0968 nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục haematococcus pluvialis flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy

Giớithiệuchung vềastaxanthin

Đặcđiểmchung

Astaxanthin (3,3 ` -dihydroxy-β,β ` -carotene-4,4 ` -dione ) là một carotenoid cómàu đỏ cam, là dẫn xuất của các hợp chất isoprenoid, chúng tạo thành các chất cómàu sắc khác nhau trong tự nhiên và có chức năng sinh học thiết yếu đối với độngvật Astaxanthin có thể được tìm thấy trong nhiều loại thuỷ hải sản như cá hồi, cávền, tôm, cua, trứng cá, đôi khi astaxanthin cũng được phát hiện ở một số loài chim.Động vật có vú không có khả năng tổng hợp astaxanthin và phải được cung cấp từkhẩuphần ăn (Higuera- Ciapara và cs,2006).

Astaxanthinc ó c ô n g t h ứ c p h â n t ử l à C40H52O4,đ i ể m n ó n g c h ả y x ấ p x ỉ 224 o C Chúng không hoà tan trong các dung dịch lỏng và hầu hết các dung môi hữucơ,t u y n h i ê n , c h ú n g c ó t h ể h o à t a n t r o n g c á c d u n g m ô i k h ô n g p h â n c ự c n h ư acetone, dimethyl-sulfoxide ngay ở nhiệt độ phòng So với các loại carotenoid khác,astaxanthindễ dàng được hấp thụvà tích luỹ.

Cấutrúccủaastaxanthin

Phân tử astaxanthin có hai carbon không đối xứng ở vị trí 3 và 3 ’ của vòng β- ionone.Astaxanthincóbadạngcấuhìnhlàastaxanthintựdo,monoestervàdiester tùythuộcvàosựkếthợpcủa1hoặc2gốchydroxylvớicácaxítbéo.Nhómestertạo ramốiliênkếtgiữaastaxanthinvàprotein.Vìvậy,astaxanthinkhôngthểgắnk ết với protein nếu liên kết ester không tồn tại Do cấu trúc của astaxanthin có 2 vịtrí 3 và 3’ở dạng chiral, cho nên chúng có 3 dạng đồng phân hình học: 3R-3’R; 3R-3’S và 3S-3’S (Hình 1.1) Trong đó, 3S-3’S là dạng astaxanthin có hoạt tính chốngôxy hóa mạnh nhất, dạng 3R-3’S không có hoạt tính sinh học, dạng 3R-3’R có hoạttínhyếu (Ambati và cs, 2014).

(Dạng tự do (A), dạng monoester (B), dạng diester (C) và các đồng phân hình học(D).R là cácchuỗi axít béo bão hòa hoặckhôngbão hòa)

Sinhtổnghợp astaxanthin

Cóhaiconđường sinhtổnghợpastaxanthinởtảoH.pluvialis:conđườ ngthứ nhất bắt đầu với quá trình ôxy hoá β- carotene tạo thành các chất trung gian làechinenone, canthaxanthin và adonirubin; con đường thứ hai bắt đầu bằng quá trìnhhydroxylhoáβ- carotenetạothànhcácchấttrunggianlàβ - c r y p t o x a n t h i n , zeaxanthinvà adonixanthin (Hình 1.2).

Mặc dù các bước đặc thù của quá trình sinh tổng hợp astaxanthin diễn ra ở tếbào chất nhưng các enzyme chính của con đường tổng hợp carotenoid chung lạiđược phân bố ở lục lạp (Jin và cs, 2006) Sinh tổng hợp astaxanthin củaH. pluvialiscũng theo con đường tổng hợp carotenoid chung đến β - carotene Từ β - carotene,astaxanthinđượchình th àn h bởih oạt độngcủa 2enzymeβ - carotene ox yge nase

(BKT) và β -carotene hydroxylase (CHY) Các nghiên cứu sử dụng chất ức chế quátrìnhc a r o t e n o i d h ó a đ ã c h ứ n g m i n h r ằ n g a s t a x a n t h i n đ ư ợ c t ạ o r a t ừ t i ề n c h ấ t canthaxanthin BKT chuyển hóa β - carotene thành canthaxanthin thông qua dạngtrunggianlàechinenone,tiếpđódướitácdụngcủaenzymeCHYsẽchuyểncanthaxanthin thành astaxanthin (Schoefs và cs, 2001) Do đó, BKT và CHY là 2emzyme chìa khóa quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp astaxanthin ở tảoH.pluvialis.

Cácnguồncungcấp astaxanthin

Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồngthuỷ sản Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ănbổsung nhằmtạo ra cácmầu sắccủa đối tượngnuôi khácnhau.

Quát r ì n h t ổ n g h ợ p h ó a h ọ c a s t a x a n t h i n đ ư ợ c s ử d ụ n g l â u đ ờ i v à r ộ n g r ã i nhất liên quan đến phản ứng Wittig của muối photphat ở vị trí C15 với dialdehyde ởvị trí carbon C10 (Hình 1.3A) Các phương pháp khác bao gồm hydroxyl hóacanthaxanthin (Hình 1.3B) (Berhard và cs, 1984), một quá trình trùng hợp 3 mạchcarbon có chiều dài 10, 20 và 30 nguyên tử carbon thông qua ngưng tụ dienolether(Rüttimann,1999)vàcácđồngphâncủaluteinđượcchiếtxuấttừhoacúc vạnthọđể tạo thành zeaxanthin và sau đó chất này bị ôxy hóa để hình thành astaxanthin(Hình1.3C) (Schloemer và Davis, 2001).

(Phản ứng Wittig (A); Hydroxyl hóa canthaxanthin (B); Ô xy hóa zeaxanthin (C)

(http://trace.tennessee.edu/utk_chembiopubs/94)

Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu được tập trung ở phầnvỏ ngoài, chiếm từ 58 đến 87% carotenoid tổng số Hàm lượng astaxanthin có trongvỏ tôm, cua thay đổi đáng kể tùy thuộc vào loài, từ 10 đến 140 mg/kg khối lượngtươi và tồn tại ở dạng 3S - 3’S Chính vì vậy, vỏ tôm, cua chính là một nguồnastaxanthin đáng kể trong tự nhiên Tuy vậy, hàm lượng astaxanthin trong cácnguyên liệu này tương đối thấp Trong khi đó, độ ẩm, hàm lượng tro và các chấtdinh dưỡng khác trong vỏ tôm, cua lại rất cao đã gây ra một số khó khăn nhất địnhtrong việc sản xuất đảm bảo ổn định chất lượng thức ăn cho động vật nuôi trồng(Higuera-Ciaparavà cs, 2006). b Nấmmen

Phaffia rhodozymalà một loài nấm men duy nhất được biết đến hiện nay cókhả năng tổng hợp astaxanthin lên tới 0,5% SKK (nhưng 100% astaxanthin tích lũyở dạng đồng phân 3R - 3’R) Một lợi thế của chủng này là có khả năng sinh trưởngnhanhvàđạtmậtđộtếbào(MĐTB)caotrongquátrìnhlênmen.Tíchlũyastaxanthin ở n ấ m m e n t h ô n g q u a c o n đ ư ờ n g m e v a l o n a t e ( S c h m i d t v à c s , 2 0 1 1 ) Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin tổng hợp được phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểmsinh học của chủng, phương pháp và điều kiện nuôi cấy (Johnson & An, 1991).Ngoài ra,doPh rhodozymacó cấu tạo vách tế bào cứng, khó tiêu hóa đối với cácđộngvậtnêntrongquátrìnhsảnxuất cácchếphẩmsinh họcchứaastaxanth intừloài nấm men này cần phải phá hủy thành tế bào bằng các phương pháp cơ học hayxử lý bằng enzyme khác nhau, nhằm tăng hiệu quả hấp thụ của chất này đối vớiđộngvật. c Tảo

AstaxanthincóthểđượcsảnxuấttừcácloạitảokhácnhaunhưAnkistrodesmus branuii, Chlorella zofingiensis, Dunaliella salina, Euglena rubida,Chlorococcum.Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin ở các chủng tảo nêu trên tươngđối thấp và không thích hợp để sản xuất ở quy mô lớn Trong khi đó, vi tảo lụcH.pluvialisđã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học và sản xuấtứng dụng vì chúng có khả năng tích luỹ một lượng lớn astaxanthin (7000 - 55000àg/g tế bào, tương ứng 0,7 - 5,5% SKK) Astaxanthin từ tảoHaematococcuschứa5% dạng tự do và 95% dạng được ester hóa (75% monoester và 20% diester) 100%astaxanthin được chiết xuất từH pluvialiscó dạng 3S-3’S - đây là dạng đồng phâncóhoạttínhchốngôxyhóacaonhất(Olaizola2000).Thựctếchothấyastaxanth inởda, cơ và trứngcủa thủy sản chủyếu ở dạng 3S-3’S. d Cácvisinhvậtkhác

Một số loại vi khuẩn nhưMycobacterium lacticola, Brevibacteriumsp vàmột số chủng nấm thuộc chiPeniophoracũng có khả năng tích luỹ astaxanthin.Hàm lượng carotenoid của những vi sinh vật này rất thấp đồng thời chúng cũng sinhtrưởngrất chậm.

