹo dưới ánh sáng sẽ tạo ra huyền phù có màu hơi vàng Huyền phù tăng trưởng chậm hơn khi mật độ tế bào ban đầu thấp hơn do khả năng phân chia thấp (Torres, 1989) Trong nghiên cứu của chúng tôi, mô sẹo nuôi cấy trong bong tối bở xốp hơn so với mô sẹo dưới điều kiện sáng, do đó chúng dễ dàng hình thành các tế bào đơn và cụm tế bào hơn nếu được chuyển qua nuôi cấy lỏng lắc (Bảng 3)

Bảng 2 Ảnh hưởng của nước dừa và ánh sáng đối với sự tăng trưởng mô sẹo của thông đỏ Lâm Đồng (Taxus

wallichiana Zucc.) sau 6 tuần nuôi cấy

Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD) Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý nghĩa theo Phương pháp kiểm tra Duncan ở mức 5% xác suất

Hình 1 Ảnh hưởng của nước dừa và ánh sáng lên sự tăng trưởng mô sẹo: Trên môi trường C3 dưới điều kiện sáng (a) và tối (c); và trên môi trường C3∙CW dưới điều kiện sáng (b) và tối (d)

Bảng 3 Ảnh hưởng của nguồn mô sẹo đối với sự khởi tạo huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus

wallichiana Zucc.) sau 3 tuần nuôi cấy

Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD) Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý nghĩa theo Phương pháp kiểm tra Duncan ở mức 5% xác suất

Môi trường C3 là môi trường thích hợp nhất cho

sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo, đồng thời cho

sự hình thành huyền phù tế bào T wallichiana (Hình

2, 3) Huyền phù tế bào hình thành tốt nhất trong môi

trường C3∙CW trong điều kiện tối Nước dừa có

chứa zeatin và một số cytokinin khác có tác dụng

thúc đẩy hoạt động phân chia tế bào; nước dừa cũng

có chứa một số acid amine hạn chế khác (Letham, 1974) Tổ chức y tế thế giới (WHO) cũng cho biết trong nước dừa có nhiều protein, carbohydrate, calcium, các hợp chất sắt, đường, và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic Các

chất này có thể đóng vai trò quan trọng trong việc

thúc đẩy hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào

Các thành phần trong nước dừa cũng có thể có tác

động lên sự phân tách các tế bào trong huyền phù;

quan sát dưới kính hiển vi cho thấy trong môi trường

có nước dừa, các cụm gồm 20–30 tế bào hình thành

với tế bào tách rời nhiều hơn so với môi trường

không nước dừa

Ánh sáng có tác dụng ức chế đối với sự hình

thành huyền phù tế bào và mô sẹo (Gibson et al.,

1993) Trong cả hai trường hợp, nuôi cấy trong tối

cho kết quả tốt hơn dưới điều kiện sáng (Bảng 4) với mật độ tế bào và trọng lượng tươi sinh khối cao hơn khoảng 1,5 lần

Huyền phù tế bào hình thành tốt nhất trong môi trường có 60 g/L sucrose (Hình 4) Nồng độ đường cao hơn làm giảm sự tăng trưởng của huyền phù Trong giai đoạn tăng trưởng hàm mũ (phase log), vách tế bào và tinh bột được tổng hợp mạnh bằng nguồn carbon từ môi trường (Stepan-Sarkissian and Grey, 1990); tuy nhiên, đường ở nồng độ cao có thể gây stress thẩm thấu cho tế bào

Hình 2 Ảnh hưởng của môi trường đối với mật độ tế bào huyền phù cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus

wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện sáng Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE)

Hình 3 Ảnh hưởng của môi trường đối với trọng lượng tươi sinh khối huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm

Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng Thanh sai số biểu diễn sai số

chuẩn (SE)

Tế bào/mL

Môi trường

Môi trường Trọng lượng tươi

sinh khối (µg/mL)

Hình 4 Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đối với sự hình thành huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đồng

(Taxus wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE)

