0968 nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục haematococcus pluvialis flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy

VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM VIỆNCÔNGNGHỆSINHHỌC LƯUTHỊTÂM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠOSINHKHỐIGIÀUASTAXANTHINCỦALỒI VI TẢO LỤCHaematococcus pluvialisFLOTOWNHẰMỨNGDỤNGTRONGNIT RỒNGTHỦYSẢN LUẬNÁNTIẾNSĨSINHHỌC HÀNỘI-2017 VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀCƠNGNGHỆVIỆTNAM VIỆNCƠNGNGHỆSINHHỌC LƯUTHỊTÂM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠO SINHKHỐIGIÀU ASTAXANTHIN CỦA LOÀI VI TẢO LỤCHaematococcus pluvialisFLOTOWNHẰM ỨNG DỤNG TRONG NI TRỒNG THỦYSẢN Chun ngành: Hóa sinh họcMãsố: 6242 0116 LUẬNÁNTIẾNSĨSINHHỌC Ngườihướngdẫnkhoahọc: PGS.TS.ĐặngDiễmHồng ViệnCơngnghệsinhhọc LỜI CẢMƠN Đểhồn thành luận ánnày, tôixin đượcgửi lời cảm ơnsâu sắcđến: PGS TS Đặng Diễm Hồng, ngun Trưởng phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Cơngnghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - người thầy địnhhướng, bảo kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ động viên tơi vượt quanhữngtrở ngại khó khăn suốt thờigian thựchiện luận án BanLãnhđạoViệnCơngnghệsinhhọc,phịngthínghiệmTrọngđiểmCơngnghệgen,bộphận đàotạoViệnCơngnghệsinhhọc(ThS.BùiThịHảiHà–phụtráchđàotạo),ViệnHànlâmKhoahọcvàCơngnghệ ViệtNamđãtạođiềukiệnthuậnlợivềcơsởvậtchấtvà giúp tơihồn thành mọithủ tụccầnthiết quátrình làm nghiêncứu Sự giúp đỡ, bảo tận tình chú, anh chị, bạn đồng nghiệp vàđangl m v i ệ c t i p h ị n g C n g n g h ệ T ả o : T S N g ô T h ị H o i T h u , T S H o n g T h ị L a n Anh,T S H o n g T h ị M i n h H i ề n , T h S L ê T h ị T h m , T h S N g u y ễ n C ẩ m H , T h S Đ i n h ĐứcHồng,ThS.BùiĐìnhLãm,ThS.ĐinhThịNgọcMai,ThS.NguyễnThịThuThủy,KTV.Đỗ Thị Là.Nhân dịp này,tơixin chânthành cảm ơntất sựgiúp đỡqbáuđó Luận án thực khuôn khổ đề tài cấp Bộ Nông nghiệp Phát triểnnông thôn “Nghiên cứu công nghệ nuôi vi tảo Haematococcus pluvialis công nghệ chiếtxuấtastaxanthin”2010–2013thuộcĐềánpháttriểnvàứngdụngcơngnghệsinhhọctrong lĩnh vực thủy sản ThS Ngơ Thị Hồi Thu làm chủ nhiệm đề tài cán trẻ cấpViện Cơng nghệ sinh học “Tách dịng gen mã hóa cho tổng hợp astaxanthin - carotenoidhydroxylase (CHY) từ vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin” năm 2016dotơilàmchủnhiệm.XincảmơnƠngVũVăn Cảnh-CơngtyCổphẩnThủyđiệnChuVa,huyệnTamĐường,tỉnhLaiChâuđãgiúpđỡluậnánthựchiệnthínghiệmtrêncáhồinitạiCơngty TơixinchânthànhcámơnThS.VõVănBình- Viện Ni trồng thủy sản đãgiúpđỡthựchiện cácthínghiệm cá KoiNhật Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp - người ln bêncạnh,khuyến khích vàủng hộ tơitrong suốt qtrình thựchiệnluận án HàNội, ngàyt h n g n ă m 2017 Tácgiả Lưu Thị Tâm Lờicamđoan Tơixincamđoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác vớicáccộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đãđược công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phépcủacác đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác.Nếucó gìsai sót tơixin chịuhồn tồn tráchnhiệm./ HàNội,ngày tháng Tácgiả