Cáhồicũnglàmộtnguồncungcấpastaxanthintựnhiên.Hàmlượngastaxanthin trong cá hồi hoang dãOncorhynchusdao động trong khoảng 26 - 38mg/kg thịt cá. Hàm lượng astaxanthin trong cá hồi Đại Tây Dương nuôi là 6 - 8mg/kgth ịt c á V ớ i 16 5g t h ị t cá h ồ i c ó t hể cu n g c ấ p đến 3, 6 m g as taxa nt hi n ch o khẩuphần ăn hàng ngày (Ambativà cs, 2014).

Các nguồn cung cấp astaxanthin và hàm lượng astaxanthin ở các cơ thể khácnhauđược trình bày ở Bảng 1.1.

Tiềm năng sản xuất astaxanthin từ các nguồn khác nhau dựa trên lợi ích vềkinhtế, môitrường và tácđộng xãhội được chỉra trênBảng 1.2.

Kết quả trên Bảng 1.2 đã cho thấy astaxanthin có nguồn gốc tổng hợp hóahọc tốt hơn sản xuất astaxanthin từ nấm men và tảo ở hầu hết các tiêu chí thửnghiệm (kinh tế, môi trường và xã hội) So với astaxanthin tự nhiên từ nấm menhoặcv i t ả o l ụ cH p l u v i a l i s,a s t a x a n t h i n t ổ n g h ợ p h ó a h ọ c c ó c h i p h í n g u y ê n v ậ t liệu;n ă n g l ư ợ n g r ẻ n h ấ t ( 4 0 v à 2 6 $ / k g a s t a x a n t h i n ) , k h ô n g t ố n d i ệ n t í c h đ ấ t s ử dụng và không có nước thải Chính vì vậy, giá thành sản xuất astaxanthin là thấpnhất so với 2 nguồn còn lại Tuy nhiên, astaxanthin tổng hợp nhân tạo chứa hỗn hợpcủa 3 dạng đồng phân 3S-3’S; 3R- 3’S và 3R-3’R tương ứng với tỉ lệ là 1:2:1 Nhưvậy, chỉ có 25% astaxanthin tổng hợp nhân tạo có hoạt tính và hữu dụng Với sựhiệndiệncủacácdạngđồngphânhìnhhọckháctrongkhẩuphầnthứcănsẽd ẫnđến sự cạnh tranh cơ chất trong quá trình chuyển hóa astaxanthin trong cơ thể độngvật nuôi Như vậy, khả năng hấp thụ astaxanthin tổng hợp thấp hơn rất nhiều so vớiastaxanthincó nguồn gốc tự nhiên.

Phươngph áp sảnxuất/kg astaxanthin

Sửdụ ngnă nglượ ng(kw h)

(Nguồn:http://trace.tennessee.edu/utk_chembiopubs)

Ngoàir a, g iá t r ị O R A C ( o x y g e n ra dic ala bso rb an ce c a pa c i t y - chỉ số đá n h giá khả năng chống ôxy hóa của một chất) đối với astaxanthin từ tảo tạo ra lại caohơngấp3lầnsovớisảnphẩmtổnghợpvà1,5 lầnsovớilênmennấmmen.Sự khácbiệtnàylàdocấuhìnhtồntạicủaastaxanthinởcácphươngphápkhácnhaulà khácn h a u A s t a x a n t h i n t r o n g c á c sả n p h ẩ m t ự n h i ê n ở d ạ n g es t e r h ó a n ê n n ó ổ n định hơn trong việc ngăn ngừa quá trình ôxy hóa (Schmidt và cs, 2011) Chỉ cóastaxanthin được tổng hợp từ tảo và nấm men mới được sử dụng cho con người,trong khi đó dạng tổng hợp nhân tạo được sử dụng chủ yếu cho thức ăn gia súc (doquá trình tổng hợp astaxanthin có sử dụng hóa dầu gây ung thư đã được tác giảNewsome năm 1986 thông báo) Do vậy,khai thác astaxanthin từ nguồn tự nhiên,đặc biệt là từ tảoH pluvialisvẫn đang được quan tâm và có nhiều cơ hội để pháttriểnngày càng mạnh.

Sinhhóahọc củaastaxanthin

Astaxanthincóchứaliênkếtđôixenkẽ,nhómhydroxylvànhómketo.Nóc óhaitínhchấtưamỡvàưanước.Màuđỏđượctạoradosựliênkếtđôiliêntiếptại trung tâm của hợp chất Hoạt động sinh học của astaxanthin tốt hơn so với cácchấtc h ố n g ô x y h ó a k h á c ( β - c a r o t e n e , v i t a m i n C ) b ở i v ì n ó c ó t h ể l i ê n k ế t v ớ i màngl i p í t k é p c ủ a t ế b à o t ừ b ê n t r o n g đ ế n b ê n n g o à i ( H ì n h 1 4 ) V ì v ậ y , t ế b à o đượcbảo vệ toàn diệnhơn (Ambati và cs, 2014).

Hình 1.4.Vị trí hoạt động của astaxanthin trên màng tế bào(Nguồn:Ambati và cs,2014)

Đặc tính chốngôxy hóa củaastaxanthin

Astaxanthinc ó v a i t r ò l à c h ấ t c h ố n g ô x y h o á m ạ n h S ự t r a o đ ổ i c h ấ t b ì n h thườngởsinhvậthiếukhítạoracácgốctựdonhưhydroxyl,peroxidevàphântử ôxy có hoạt tính (reactive oxygen species - ROS) cần thiết để duy trì sự sống. Tuynhiên, khi hàm lượng các chất này quá cao sẽ gây nguy hiểm bởi chúng có thể ôxyhoá với các thành phần của tế bào như protein, lipít, carbohydrate và ADNin vivo.Đểk i ể m s o á t v à l à m g i ả m q u á t r ì n h n à y , c ơ t h ể c o n n g ư ờ i s ả n s i n h r a c á c c h ấ t chống ôxy hoá như super oxide dismutase (SOD), catalase, peroxidase…Tuy nhiên,trong nhiều trường hợp, những hợp chất này lại không đủ để bảo vệ cơ thể chống lạistressôxy hoá.

Các nghiên cứu cho thấy, astaxanthin có hoạt tính chống ôxy hoá cao gấp 10lần so với các carotenoid khác như zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, β - carotene vàcao hơn 100 lần so với α - tocopherol Vì vậy, astaxanthin được gọi là một “suppervitamin E”. Astaxanthin thực hiện các hoạt động chống ôxy hóa bằng cách loại bỏcác gốc tự do (chúng phản ứng với các gốc này để tạo ra các hợp chất không độckhác) hoặc dập tắt các phản ứng ôxy hoá Đặc tính này của astaxanthin có thể do sựtương tác vật lý và hóa học của astaxanthin với các màng tế bào (Ambati và cs,2014).

Ứngdụngcủaastaxanthin

Chất màu tự nhiên astaxanthin với hoạt tính chống ôxy hóa cao đã được ứngdụng trong nhiều lĩnh vực như làm thức ăn bổ sung cho người, thuốc điều trị trong yhọc,thức ăn bổ sung chocá hồi và cá cảnh.….

Mầu sắc của cá hồi và các loại giáp xác được xem là một chỉ tiêu về chấtlượng Màu đỏ của những sinh vật này bắt nguồn từ màu sắc của các carotenoidđượcchúngthu n hận từt hứ c ăn Lo ại carotenoid ch iế m ưuthế tr on ghầuhết các loàig i á p x á c v à c á h ồ i l à a s t a x a n t h i n M ặ c d ù t r ê n t h ự c t ế , a s t a x a n t h i n đ ư ợ c s ử dụng rộng rãi với mục đích duy nhất là tạo màu cho các động vật trong NTTS, tuynhiên astaxanthin còn có nhiều vai trò quan trọng khác như thúc đẩy sự thành thục,tăngtỷlệthụ tinhvàtỷlệ sốngsótcủatrứng, cảithiệnsựphát triểncủaphôi.

Một nghiên cứu gần đây ở Na Uy đã chứng minh rằng cá hồi Đại Tây Dươngở giai đoạn còn non sẽ phát triển tốt khi được cung cấp đầy đủ astaxanthin trongkhẩu phần ăn Astaxanthin được xem như một loại dinh dưỡng thiết yếu với hàmlượng cần thiết tối thiểu là 5,1 mg/kg Tuy nhiên, nếu hàm lượng astaxanthin trongkhẩu phần ăn đạt 13,7 mg/kg thì hàm lượng lipít trong thịt cá sẽ tăng lên 20% và sựphát triển của cơ thể sẽ đầy đủ hơn so với mức 5,3 mg/kg astaxanthin (Lorenz vàCysewski,2000).