Bảng 4 Ảnh hưởng của ánh sáng đối với sự hình thành huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đông (Taxus

wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy

Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD) Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý nghĩa theo Phương pháp kiểm tra Duncan ở mức 5% xác suất

Tăng trưởng huyền phù tế bào

Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào trong bình

nuôi cấy lắc cao hơn rất nhiều so với hệ thống nuôi

cấy lỏng tĩnh (Hình 5, 6) Nuôi cấy lắc thúc đẩy sự

phân chia và tăng trưởng của tế bào trong môi trường

lỏng (Torres, 1989) vì nó làm tăng độ thoáng khí và

giúp chất dinh dưỡng và các thành phần khoáng

phân bố đồng đều trong toàn bộ môi trường Nhờ đó,

tế bào có thể thu nhận được các chất dinh dưỡng và

điều hòa sinh trưởng từ mọi hướng trong môi trường

Phase lag của huyền phù tế bào kéo dài hơn 1

tuần Trong 24 ngày nuôi cấy, huyền phù vẫn chưa

đạt đến phase tăng trưởng ổn định (Hình 5, 6)

Torres (1989) đã công bố kết quả nghiên cứu cho

thấy mật độ tế bào thấp vào lúc đầu có thể dẫn đến

phase lag và phase log kéo dài Trong nghiên cứu của chúng tôi, mật độ tế bào ban đầu 15.610 ± 1.040

tế bào/mL có thể còn tương đối thấp dẫn đến sự kéo dài của hai phase tăng trưởng nói trên

Dưới kính hiển vi, chúng tôi ghi nhận các tế bào đơn và các cụm với vài chục tế bào (Hình 7) Nước dừa có thể có vai trò quan trọng trong việc tách rời tế bào Tuy rất ít nghiên cứu đề cập đến ảnh hưởng của

tỷ lệ auxin/cytokinin đối với sự tách rời của tế bào trong huyền phù, nhưng lượng auxin/cytokinin trong nghiên cứu này là tương đối phù hợp cho sự tách rời

các tế bào trong huyền phù T wallichiana Tình

trạng tách rời của các tế bào cũng tùy thuộc thời điểm Sau khi cấy chuyền, số tế bào đơn trong môi trường rất cao; sau đó nhiều cụm tế bào hình thành

từ ngày thứ 12, có cụm lên đến hàng trăm tế bào

Nồng độ sucrose (g/L)

Mật độ tế bào (tế bào/mL) Trọng lượng tươi sinh khối (µg/mL)

Hình 5 Mật độ tế bào huyền phù cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) trong 24 ngày nuôi cấy

Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE)

Hình 6 Trọng lượng tươi sinh khối huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.)

trong 24 ngày nuôi cấy Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Mật độ tế bào (tế bào/mL)

Nuôi cấy lỏng lắc

Nuôi cấy lỏng tĩnh

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Nuôi cấy lỏng lắc

Nuôi cấy lỏng tĩnh

Trọng lượng tươi sinh khối

(µg/mL)