năm2017 LưuThịTâm MỤCLỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………… CHƢƠNGI.TỔNGQUANTÀILIỆU………………………… 1.1 Giớithiệuchung vềastaxanthin………………………………… 1.1.1 Đặcđiểmchung…………………………………………………… 1.1.2 Cấutrúccủaastaxanthin…………………………………………… 1.1.3 Sinhtổnghợp astaxanthin………………………………………… 1.1.4 Cácnguồncungcấp astaxanthin…………………………………… 1.1.5 Sinhhóahọc củaastaxanthin……………………………………… 12 1.1.6 Đặc tính chốngơxy hóa củaastaxanthin…………………………… 12 1.1.7 Ứngdụngcủaastaxanthin………………………………………… 13 1.2 GiớithiệuchungvềchivitảolụcHaematococcus……………… 16 1.2.1 Vị trí phân loại vàphân bố………………………………………… 16 1.2.2 CáclồiHaematococcus………………………………………………… 16 1.2.3 Đặc điểmsinh họcvàđặcđiểmhình thái…………………………… 17 1.2.4 Thành phầnsinhhóa học tảoH.pluvialis………………………… 19 1.2.5 Quytrìnhsảnxuấtastaxanthin ởH pluvialis………………………… 21 1.2.6 CácyếutốảnhhưởngđếnqtrìnhsảnxuấtastaxanthintừH.pluvialis 21 1.3 Tìnhhìnhnghiêncứuvà cơngnghệnitrồngtảoH.pluvialischo sảnxuấtastaxanthin………………………………………………… 22 1.3.1 Nuôicấy quangtựdưỡng…………………………………………… 23 1.3.2 Nuôicấydịdưỡngvàtạpdưỡng…………………………………… 28 1.3.3 Nângcao hiệuquả sảnxuất astaxanthintừH.pluvialis……………… 30 1.4 TháchthứcsảnxuấtastaxanthinthƣơngmạitừtảoH pluvialis 35 1.5 ỨngdụngsinhkhốitảoH.pluvialistrongnuôitrồngthủysản… 36 1.6 Tình hình nghiêncứuvàni trồng tảoH.pluvialisởViệtNam 38 CHƢƠNGII.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 40 2.1 Vật liệu……………………………………………………………… 40 2.1.1 2.1.2 Vậtliệu……………………………………………………………… Các bộkít sinhphẩm……………………………………………… 40 40 2.1.3 Độngvậtthínghiệm………………………………………………… 40 2.1.4 Hóachất…………………………………………………………… 40 2.1.5 Máymócvàthiếtbị……………………………………………… 41 2.1.6 Môitrườngnuôicấy……………………………………………… 42 2.1.7 Địa điểmnghiêncứu……………………………………………… 42 2.2 Phƣơngphápnghiêncứu………………………………………… 42 2.2.1 Các phươngpháp liênquan đếnsànglọc,địnhtênkhoahọc chủngvitảolụcHaematococcussp.HB.…………………………… 2.2.2 42 Cácphươngphápliênquanđếnsinhtrưởng,đặcđiểmsinhhọccủachủngv itảolụcHaematococcussp.HB…………………………… 2.2.3 45 Các phương pháp liênquan đếnsử dụng sinhkhốichủng HBgiàuastaxanthinchocáhồiVân vàcá KoiNhật………………………… 48 2.3 Bốtríthínghiệm…………………………………………………… 49 2.3.1 Nghiêncứusựthayđổihìnhthái,kíchthướccủatếbàotrongvịngđờicủachủn gHaematococcuspluvialisHBởcấpđộbìnhtamgiác250– 1000mLvàbìnhnhựa1,5và10L……………………………….…… 2.3.2 49 Nghiêncứuđiềukiệnnicấytốiưu chosinhtrưởng củachủngHaematococcus pluvialis HB điều kiện phịng thínghiệm………………………………………………………………….50 2.3.3 Nghiêncứuđ i ề u k i ệ n n u ô i t h í c h h ợ p c h o s i n h t r n g c ủ a tảo HaematococcuspluvialisHBđạtMĐTBcao 2.3.4 2.3.5 51 Nghiêncứuđiềukiệnnicấytốiưuchotíchlũyastaxanthinởtảo Haematococcus pluvialisHBtrongpha2 53 Thuhoạch sinhkhốitảo…………………………………………… 55 2.3.6 Sửd ụ n g s i n h k h ố i c h ủ n g v i t ả o l ụ c H a e m a t o c o c c u s p l u v i a l i s H B 2.4 làmthứcăn cho cá KoiNhậtvà cáhồiVân……………………… 56 Xửlýsốliệu………………………………………………………… 57 CHƢƠNGIII.