Cá cảnh không tự tổng hợp được carotenoid mà lấy từ nguồn thức ăn như vitảo, san hô hoặc con mồi có chứa loại chất màu này Khi bổ sung astaxanthin vàochế độ ăn, cá sẽ chuyển hóa astaxanthin có trong thức ăn thành tuaxanthin và tíchlũychúngtrongdavàlàmchocácómàusắcrựcrỡ.Cácókhảnănghấpthụcácl oại carotenoid tốt theo thứ tự như sau: zeaxanthin (không phổ biến) > astaxanthin >lutein(có nhiều trong cácloại thực vậtnhư ngô…).

Như vậy, việc sử dụng astaxanthin trong NTTS không chỉ quan trọng khiđứngt r ê n p h ư ơ n g d i ệ n t ạ o s ắ c t ố m à a s t a x a n t h i n c ò n đ ư ợ c x e m n h ư l à m ộ t c h ấ t dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh sản đầy đủ của các loài thuỷ hải sảncógiá trị thương mại.

Astaxanthin có tác dụng trong việc bảo vệ võng mạc khỏi bị ôxy hóa, cảithiện những tổn thương võng mạc, bảo vệ các tế bào tiếp nhận ánh sáng khỏi thoáihóa,c h ố n g l ạ i s ự t h o á i h ó a đ i ể m v à n g d o t u ổ i t á c - n g u y ê n n h â n g â y m ù l o à (Palozza và cs, 2009) Chúng giúp bảo vệ nơ ron thần kinh và có thể làm chậm lạitác động của tuổi tác (giảm các triệu chứng như giảm trí nhớ, suy giảm chức năngthần kinh) Con người sử dụng astaxanthin thường xuyên sẽ giảm đáng kể sự tích tụhydroperoxidep h o s p h o l i p i d , m ộ t h ợ p c h ấ t đ ư ợ c c h ứ n g m i n h l à đ ã đ ư ợ c t í c h t ụ nhiều ở những người bị bệnh mất trí nhớ, hay quên ở người lớn tuổi Do đó, nó cóthểchốnglạibệnhAlzheimer.Ngoàira,astaxanthingiúpcảithiệntuầnhoàn máuvàgiảmhuyếtáp.Nórấtcólợichomàngtim,cótácđộngtốtlênmáu,tănglượng

HDL(highdensitylipoprotein- cholesterol,cholesterolcólợi)vàg i ả m triglycerides( I w a m o t o v à cs , 2 0 0 1 ) Doc ó k h ả n ă n g b ắ t g i ữ c ác g ố c t ự d o đ ư ợ c hìnhthànhtrongquátrìnhquanghoánênastaxan thincótácdụngtíchcựcđốivớida như giảm nếp nhăn, tăng độ ẩm, độ đàn hồi… Astaxanthin có thể bảo vệ da khỏitác hại của tia cực tím bằng cách vô hiệu hóa hoặc phá hủy các gốc tự do được hìnhthànhd o t i a c ự c t í m v à n g ă n c h ặ n n h ữ n g t á c h ạ i n h ư c h á y n ắ n g h o ặ c v i ê m d a Chúng còn có chức năng bảo vệ chống tác hại của tia tử ngoại (Rao và cs, 2013).Một đặc điểm đặc biệt quan trọng của astaxanthin là chúng không có hoạt tính củamột tiền vitamin A Vì vậy, trong các cơ thể đã không xảy ra nguy cơ ngộ độc cấptính do có sự tích lũy quá nhiều astaxanthin Kết quả thực nghiệm trên chuột đã chothấy không có một tác dụng nguy hại nào khi sử dụng liều astaxanthin 400 mg/kgtrong41 ngày (Nishikawa và cs, 2005).

Astaxanthin tách chiết từ tảoH pluvialisđã được chứng minh là an toàn,không có tác dụng phụ và được sử dụng rộng rãi trong hơn 15 năm như là một thựcphẩm chức năng (Rao và cs, 2013, Yuan và cs, 2011; Yang và cs, 2013 ) Đối vớingười, liều dùng an toàn có thể đạt đến 14,4 mg astaxanthin/ngày trong vòng 2 tuần(Mikivà cs, 1998).

Astaxanthin đã được dùng làm phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi gia súc,gia cầm, làm tăng màu vàng cam cho lòng đỏ trứng, tăng tỷ lệ nở con, giảm khảnăng nhiễm khuẩnSalmonella(Lorenz & Cysewski, 2000) Khi bổ sung astaxanthintự nhiên từ tảoH pluvialisvào thức ăn của gà đã cho thấy màu sắc của lòng đỏtrứng gà được tăng cường, tăng khả năng sinh sản ở gà mái, tăng hiệu quả sử dụngthứcăn và giảmtỷ lệ tử vong(Lignell & Inborr, 2000). Để sản xuất astaxanthin từ tự nhiên hiệu quả thì cần phải tìm được các chủngtiềm năng để khai thác Vi tảo lụcH pluvialisđã được chứng minh là nguồn sảnxuất astaxanthin tự nhiên hiệu quả nhất Chính vì vậy, ở phần tiếp theo, chúng tôitrìnhbà yk há i q u á t về đặ c đ iể ms i n h học, cô n g n ghệ nu ôi tr ồn gc ũn g n h ư n h ữn g tiềmnăng vàthách thức khinuôi trồngloài tảo nàyở quimô lớn.

GiớithiệuchungvềchivitảolụcHaematococcus

Vị trí phân loại vàphân bố

Vị trí củaHaematococcus pluvialistrong hệ thống phân loại như sau:H.pluvialisnằmtrongngànhTảolục(Chlorophyta),lớpChlorophyceae,bộVolvocales,h ọHaematococcaceae,chiHaematococcus(Bold&Wynne,1985).

TảoH p l u v i a l i s đ ư ợ cp h â n b ố r ộ n g r ã i t r o n g n h i ề u m ô i t r ư ờ n g s ố n g t r ê n toànthế giới Tảonàyđược tìmthấyởcácvùng ônđớitrênthếgiới vàđãđ ược phân lập từ châu Âu, châu Phi, Bắc Mỹ và Himachal Pradeslv Ấn Độ (Suseela vàToppo, 2006) Nhiều công trình công bố đã cho thấy tảo này có thể sinh sống trongnhững điều kiện môi trường và khí hậu đa dạng như vũng nước lợ trên những tảngđá trên bờ biển(Chekanov và cs, 2014);lưu vực nước ngọt trong đá đầy tuyết tanchảy trên đảoBlomstrandhalvứya; Na Uy (Klochkova và cs, 2013); đài phun nướckhụ gầnRozhen, Blagoevgrad ở Bulgaria (Gacheva và cs, 2015); ao cá nước ngọt ởBihor,Romania (Dragos và cs, 2010); bề mặt tầng thượng của một tòa nhà củaKIOST tạiSeoul, Hàn Quốc (Kim và cs, 2015) Với khả năng chống chịu tốt ở điềukiện sống bất lợi, thích nghi được với điều kiện môi trường thay đổi đột ngột bằngcách hình thành màng dày bao bọc xung quanh tế bào (tế bào dạng cyst) và có khảnăng nảy mầm trở lại khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi, do đó, chúng nhanhchóngtrở thành loài chiếmưu thế (Proctor, 1957).

CácloàiHaematococcus

Có 15 loàiHaematococcusđã được báo cáo, cụ thể là:H. pluvialis,H.allmani,H.buetschlii,H.capensis,H.carocellus,H.droebakensisvar,H.dro ebakensis, H grevillei, H insignis, H lacustris, H murorum, H salinus, H.sanguineus,H.thermalis,H.zimbabwiensis.Tuynhiên,chỉcó7loàiH.pluvi alis,

H.buetschlii,H.capensis,H.carocellus,H.droebakensis,Hthermalis,H.zimbabwiensis làđượcchấpnhậntronghệ thốngphânloạihiệnnay Trongđó,5loàiH.pluvial is,H.buetschlii,H.capensis,H.droebakensisvàH.zimbabwiensisđãđượctì mthấytrongmôitrườngnướcngọt.Trongcácloàitrên,vitảoH.pluvialis

A B lànguồntiềmnăngđểsảnxuấtastaxanthintựnhiên,vớihàmlượngtíchlũytrongtếbàocao,chiếm khoảng2-7%SKK(Lorenz&Cysewski,2000).

Đặc điểmsinh họcvàđặcđiểmhình thái

H pluvialislà vi tảo lục nước ngọt, đơn bào, có hai roi và có khả năngchuyển động ở giai đoạn sinh dưỡng Sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi tế bào. Tếbàoc ủ a t ả oH p l u v i a l i s c óh a i d ạ n g : T ế b à o s i n h d ư ỡ n g v à n a n g b à o t ử (

 Tế bào sinh dưỡng: Là các tế bào có màu lục, hình elip với đường kớnhkhoảng 10-20 àm Tế bào được bao quanh bởi thành tế bào và cú thể di động nhờhai roi Dưới điều kiện thuận lợi, phần lớn tế bào ở dạng sinh dưỡng, các tế bào nàycó hàm lượng chlorophyll a, b và tiền carotenoid, đặc biệt là β-carotene và luteincao.