Tái tạo mô sẹo từ huyền phù

Thí nghiệm tái tạo mô sẹo từ huyền phù được

thực hiện trong tối và sáng; kết quả cho thấy, không

có mô sẹo nào được tái tạo dưới điều kiện chiếu

sáng Những mô sẹo đầu tiên được ghi nhận khoảng

1 tháng sau khi trải tế bào từ huyền phù 25 ngày lên

môi trường C3 rắn trong tối Tế bào lấy từ huyền phù

nuôi cấy được 5 ngày hoặc sớm hơn không tái tạo

được mô sẹo Mẫu huyền phù vào ngày 10 và 20 chỉ

tạo được mô sẹo sau 3 tháng nuôi trên môi trường

C2, C3, và C4 trong tối Rất ít mô sẹo tái tạo trên

môi trường C5 (Hình 8) Từ ngày thứ 12, có thể

huyền phù tế bào đã đi vào phase log và tiền ổn định

Giai đoạn này diễn ra các hoạt động phân chia tế bào

và sinh tổng hợp mạnh Những tế bào này khi được

lấy để trải lên môi trường C3 thì tái tạo mô sẹo tốt và

tăng trưởng mạnh (Bảng 5) Ngược lại, nếu lấy tế

bào từ những ngày trước đó, có thể huyền phù tế bào

còn trong phase lag, sẽ cho kết quả tái tạo mô sẹo

kém và không đồng đều Sự tăng trưởng và phát triển

của mô sẹo được tái tạo cho thấy tình trạng sinh lý

của tế bào ban đầu trong huyền phù, thông tin này sẽ

có ích cho việc quyết định giai đoạn nào là phù hợp

để tách chiết taxoid từ tế bào Trải tế bào từ huyền phù cũng có thể cố định tình trạng trao đổi chất để nhân các dòng tế bào về sau

Sau 3 hoặc 4 tháng nuôi cấy, phần tiếp xúc giữa

mô sẹo và môi trường bắt đầu hóa nâu Đây là kết quả của sự sản sinh các chất polyphenol trong mô sẹo Hiện tượng này cũng được ghi nhận ghi các mô sẹo ban đầu được nuôi cấy trên môi trường rắn Điều này cho thấy trạng thái trao đổi chất của mô sẹo tái tạo cũng tương tự như ở mô sẹo ở các giai đoạn khác trong quy trình Ảnh hưởng ức chế của ánh sáng cũng thể hiện rõ, đặc biệt trong điều kiện chuyển tế bào từ huyền phù sang môi trường rắn

Nghiên cứu này cho thấy tế bào T wallichiana

có thể tăng trưởng tốt trong huyền phù và mô sẹo có thể được tái tạo từ huyền phù bằng một hệ thống nuôi cấy đơn giản Chúng tôi đã thiết lập được quy

trình tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo cho T wallichiana Nguyên liệu tạo ra từ quy trình này có

thể được dùng cho nuôi cấy bioreactor để thu nhận Taxol/taxoid và các dẫn xuất của chúng

Hình 7 Tế bào Taxus wallichiana dưới kính hiển vi a, b: tế bào đơn; c: cụm tế bào Thước = 10 µm

Hình 8 Mô sẹo tái tạo sau 4 tháng trên môi trường rắn: C2 (a), C3 (b), C4 (c), và C5 (d)

Bảng 5 Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lấy mẫu từ huyền phù đối với sự tái tạo mô sẹo cây thông đỏ Lâm

Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) trong điều kiện tối hoàn toàn

Ngày 5

Ngày 15

Ngày 25

Ghi chú: Thời điểm: là thời điểm tế bào huyền phù được lấy để trải lên môi trường rắn Tại thời điểm ghi nhận: không có

mô sẹo (–); có thể thấy mô sẹo (+); mô sẹo có tăng trưởng (++); mô sẹo tăng trưởng tốt (+++); mô sẹo tăng trưởng rất tốt với cụm mô sẹo lớn (++++)

Lời cảm ơn: Các tác giả chân thành cảm ơn Trung

tâm nghiên cứu Châu Á (ĐHQG Hà Nội và Quỹ

nghiên cứu tiên tiến Hàn Quốc) đã tài trợ cho nghiên

cứu này, GS Pierre Debergh và TS Kien Nguyen vì

những ý kiến đóng góp cho bài báo

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chee PP (1994) In vitro culture of zygotic embryos of Taxus species Hort Sci 29(6): 695-697

Christen AA, Gibson DM, Bland J (1991) Production

of taxol or taxol-like compounds with Taxus breviofolia

callus cell culture US Patent US 5019504 (Patent)