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU……………………… 3.1 58 Sànglọcvà đặcđiể m sinh học c c h ủ n g v i tảotiềmnăng cho sảnxuấtastaxanthin………………………………… 58 3.1.1 Sànglọcchủngvitảotiềmnăng chosảnxuấtastaxanthin……… 3.1.2 Địnht ê n k h o a h ọ c m ứ c đ ộ p h â n t d ự a v o đ ọ c v s o s n h trìnhtựgen18S rRNA…………………………………………… 3.1.3 60 Táchdịngvàphântíchtrìnhtựgenm ã h ó a c h o e n z y m e carote noidhydroxylase (CHY)…………………………………… 3.1.4 58 64 Sự thay đổi hình thái kích thƣớc tế bào vịng đời củaH.pluvialisHB…………………………………………………… 67 3.2 NuôitrồngvitảolụcH.pluvialisHBgiàuastaxanthintrongcáchệ thốngkhácnhau………………………………………………… 75 3.2.1 NuôicấyvitảolụcH.pluvialisHBtrongpha1 75 3.2.2 Điềukiệntốiưu cho tíchlũyastaxanthincủa chủngHB trongpha 91 3.3 Thửnghiệmbổs u n g s i n h k h ố i t ả o H p l u v i a l i s H B g i u as taxanthinchocáKoi Nhậtvà cáhồi Vân .107 3.3.1 ĐánhgiáchấtlượngsinhkhốitảoH pluvialisHB .107 3.3.2 Thửnghiệm thứcăncóphốitrộnastaxanthintừs i n h k h ố i t ả o H pluvialisHBlên màu sắc củacá Koi Nhậtvà cáhồiVân 108 CHƢƠNGIV.B À N LUẬNKẾTQUẢNGHIÊNCỨU 117 4.1 Đặcđ i ể m sinh h ọ c c ủ a c h ủ n g H a e m a t o c o c c u s s p H B l ự a c h ọ n đƣợc…………………………………………………………… 4.2 117 NuôitrồngvitảolụcH.pluvialisHBgiàuastaxanthintrongcáchệ thốngkhácnhau .120 4.3 Sửd ụ n g s i n h k h ố i t ả o H p l u v i a l i s H B g i u a s t a x a n t h i n t r o n g nuôitrồngthủysản……………………………………………… 129 KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ 132 DANH MỤCCÁC CƠNGTRÌNHKHOAHỌC ĐÃ CƠNGBỐ 134 TĨMTẮTLUẬN ÁN BẰNGTIẾNGANH 135 TÀILIỆUTHAMKHẢO… 140 PHỤLỤC…………………………………………………………… DANHMỤCCÁC KÝHIỆU,CÁC CHỮVIẾTTẮT Tênđầyđủ Từ TênTiếngViệt viếtt AAPH ACC 2,2'-Azobis (2- 2,2'-Azobis(2- amidinopropane)dihydrochloride amidinopropane)dihydrochloride 1-aminocyclopropane-1-cacboxylicacid Axit1-aminocyclopropane-1cacboxylic APXs Ascorbateperoxidase Ascorbateperoxidase ARA Arachidonicacid Axítarachidonic BHA Hydroxyanisolebutylated Hydroxyanisolebutylated BKT β-caroteneoxygenase β-caroteneoxygenase CHY β-carotenehydroxylase β-carotenehydroxylase C/N Carbon/nitrogen Cácbon/nitơ DHA Docohexanenoicacid Axítdocohexanenoic DNA Deoxyribonucleicacid Axítdeoxyribonucleic DPA Docosanpentaenoicacid Axítdocosanpentaenoic E.coli Escherichiacoli VikhuẩnEscherichiacoli EMS Etylmethanesulphonate Etylmethanesulphonate EPA Eicosapentaenoicacid Axíteicosapentaenoic EPR 2,4-epibrassinolide 2,4-epibrassinolide GA3 Gibberellicacid Axítgibberellic HB HịaBình HịaBình HTNK Hệthốngnikín Hệthốngnikín HTNH Hệthốngnihở Hệthốngnihở JA Jasmonicacid Axítjasmonic LB LauriaBetani MôitrườngLB MB MethyleneBlue Xanhmethylene MĐTB Mậtđộtếbào Mậtđộ tếbào MJ Methyljasmonate Methyljasmonate MNNG Methylnitronitrosoguanidine Methylnitronitrosoguanidine MV Methylviologen Methylviologen NTTS Nuôitrồngthủysản Nuôitrồngthủysản ORAC Oxygenradicalabsorbancecapacity Chỉs ố đ n h g i k h ả n ă ng chốngơxyhóacủamộtchất PCR Polymerasechainreaction Phảnứngchuỗitrùnghợp ROS Reactiveoxygenspecies phântửơxycóhoạttính rRNA Ribosomalribonucleicacid ARNriboxom SOD Superoxidedismutase Superoxidedismutase SEM Scanningelectronmicroscope Kínhhiểnviđiệntửqt SKK Sinhkhốikhơ Sinhkhốikhơ TLC ThinLayerChromatography Sắckýlớpmỏng TB Tếbào Tếbào