 Nangb à o t ử ( c y s t ) : k h i đ i ề u k i ệ n s ố n g k h ô n g t h u ậ n l ợ i ( s t r e s s ) n h ư t h i ế u dinh dưỡng (thiếu nitơ, photpho, …), cường độ ánh sáng cao… tế bào sẽ chuyểnsang dạng nang bào tử, có hình cầu Chúng mất đi roi và không còn khả năng diđộng,thànhtếbàodầylên.Đườngkínhcủatếbàotănglênđộtngộttừ10-

20àmlờn 40-50 àm Cỏc tế bào cyst trưởng thành chứa astaxanthin chiếm khoảng 5%SKK(Lorenz & Cysewski, 2000).

(A:Tếbào sinhdưỡng, B:Tếbào cyst)(Nguồn: Lorenz& Cysewski,2000)

Vòngđời vàsựphânchiatếbàocủatảoH.pluvialiscũngđãđượcKobayashivàcộngsự (1992)và Shahvà cộngsự(2016)côngbố (Hình1.6 A,B).

Hình 1.6.Sự thay đổi hình thái tế bào (A) và sự phân bào (B) trongvòngđời của tảoH.pluvialis (Nguồn:Kobayashivà cs,1992; Shahvà cs,2016) Nhìnch u n g , v ò n g đ ờ i c ủ aH p l u v i a l i s đ ư ợ cc h i a l à m b ố n g i a i đ o ạ n c h í n h nhưsau:

(i) Giai đoạn tế bào sinh dưỡng: Giai đoạn này, tế bào ở dạng sinh dưỡng cóhìnhdạngelíp, chuyểnđộngbằng hairoi,phânchiatế bàođểgia tăngsốlượ ng Các tế bào này chứa hàm lượng chlorophyll và protein cao nhưng hàm lượngcarotenoidlại thấp.

(ii) Giai đoạn tạo bào nang non (encyst): Ở giai đoạn này, các tế bào sinhdưỡng chuyển sang dạng tế bào nang non có màu nâu, hình cầu, mất roi Trong suốtgiai đoạn nang bào, hàm lượng chlorophyll và protein giảm đi, trong khi mức độsinhtổng hợpcarotenoid vàprotein tăng lên(Hagen vàcs, 2002).

(iii) Giai đoạn tế bào cyst hoàn chỉnh: Ở giai đoạn này, tế bào cyst đã hoànchỉnh, bất động, tích lũy hàm lượng carotenoid cao nhất Trong suốt giai đoạn chínnày,quá trìnhtổnghợp carotenoid,chlorophyll vàprotein chậmlại.

(iv) Giai đoạn nảy mầm: Ở giai đoạn này xảy ra sự tổng hợp chlorophyll vàprotein, xuất hiện sự phân giải carotenoid Có 2 cách thức nảy mầm ở vi tảoH.pluvialisđã được quan sát: (1) nảy mầm trực tiếp từ một nang bào tử hình cầu,không di động thành 1 tế bào sinh dưỡng hình elip, có 2 roi; (2) nảy mầm gián tiếpthông qua pamella (cụm tế bào được bao bọc bởi một lớp màng) Khi đó màng baobọc pamella bị vỡ, từ một tế bào nang tạo ra 8 tế bào sinh dưỡng Tỷ lệ về hàmlượng carotenoid/chlorophyll là một thông số quan trọng cho phép phân biệt 4 giaiđoạn khác nhau của tế bàoH pluvialis Tỷ lệ này vào khoảng 0,5; 1,0 và 7,0 tươngứngcác tế bào sinh dưỡng (màu lục), các tế bào cyst còn non (màu nâu), và tế bàocysthoàn chỉnh(tế bào chín,màu đỏ)(Kobayashi và cs,1997).

Thành phầnsinhhóa học của tảoH.pluvialis

Do tảoH pluvialiscó chu kỳ sống phức tạp, vòng đời của tảo có sự xen kẽgiữat ế b à o s i n h d ư ỡ n g m à u x a n h v ớ i t ế b à o c y s t m à u đ ỏ n ê n t h à n h p h ầ n d i n h dưỡng của tế bào tảo này thay đổi rất khác nhau giữa 2 giai đoạn sinh trưởng trongquátrình nuôi cấy (Bảng 1.3).

TảoH pluvialisở giai đoạn sinh dưỡng có hàm lượng protein rất cao, daođộng từ 29 - 45% SKK, hàm lượng này giảm xuống 17 - 25% khi tảo chuyển trạngthái tế bào sang giai đoạn cyst (Kim và cs, 2015) Thành phần axít amin của proteintrong SKK giai đoạn màu đỏ chủ yếu gồm axít aspartic, glutamic, alanin và leucinevới hàm lượng khoảng 10,2 mg/100 mg axít amin tổng số, trong đó có 46,0% axítaminthuộc các axít amin thiết yếu.

Hàm lượng carbohydrate chiếm khoảng 15 - 17% SKK ở giai đoạn sinhdưỡngv à t ă n g l ê n 3 6 -

4 0 % k h i t ả o ở g i a i đ o ạ n c y s t T ư ơ n g t ự , h à m l ư ợ n g l i p í t cũng có xu hướng tăng ở giai đoạn cyst (chiếm 32 - 37% SKK), hàm lượng này caogấp 1,5 lần so với hàm lượng lipít ở giai đoạn sinh dưỡng Thành phần axít béo tổngsố củaH pluvialistương đối phức tạp; chủ yếu là các axít béo mạch dài nhỏ hơn 18nguyên tử carbon như palmitic (16: 0), linoleic (18: 2), và linolenic (18: 3) Hàmlượng các axít béo của tảo này thay đổi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy,chấtlượngdinhdưỡng,cácđiềukiệngâycăngthẳng…Hàmlượnglipítcủatảonàytăng mạnh khi nuôi cấy trong điều kiện thiếu hụt dinh dưỡng cho thấy tiềm năng sản xuấtdầu diesel sinh học từ vi tảo này (Saha và cs, 2013) Sự tích lũy astaxanthin ở tảoH.pluvialislà một phản ứng của tế bào chống lại các điều kiện bất lợi, giúp tế bào tồntại Đồng thời với quá trình tích lũy astaxanthin là quá trình sinh tổng hợp củatriacylglycerol (TAG) (Zhekisheva và cs, 2005; Cerón và cs, 2007) và giảm hoạtđộng của quang hệ II của quang hợp (photosystem II - PSII), mất cytochrom f, giảmtốc độ vận chuyển điện tử trong mạch vận chuyển điện tử quang hợp và tăng cườnghô hấp (Boussiba, 2000) Astaxanthin được tích lũy trong các giọt lipít ở tế bào chất(Lipiddroplet- LD) (Aflalo và cs,2007).

Thành phần carotenoid của các tế bào sinh dưỡng bao gồm chủ yếu là lutein(75 - 80%), β - carotene (10 - 20%) và những sắc tố khác (bao gồm chlorophyll a vàb, violaxanthin, neoxanthin, lactucaxanthin và zeaxanthin (Harker và cs, 1996).Trong giai đoạn đỏ, hàm lượng carotenoid tổng số tăng mạnh, trong đó sắc tốastaxanthinchiếmchủyếu(80-99%carotenoidtổngsố)(Dragosvàcs,2010).Tỷlệ carotenoid /chlorophyll đạt giá trị 0,2 trong giai đoạn sinh dưỡng Giá trị này tănglên2- 9khi tảo chuyểnsang giai đoạntế bào cyst(Bảng 1.3).

Ghichú:n.d:khôngxácđịnh(Nguồn:Shahvàcs,2016;Lorenz,1999)

Quytrìnhsảnxuấtastaxanthin ởH pluvialis

Có 2 quy trình nuôi cấy thường được áp dụng để sản xuất sinh khối vi tảoH.pluvialisgiàu astxanthinlà quy trìnhnuôi cấymột hoặc haipha.

Quy trình công nghệ nuôi cấy một pha gồm một giai đoạn nuôi cấy duy nhất.Trong đó, quá trình sinh trưởng của tế bào diễn ra đồng thời với quá trình tích lũyastaxanthin trong cùng một hệ thống nuôi Cần kiểm soát tốt điều kiện nuôi cấy vànồng độ các chất dinh dưỡng trong môi trường để duy trì sự tồn tại của cả tế bàosinh dưỡng và tế bào cyst trong cùng một hệ thống nuôi (Del Río và cs, 2008;García- Maleav à c s , 2 0 0 9 ) T u y n h i ê n , M Đ T B v à h à m l ư ợ n g a s t a x a n t h i n c ủ a t ả o tíchl ũy đượcbằng phương phápnày rấtthấp (Olaizola, 2000).