Cragg GM, Schepartz SA, Suffness M, Grever MR

(1993) The taxol supply crisis New NCI policies for

handling the large-scale production of novel natural

product anticancer and anti-HIV agents J Nat Prod

56(10): 1657-1668

Duncan DB (1995) Multiple range and multiple F test

Biomet 11: 1-42

Eccher T (1998) Response of cuttings of 16 Taxus cultivars

to rooting treatments Acta Horticult 227: 251-253

Edgington SM (1991) Taxol: out of the woods

Bio/Technol 9(10): 933–938

Fett-Neto AG, DiCosmo F, Reynolds WF, Sakata K

(1992) Cell culture of Taxus as a source of the

antineoplastic drug taxol and related taxanes

Bio/Technol 10: 1572-1575

Fett-Neto AG, Melanson SJ, Nicholson SA, Pennington

JJ, DiCosmo F (1994) Improved taxol yield by aromatic

carboxylic acid and amino acid feeding to cell cultures

of Taxus cuspidata Biotech Bioeng 44: 967-971

Flores H, Sgrignoli PJ (1991) In vitro culture and

precocious germination of Taxus embryos In Vitro Cell

Dev Biol–Plant 27: 139-142

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient

requirements of suspension cultures of soybean root

cells Exp Cell Res 50: 151-158

Gibson DM, Ketchum REB, Christen AA (1993)

Initiation and growth of cell lines of Taxus brevifolia

(Pacific yew) Plant Cell Rep 12(9): 479-482

Hien NTT, Khiem DV, Vu NH, Don NT, Nhut DT

(2005) Primary study on the induction and growth of

callus of Taxus wallichiana Zucc., a valuable medicinal

plant in Lam Dong Province In Tuyen BC, Giang TT,

Mien BV, Hien PP, Hay N, Tri BM, eds Proc

Vietnam-Korea Intl Sym Biotech Bio-system Eng, Ho Chi Minh

City: 191-197

Lepage-Degivry MT (1973) Intervention d’un

inhibiteur lie dans la dormance embryonnaire de Taxus

baccata L CR Acad Sci 277: 177-180

Lepage-Degivry MT, Garello G (1973) La dormance

embryonnaire chez Taxus baccata: Influence de la

composition du milieu liquide sur l’induction de la

germination Physiol Plant 29: 204-207

Letham DS (1974) Regulators of cell division in plant

tissues XX The cytokinins of coconut water Physiol Plant 32: 66-70

Park IS, Kim JH, Youn JH, Byun SY, Kim DI (1994) Effects of sugar concentration on growth and taxol

production in Taxus cuspidata cell cultures In Teo

WK, Yap MGS, Oh SKW, eds Better living through innovative biochemical engineering National University of Singapore, Singapore: 131-133

Phillips GC, Hubstenberger JF, Hansen EE (1996) Plant regeneration by organogenesis of callus and cell suspension cultures In Gamborg OL, Phillips GC, eds

Plant cell, tissue and organ culture - Fundamental methods Narosa Publ House, New Delhi, India: 67-79

Shuler ML, Hirasuna TJ, Moser S (1994) Effects of media manipulation on growth and taxol production in

Taxus sp Abstr Pap Am Chem Soc 207 Meeting, Pt 2,

BTEC 21

Steinfield D (1992) Early lessons from propagating

Pacific yew Rocky Mountain Forest and Range Expt Sta Tech Res Rep: 221

Stepan-Sarkissian G, Grey D (1990) Selection of media

for tissue and cell culture In Pollard JW, Walker JM, eds Methods in molecular biology 6 Plant cell and tissue culture The Humana Press, New Jersey, the

USA: 1-27

Strobel GA, Stierle A, van Kuijk FJGM (1992) Factors

influencing the in vitro production of radiolabeled taxol

by Pacific yew, Taxus brevifolia Plant Sci 84(1): 65-74

Torres KC (1989) Overview of cell suspension culture

In Torres KC, ed Tissue culture techniques for horticultural crops Chapman & Hall Publisher, USA:

151-160

Tuleke W (1959) The pollen cultures of CD Larue: A

tissue from the pollen of Taxus Bull Torrey Bot Club

86: 283-289

Vidensek N, Lim P, Campbell A, Carson C (1990) Taxol content in bark, wood, root, leaf, twig and

seedling from several Taxus species J Nat Prod 53:

1609-1610

Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, McPhail

AT (1971) Plant antitumour agents V1 The isolation

and structure of taxol, a novel antileukemic and

antitumour agent from Taxus brevifolia J Am Chem Soc 93: 2325-2327

Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus

cultures: initiation, growth optimization,