Quy trình công nghệ nuôi cấy hai pha đã được chứng minh là hiệu quả để sảnxuất thương mại astaxanthin từ tảoH pluvialis(Aflalo và cs, 2007) Quy trình nàygồm hai giai đoạn nuôi cấy khác nhau:(i)Giai đoạn tăng sinh khối tế bào(Pha 1-Giaiđoạnxanh- GreenStage):H.pluvialisđượcnuôitrồngdướiđiềukiệnhoàntoàntốiưuchosựsinhtrưởngvàphátt riểnnhằmmụcđíchtăngtốiđasốlượngtếbào;

(ii)Giaiđoạnkíchthíchsinhtổnghợpastaxanthin(Pha2-Giaiđoạnđỏ-Cyststage):sựtổng hợp astaxanthin được cảm ứng bằng cách thay đổi điều kiện môi trường theohướng bất lợi (stress) Các yếu tố bất lợi như cường độ ánh sáng cao, ánh sáng kếthợp với thiếu hụt nitơ; acetate dư thừa, sốc muối hoặc bổ sung các chất ức chế phânchia tế bào…đã được sử dụng để tăng cường tích lũy astaxanthin ở sinh khối tảoH.pluvialis.Lựachọnđượccáctácnhâncảmứngcũngsẽquyếtđịnhđếnhàmlượngvàsảnlượ ngastaxanthintổngsốthuđược(Livàcs,2010;Choivàcs,2011).

CácyếutốảnhhưởngđếnquátrìnhsảnxuấtastaxanthintừH.pluvialis 21

Park và cs, 2014;Zhangvàcs,2014; Sahavàcs,2013

8 Sắt(Fe) Fe 3+ -EDTA,18 àmol/L

Các thông số chỉ ra trên Bảng 1.5 đã cho thấy điều kiện thích hợp cho sinhtrưởngvàtíchlũyastaxanthinởvitảolụcH.pluvialislàkhácnhau.Chínhvìvậy,đểsảnxuấtastaxanthinhiệuquảthìquytrìnhnuôicấy2phathườngđượcápdụng.

TìnhhìnhnghiêncứuvàcôngnghệnuôitrồngtảoH.pluvialischo sảnxuấtastaxanthin

Nuôicấy quangtựdưỡng

Nuôi cấy quang tự dưỡng tảoH pluvialisthực hiện chủ yếu trong các hệthông nuôi hở (HTNH) hoặc trong hệ thống nuôi kín (HTNK) (hệ thống có sục khí(bubblecolumn),hệthốngnuôicuộnkhí(airlift)(Hình1.7và1.8).

Theo công bố của Tocquin và cộng sự (2011), MĐTB tảoH pluvialisđạt giátrị cao nhất là 2 x 10 6 TB/mL trong môi trường có tỷ lệ nitơ/ photpho thấp Ở môitrườngnày,tảoH.pluvialisđãduytrìtrạngtháisinhdưỡngtrongmộtthờigiandài.

Sản xuất sinh khối tảo có thể thực hiện trong các hệ thống nuôi ngoài trờitrong các hệ thống bể dài (Raceways), hệ thống bể nông (shallow ponds), hệ thốngbể nghiêng (cascade) Đây là hệ thống nuôi quy mô lớn với dạng bể nuôi tròn hoặcdài.Dịchtảođượckhuấybằngthiếtbịguồng.Chiềusâucộtnướckhoảng20-50 cm Hệ thống này được thiết kế để thu nhận ánh sáng tối ưu và có chi phí xây dựngthấpnhất.Hiệnnaytrênthếgiớiđãcónhiềucôngtyứngdụngthànhcôngcôngnghệnuôi trồng loài tảo này như tập đoàn Cyanotech (Hawaii, Mỹ) đã nuôiH. pluvialistrongcáchồhởvớithểtíchlêntới500.000Lvàhàmlượngastaxanthinđạtđược1,5

3,0%SKK(Lorenz&Cysewki,2000).Tuynhiên,MĐTBđạtcaonhấttrongcácbểnuôihởmớichỉ đạttừ0,3–0,6x10 6 T B / m L

(Nguồn:http://www.slideshare.net/Priyakapriya/biodiesel-from-microalgae-production-methods-a-review)

Nuôi trồng quang tự dưỡng loàiH pluvialistrong các hệ thống nuôi kín cóthể được thực hiện theo kiểu nuôi theo mẻ (Batch), nuôi liên tục, nuôi fed-batch vànuôikiểu“perfusion”.Mỗiphươngphápnuôicónhữngưu,nhượcđiểmriêng.

 Nuôi theo mẻ (Batch): là kỹ thuật phổ biến để tăng số lượng tế bào, đặc biệtđượcápdụngởquimôphòngthínghiệm.Choivàcộngsự(2003)đãcôngbốnuôivitảo lụcH. pluvialistrong ống sục khí (bubble column) 2 L theo kiểu nuôi theo mẻ.MĐTBlớnnhấtthuđượctrongđiềukiệnnuôichiếusángvớicườngđộ1,5kluxlà5,2 ×10 5 TB/mLtrong9ngày.Điềunàytươngđươngvớitốcđộsinhtrưởngđặctrưnglà0,23/ngày.

( A:Dạngống(Tubularphotobiorector);B:Dạngbáncầu;C:Dạngvànhkhuyên(Annularreacto r);D:Dạngtấmphẳng(Flatplatereactor);EvàF:Dạngcộtthẳngđứng(Verticalcolumnreactor) )

(Nguồn:https://www.google.com.vn/search?q=photobioreactorforhaematococcus)

Khi nghiên cứu sinh trưởng của loài vi tảo này trong hệ thống photobioreactordạng ống và dạng trụ đứng có cùng dung tích 55 L ở điều kiện ngoài trời sau

16ngàynuôi,loàivitảonàysinhtrưởngtronghệthốngdạngốngtốthơnởhệthốngtr ụ đứng với khối lượng sinh khối tương ứng là 7,0 g/L và 1,4 g/L và hàm lượngcarotenoidtương ứnglà 2,0 và0,5% SKK(Lopez và cs,2006).

Năm 2011, Issarapayup và cộng sự đã công bố các điều kiện nuôi trồng tối ưutảoH pluvialistronghệthống kín dạng phiến phẳng cótốcđộsinht r ư ở n g đ ặ c trưng và MĐTB tương ứng là 0,52/ngày và 41 x 10 4 TB/mL Cũng trong hệ thốngnuôi dạng này ở quy mô 17 - 200 L, tốc độ sinh trưởng đặc trưng đạt 0,45 - 0,53/ngàyvới MĐTB đạtcực đại 1,10 -2,90 x 10 6 TB/mL.

Tuy nhiên, MĐTB ở các hệ thống kín dạng ống với quy mô nhỏ hơn thường cóMĐTBcaohơnvàduytrìtrạngtháisinhdưỡngtốthơncáchệthốngcóquymôlớn.Ởcáchệthốngdungtí ch2L,MĐTBđạtđượccóthểlêntới1,1-2 x10 6 TB/mL(Vega-Estrada và cs, 2005); và 5 - 7 x 10 6 TB/mL trong hệ thống 1 L (Ranjbar, 2008a, b).Nhưngđốivớihệthốngdạngnàykhinângquymôlên55L,sinhkhốiđạtđượcthấp hơn5lầnsovớihệthốngdạngốngtròncócùngdungtíchvàđiềukiệnnuôi(Lopezv à cs,2006).

 Nuôi liên tục:là phương pháp cơ bản để kéo dài sinh trưởng của vi sinh vậttrongnuôitheomẻnhưngcầnđồngthờibổsungliêntụcchấtdinhdưỡngmớivàloạibổmôitrườ ngnuôicũcùngvớisinhkhốitếbàotảotừhệthốngnuôi.Trongnuôiliêntục,sựpháttriểncủatảocũngn hưcácyếutốmôitrườngnuôiluônđượcgiữổnđịnh.Quátrìnhnuôiliêntụcđượcápdụngthànhcông trongnuôitảoH.pluvialis.Olaizola(2000)đãcôngbốkếtquảcủa9thángvậnhànhhệthốngkín nuôiloàivitảonàycótênlàAquasearchGrowthModule(AGM)dungtích25000L,cósửdụnghệ thốngmáytínhđểđiềukhiểncácquátrình,diệntíchbềmặtlà100m 2 ,sửdụngánhsángtựnhiên.Hệthốn gAGMđượccấutạotừhệthốngốnglắpsongsong,đườngkính18-41cm,nhiệtđộdaođộng20-

Gầnđây,Livàcộngsự(2011)cũngđãđánhgiáhiệuquảkinhtếcủaviệcsảnxuấtastaxanthinbằn gnuôitrồngHaematococcusởquymôlớntạiTrungQuốcvớimôhìnhnuôitrồnghaigiaiđoạn.T rongđó,giaiđoạnđầunuôitheokiểubánliêntụctronghệthống photobioreactor kín dung tích 8000 L, giai đoạn sau chuyển ra bể 100 m 2 choquátrìnhchuyểngiaiđoạn.Nguồngiốngbanđầuđượcnuôitronghệthốngphotobior eactor kín 20 L, chuyển dần lên hệ thống 1000 và 8000 L MĐTB trongHTNK đạt cao nhất lên tới khoảng 10 6 TB/mL và thường duy trì ở mật độ 0,5 x

 Nuôi theo kiểu “fed-batch”: Về bản chất đây là phương pháp nuôi theo mẻ cóbổsungcácchấtdinhdưỡng(liêntụchoặckhôngliêntục)trongquátrìnhnuôi.Kiểunuôinàyđãđ ượcápdụngđểnuôitrồngtảoH.pluvialis.Tronghệthốngkíndạngcộtvớikiểusụcbọtkhí,bổsun gCO2liêntụcvàbổsungdinhdưỡngnitratekhoảng8mMtheo kiểu fed - batch làm tăng MĐTB lên trên 3,5 x

10 6 TB/mL sau 200 giờ nuôi.Trong khoảng thời gian này, tế bào tảoH pluvialisvẫn duy trì trạng thái sinh dưỡngvới2roi,màuxanh,khôngcósựthayđổihìnhtháisangtếbàonang.Saukhiđạtđượcsốlượngtếb àocao,sựgiảmđộtngộtnồngđộnitratexuốngdướingưỡng4mMvà cường độ ánh sáng cao tăng cường mạnh sự tích lũy astaxanthin để đạt hàm lượngtrong khoảng 320 - 390 mg/L Sự tổ hợp của phương pháp bổ sung dinh dưỡng theokiểu fed- batch và pha loãng dịch nuôi để làm cạn kiệt nguồn dinh dưỡng là phươngphápđầyhứahẹnđểđạtđượcMĐTBcaovàhàmlượngastaxanthincaotrongbểphảnứngquangs inhcộtbọtkhí(Ranjbarvàcs,2008a).

 Phương pháp nuôi thay môi trường mới “perfusion”:Park và cộng sự

(2014)đã thiết lập một hệ thống nuôi hai pha kiểu “nuôi thay môi trường mới” - “perfusionculture” kết hợp chế độ chiếu ánh sáng từng bước để sản xuất astaxanthin từ tảoH.pluvialis(Hình1.9).

Phươngphápnàydựatrênnguyênlýmôitrườngsinhtrưởngđượcthaythếlặpđilặplại.Dịc htảotronghệthốngnuôiđượclấyra,lọcloạibỏmôitrườngcũ,giữlạitếbàovàbổsungmôitrườngn uôimới.Cáctếbàonàycóthểsinhtrưởngtốtnhờsửdụngmôitrườngnuôimới- khôngchứacácchấtchuyểnhóaứcchế.Nuôitheokiểuthaythếmôitrườngmớitạoranăngsuấts inhkhốicao0,18g/L/ngàyvớichếđộtừngbướctăngcườngđộchiếusáng(7,5-

Lcaogấp3,09và1,67lầnsovớiphươngphápnuôiliêntụcvàphươngphápnuôifed- batch.Nồngđộastaxanthinđạtgiátrịcaonhấtlà602mg/L.

Nhưvậy,MĐTBcủaloàivitảolụcH.pluvialistrongcáchệthốngnuôikíncóthểtíchkhácn haucósựsaikháclớn.Ởcáchệthốngnuôikíncódungtích1-2L,

MĐTBcóthểđạt7x10 6 TB/mL.Tuynhiên,khităngthểtíchnuôilên800–

25000L,MĐTBchỉduytrìởngưỡng0,5-1x10 6 TB/ mL.Nồngđộvàhàmlượngastaxanthintíchlũyđạtcaonhấtlà602mg/Lvà7%SKK.

Nuôicấydịdưỡngvàtạpdưỡng

ChiếuánhsángcaothườngđượcsửdụngđểtăngcườngtíchlũyastaxanthinởtảoH.pluvi alis.Tuynhiên,sựhấpthụánhsángvàtánxạánhsánggâyrabởibóngcủacáctếbàovớinhautrongnuô itrồngquimôlớncóảnhhưởngnghiêmtrọngđếnnăngsuấtvàchấtlượngsinhkhốivàcácsảnphẩmtừt ảo.Chiphícaochochiếusánglàmộttrở ngại lớn cho việc thương mại hóa các sản phẩm từ tảoH pluvialis Nuôi cấy dịdưỡng có thể áp dụng để khắc phục nhược điểm này Dưới điều kiện nuôi dị dưỡng,ánhsángkhôngcầnthiết,cácchấthữucơcóvaitrònhưnguồncarbonvànănglượngchosự tăngtrưởngvàtổnghợpcácchấtchuyểnhóathứcấpcủatảo.Cácnguồncarbonhữucơnhưacet ateđãđượcsửdụngđểnuôidịdưỡngtảoHaematococcuschosảnxuấtastaxanthin(Hatavàcs,200 1;Kangvàcs,2005).Wanvàcộngsự(2015)báocáođãnuôi thành công vi tảo lụcH pluvialistrong hệ thống lên men 50 L với acetate lànguồn carbon với chế độ nuôi cấy tuần tự dị dưỡng - quang tự dưỡng Với kiểu nuôinày, SKK đạt 26 g/L, MĐTB đạt 7 x 10 6 TB/mL và năng suất sinh khối đạt 64,1mg/L/giờ sau 405 giờ lên men Pang và cộng sự (2017) cũng báo cáo về hiệu quả sửdụngcarbonhữucơ(C5)– riboseđểlàmtăngMĐTBtảoH.pluvialisthôngquacơchếduytrìtrạngtháisinhdưỡngcủatảotron gđiềukiệnnuôitạpdưỡng.

TổnghợpvềMĐTB,năngsuấtsinhkhối;năngsuấtvàhàmlượngastaxanthin tích lũy từ loài vi tảo lụcH pluvialisở các cấp độ nuôi khác nhau đượctrìnhbày ở Bảng1.6.

Tốcđộtíchlũ yastaxanthi n (mg/L/ngày) Điềukiện Hệthốngnuôi

Bểhở,sinhtrưởng2giaiđoạn1quát rình

Yoo và cs.,(2012) 0,047 217,78 - 1,4 Nuôi theo mẻ, môitrườngNIES-C

Nuôi tuần tự Dị dưỡng – phaloãng- cảmứngquangtựdưỡng

Nuôidịdưỡngtrongbìnhlênmen 50L, môi trường NIES –C,nhiệt độ28 o C

HệthốngP h o t o b i o r e a c t o r column(0,3L),nuôitheo mẻ,môi trườngBG11N

5 - - 91,8 - - Ánhsángt r ắ n g : á n h s ángxanh(tỷlệ3:1)ởcườngđ ộsáng7000klux

2016 - 7,06 g/m 2 /ngày 62 4 5,53 [Fe 2+ ]50mM Hệt h ố n g P h o t o b i o r e a c t o r t h i n film25L,bổsungthêmFe 2+

Nângcao hiệuquả sảnxuất astaxanthintừH.pluvialis

Có rất nhiều biện pháp được áp dụng như: lựa chọn tác nhân vật lý thích hợp(ánhs á n g , m ô i t r ư ờ n g d i n h d ư ỡ n g v à p h ư ơ n g p h á p n u ô i ) ; s ử d ụ n g c h ấ t h ó a h ọ c (chất kích thích) hoặc cải biến di truyền để nâng cao hiệu quả tích lũy astaxanthintrongsinh khối vi tảoH.pluvialis.

CO2nhưnguồncarboncũngđãđượccôngbốbởiKangvàcộngsự (2005) Dưới điều kiện cảm ứng quang tự dưỡng và sục CO25%, hàm lượngastaxanthintíchlũyrấtcao(chiếm7%SKK),năngsuấtastaxanthinđạt6,25mg/L/ ngày, giá trị này cao gấp 3,4 lần so với phương pháp cảm ứng dị dưỡng khác.Kếtquảnghiêncứuchothấycảmứngquangtựdưỡngđểsảnxuấtastaxanthinởtảo

Wan và cộng sự (2014a) đã công bố ảnh hưởng của nhiệt độ ban ngày và banđêm lên sinh trưởng và tích lũy astaxanthin ở tảoH pluvialisZY18 Kết quả nghiêncứu thu được cho thấy việc giảm nhiệt độ ban đêm giúp làm giảm sự mất mát sinhkhối vào ban đêm do quá trình quang hô hấp. Nhiệt độ ban ngày duy trì 28 o C vàkiểm soát nhiệt độ ban đêm dưới ngưỡng 28 o C là điều kiện tối ưu để tăng sinhtrưởng và tăng hàm lượng astaxanthin ở tảo này Duy trì khoảng nhiệt độ tối ưu nàycho nuôi tảo ngoài trời, năng suất sinh khối thực của tảo và hàm lượng astaxanthintănggấp 5và 2,9 lầnso vớikhi không kiểmsoát nhiệt độnuôi.

Trong quy trình nuôi cấy 2 pha để sản xuất astaxanthin từ tảoH. pluvialisNIES 144, Wen và cộng sự (2015) đã bổ sung ethanol như là nguồn carbon hữu cơvào môi trường BG11-N để tăng cường tích lũy astaxanthin Kết quả cho thấy, năngsuất astaxanthin đạt cao nhất là 11,26 mg/L/ngày ở nồng độ ethanol 3%, giá trị nàycao gấp 2,03 lần so với công thức đối chứng Như vậy, ethanol có tiềm năng nhưmộttácnhâncảm ứnghiệuquảcho tíchlũyastaxanthinởtảoH.pluvialis.

Mộtbiệnphápkhácđượcápdụnghiệuquảđểtăngcườngtíchlũyastaxanthin ở tảoH pluvialislà sử dụng phương pháp nuôi cấy gắn màng - attachedsystem(Hình 1.10).

(Nguồn:Zhang vàcs, 2014) Ở phương pháp nuôi này, các tế bào sinh dưỡng được nuôi huyền phù trongcáchệthốngnuôiởpha1,sauđóchúngđượclọcđểlưugiữlạitrênmàngsinhhọc

- biofilm nhằm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc với ánh sáng cao trong pha 2 của quátrình nuôi Dưới các điều kiện nuôi tối ưu, năng suất sinh khối và astaxanthin tronghệ thống nuôi gắn cao hơn 2,8 lần (3,7 g/m 2 /ngày) và 2,4 lần (65,8 mg/ m 2 /ngày) sovớihệthốngnuôihuyềnphù(suspendedbioreactor),tươngứng(Wanvàc s , 2014b). Các nghiên cứu khác sử dụng phương pháp này cũng đã được công bố vớinăng suất astaxanthin cao hơn là 124 mg/m 2 /ngày (Yin và cs, 2015) và 164,6mg/m 2 /ngày (Zhang và cs, 2014) Phương pháp nuôi cấy gắn màng có một số ưuđiểm so với phương pháp nuôi cấy huyền phù như lượng nước tiêu thụ thấp hơn,giảm nguy cơ bị tạp nhiễm Đây là một phương pháp nuôi cấy đầy hứa hẹn để tănglợi ích kinh tế và giảm đáng kể chi phí sản xuất astaxanthin từ vi tảoH pluvialis(Zhangvà cs, 2014; Wan và cs,2014b).

Alice và cộng sự (2017) đã nuôi thành công vi tảo lụcH pluvialistrong hệthống màng sinh học lớp kép (Twin layer Biofilm) theo quy trình nuôi cấy 1 pha.Cáctếbàođượccốđịnhtrênmàngvàsinhtrưởngdướiđiềukiệnángsángcao(50 klux) và bổ sung CO2ở nồng độ 1- 10 % có thể đạt năng suất sinh khối khô là 19 g/ m 2 /ngàyvànăng suất astaxanthin đạt 0,39 g/m 2 /ngày. Ảnh hưởng của ion Fe 2+ lên sinh trưởng và tích lũy astaxanthin củaH. pluvialiskhinuôi ngoài trời vào mùa hè đã được Hong và cộng sự (2016) thông báo Các ảnh hưởng bấtlợicủanhiệtđộ caođãlàmgiảmsinhtrưởngvà hạnchếquá trình carotenoidhóa ởt ảonày Việc bổ sung thờm Fe 2+ (nồng độ 50 àM) đó tạo ra phản ứng nhiệtHaber– Weisstrongg i a i đ o ạ n t ế b à o c y s t , g i ú p t ă n g s ả n l ư ợ n g a s t a x a n t h i n t r o n g c á c t ế b à o t ả o nuôi trong điều kiện mùa hè tăng 147% (đạt 5,7 mg/L) so với sản lượng thu đượccủa các tế bào nuôi trong mùa xuân (nhiệt độ 17,5 – 27,3 o C) Kết quả này giúp nângcao hàm lượng astaxanthin tự nhiên của tảoH pluvialisnuôi trồng ở những vùngnắngnóng hay ởtrong các hệthống nuôi kínquy mô lớn.

Bêncạnhbiệnpháplựachọncáctácnhâncảmứngphùhợpvàtốiưuhóaqu á trình nuôi cấy, sinh tổng hợp astaxanthin từ tảoH pluvialiscó thể được tăngcường bằng cách sử dụng các hóa chất khác nhau để kích hoạt hoặc tăng cường sựtăng trưởng tế bào và tích lũy astaxanthin Dựa trên cơ chế tác động, các chất hóahọccóthểđượcphânthànhbốnloại:cácchấtđiềutiếtconđườngsinhtổngh ợp;các chất gây phản ứng stress ôxy hóa; các phytohormones;c á c c h ấ t đ i ề u c h ỉ n h tương tự quá trình trao đổi chất ở tảo và các chất là tiền chất của quá trình chuyểnhóa. Để tăng năng suất astaxanthin, hóa chất là các chất tăng cường trao đổi chấtgần đây cũng đã được nghiên cứu đánh giá Trong nghiên cứu của Lu và cộng sự(2010) đã cho thấy axít gibberellic (GA3) và methyl jasmonate (MJ) đóng vai tròtrong việc điều hòa biểu hiện của gen mã hóa cho enzyme β - carotene oxygenase(BKTs) xúc tác chuyển hóa β-carotene thành canthaxanthin trong con đường sinhtổng hợp astaxanthin Tác giả Gao và cộng sự (2013) cũng đã chứng minh rằng cáchóa chất như axít jasmonic (JA), axít salicylic (SA), GA3, và 2, 4- epibrassinolide(EBR)c ó t h ể t ă n g c ư ờ n g s ả n x u ấ t a s t a x a n t h i n đ ế n 1 , 4 5 8 m g /

L ; 2 , 7 4 m g / L ; 2 , 3 9 mg/Lvà2,26mg/L,tươngứng.Cácnghiêncứusâuhơnvềcơchếphụthuộcnồng độcủachấttăngcườngsựtraođổichấtcũngđãđượctiếnhành.

H pluvialisđã cho thấy: ở nồng độ SA thấp (100 mM) giúp tăng hàm lượngastaxanthin lên 6,8 lần dưới điều kiện chiếu ánh sáng thấp (1,5 klux), trong khi đóđối với chất MJ (nồng độ 10 mM) đã cảm ứng tăng cường tích lũyastaxanthin Tuynhiên, khi bổ sung SA và MJ ở nồng độ cao 500 mM dẫn tới suy giảm về sinhtrưởng và ức chế tích lũy astaxanthin Phân tích cơ chế khác cũng cho thấy bổ sungSA ở nồng độ cao làm tăng hoạt tính của enzyme superoxide dismutase lên 4,4 và3,3 lần; tăng hoạt tính enzyme ascorbate peroxidase (APXs) lên 15,5 và 7,1 lần dướiđiều kiện chiếu ánh sáng thấp và cao, tương ứng Trong khi đó, MJ làm tăng hoạttính của enzyme catalase lên 1,4 lần dưới ánh sáng cao và hoạt tính enzyme APXcao gấp 5,4 lần dưới ánh sáng thấp Điều này cho thấy sự tích lũy astaxanthin thấpcóthể làdo các gốctự do đãbị giảmđi (Raman

Shang và cộng sự (2016) đã sử dụng chất hydroxyanisole butylated (BHA)nhưl à m ộ t c h ấ t c ả m ứ n g h i ệ u q u ả c h o t í c h l ũ y a s t a x a n t h i n ở t ả oH p l u v i a l i s LUGU Ở nồng độ xử lý 2 mg/L BHA, hàm lượng astaxanthin đạt tối đa là 29,03mg/gSKK,cao gấp2,03 lầnso vớiđối chứngsau 12ngày sinhtrưởng.

Sử dụng chất axit 1-aminocyclopropane-1-cacboxylic (ACC), một tiền chấtcủa etylen (thường được biết đến như một hormone gây già hóa ở thực vật) để tăngcường tích lũy astaxanthin ở tảoH pluvialisđã được Lee và cộng sự (2016) côngbố ACC giúp tăng cường sản xuất astaxanthin gián tiếp thông qua kích thích sinhtrưởng của tảo Ở nồng độ ACC 1 mM bổ sung, hàm lượng astaxanthin tăng gấp 1,8lần(đạt giá trị40 mg/g SKK) sovới công thứcđối chứng.

Ngoài phytohormones và các chất chất tăng sự trao đổi chất, các hóa chấtkhác có khả năng gây phản ứng ôxy hóa để tăng cường sinh trưởng của tảo và tíchlũycáchợpchấtthứcấpcógiátrịđãđượcnghiêncứu.Mộtsốnghiêncứutrư ớcđây đã cho thấy khi có mặt Fe 2+ , xanh methylene (MB) đã tạo ra ôxy singlet

H2O2v à 2 , 2 ' - a z o -bis( 2 - a m i d i n o p r o p a n e )- d i h y d r o c h l o r i d e ( A A P H ) ; g ố c t ự d o peroxy(AO2 ⋅),cácchấtnàycókhảnăn gkíchhoạtsinhtổnghợpastaxanthinởtảo

H.pluvialis,trongđóFe 2+ cóvaitrònhưlàmộtnguồncungcấpHO ⋅q u a mộtphản ứngxúctácsắt(Fenton)(Yuvàcs,2015).

Vi tảo lục nhân chuẩn là một đối tượng khó để cải biến di truyền Kỹ thuật ditruyền của vi tảo sử dụng trên hơn 30 chủng của các loài khác nhau đã được côngbố,baogồmcảHaematococcus(Radakovitsvàcs,2010;Forjánvàcs,2015).

Nghiên cứu của Kim và cộng sự 2006 đã cho thấy các gen liên quan đến điềukiện bất lợi của môi trường nuôi đối vớiH lacustrisđược hoạt hoá mạnh trong cáctế bào nang đỏ dưới điều kiện chiếu bức xạ cao và đói dinh dưỡng, từ đó có thể dẫnđến tăng sản lượng astaxanthin tích lũy được ỞH pluvialis,các gen mã hóa choBKT và CHY được nhân dòng và đã nghiên cứu mức độ biểu hiện của các gen này.Kết quả cho thấy biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợpcarotenoid chỉ tăng biểu hiện ở mức độ mRNA hoặc mức độ protein, hoặc cả hai(Vidhyavathi và cs,

2008) Cho đến nay ở tảoH pluvialis, mặc dù một số gen sinhtổngh ợ p a s t a x a n t h i n đ ã đ ư ợ c n h â n d ò n g , t u y n h i ê n , c ơ s ở p h â n t ử c ủ a q u á t r ì n h sinhtổnghợp astaxanthinởH.pluvialisvẫn chưađượccông bốchi tiết.

Phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên bằng hóa chất hoặc UV giúp tăng khảnăng tích lũy astaxanthin ở tảoH pluvialis(Hu và cs, 2008; Gomez và cs, 2013).Nhìnchung, độtbiếnhóahọc phùhợphơn chocảibiếnditruyền ởH plu vialis.Cáchóachấtđiểnhìnhđượcsửdụngđểgâyđộtbiếnbaogồmetylmethanesulphonate (EMS) và Methylnitronitrosoguanidine (MNNG) Nguyên tắcsàng lọc dựa vào việc xác định các khuẩn lạc có khả năng sống sót hoặc phát triểntốt trong môi trường có bổ sung các chất đột biến ở nồng độ ức chế kết hợp với chếđộ chiếu sáng cao Các khuẩn lạc sống sót sẽ có khả năng tổng hợp carotenoid cao.Tế bàoHaematococcusđột biến MT 2877 siêu tích lũy astaxanthin đã được Hu vàcộng sự (2008) công bố Trong giai đoạn đầu sinh trưởng, dòng MT 2877 giống hệtdònghoangdãvềhìnhtháitếbàovàcácđặcđiểmsinhlýhọc.Tuynhiên,ởgiai đoạn thứ 2 (giai đoạn tích lũy astaxanthin dưới điều kiện bất lợi), các tế bào dòngđột biến cho khả năng tích lũy astaxanthin cao gấp 4 lần so với chủng hoang dại.CácnghiêncứucủaWangvàcộngsự(2005)đãtạorađược2chủngH.pluvia lisđột biến MT 537 và MT 2978 bằng đột biến hoá học làm mất thành tế bào ChủngHaematococcushoang dại có thành tế bào dày và cứng nhắc, làm giảm đáng kể khảnăng sử dụng astaxanthin ở người và động vật nuôi so với tế bàoHaematococcusđãđược xử lý tế bào bằng hóa học hay vật lý trước đó Các đột biến về thành tế bào đãnângcao khảnăng sử dụngtảo này ởngười và độngvật nuôi.

3giaiđoạn(chiếutiaUV,sửdụngchấtgâyđộtbiếnEMSvàchấtứcchếdiphenylamine (DPA)) để tăng cường tích lũy astaxanthin Kết quả cho thấy sảnlượng astaxanthin ở chủng đột biến đạt 47,21 mg/g SKK, cao gấp 1,7 lần so vớichủnghoang dại.

TháchthứcsảnxuấtastaxanthinthươngmạitừtảoH pluvialis 35

TảoHaematococcusđã được nuôi trồng ở quy mô thương mại từ năm 2000 đểlàm thực phẩm chức năng ở Cyanotec corperation USA, Mera pharmaceuticals IncUSA Theo nguồn FAO (2010), khối lượng SKK hàng năm củaH. pluvialisđạtkhoảng 300 tấn, chủ yếu được sản xuất từ Hoa Kỳ, Ấn Độ và Israel.

Các sản phẩmchứaastaxanthinđượcsảnxuấttừloàivitảonàycủacáccôngtyParryPharmaceutical s (India), AlgaTechnologies (Israel) có giá 10.000 USD/kg Ở TrungQuốc, loài vi tảo này được dùng để sản xuất astaxanthinl ớ n n h ấ t ở G i a n g C h â u , tỉnhHồ Bắc (Lovatelli & Chen, 2009).

DothànhtếbàocystcủavitảolụcH.pluvialisdàynênđểkhaithácastaxanthin hiệu quả từ loài tảo này cần có phương pháp thu hồi astaxanthin triệt để.Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau được áp dụng để thu hồi sản phẩm nàynhư: sử dụng hệ dung môi hữu cơ, dầu ăn, enzyme, sóng siêu âm hay phương phápCO2siêu tới hạn Trong đó, phương pháp

CO2siêu tới hạn là hiệu quả nhất do

CO2trơv ề m ặ t h ó a h ọ c , t ư ơ n g đ ố i r ẻ , k h ô n g đ ộ c h ạ i v à ổ n đ ị n h ; t h ờ i g i a n t á c h c h i ế t ngắn và nhiệt độ chiết thấp giúp bảo vệ các hoạt tính quí của sản phẩm (Shah và cs,2016).

Tuy nhiên, còn tồn tại nhiều thách thức và các vấn đề khó khăn gặp phải trongviệc sản xuất sinh khối tảo giàu astaxanthin ở quy mô lớn từ tảoH pluvialiscụ thểnhưsau:

 Thiếup h ư ơ n g p h á p h i ệ u q u ả đ ể n g ă n n g ừ a h o ặ c x ử l ý n h i ễ m v i s i n h v ậ t trongmôi trường nuôi cấyở quy mô thương mại;

 Tế bào tảo có tốc độ sinh trưởng chậm, có vòng đời phức tạp và tế bào nhạycảmvới các tác động bấtlợi của môi trường;

 Thiếu công nghệ tách chiết và chi phí cao cho việc nuôi trồng, làm khôastaxanthin ở quy mô thương mại;

 Không sẵn có các chủngH pluvialisđã được cải biến di truyền và các côngcụ cải biến di truyền theo con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở vi tảo lụcH.pluvialisnày để nâng caosản xuất astaxanthin;

 Thiếunhững nghiên cứukhoahọc đầyđủvề hiệuquả kinhtếvà đánhgiá khả năng sản xuất astaxanthin từ tảoH pluvialisở qui mô thương mại (Shah và cs,2016).

ỨngdụngsinhkhốitảoH.pluvialistrongnuôitrồngthủysản… 36

Trong 20 năm qua, astaxanthin tổng hợp đã được sử dụng rộng rãi để làmtăng sắc tố của cá (chiếm 95% nhu cầu thị trường) Nó tạo màu hồng đặc trưng chocá hồi, cá tráp và tôm (Jin và cs, 2006) Trên thế giới, astaxanthin có giá khoảng2500 USD/kg với doanh số ước đạt 200 triệu USD/năm Trong NTTS, chi phí choviệc bổ sung astaxanthin vào nguồn thức ăn chiếm 10 - 20% chi phí sản xuất thứcăn.

Astaxanthin được sản xuất từ tảoH pluvialiscó tiềm năng lớn trong ngànhcông nghiệp NTTS do nhu cầu ngày càng tăng đối với các sản phẩm tự nhiên này.Cơq u a n T h a n h t r a t h ự c p hẩ m C a n a d a và C ụ c q u ả n l ý t h ự c p h ẩ m v à d ư ợ c p hẩ m Hoa Kỳ đã chấp thuận việc sử dụng tảo này như một chất màu phụ gia trong thức ăncáhồi.AstaxanthintừtảoH.pluvialisđãđượcchứngminhlàchấtantoànvàhiệu quả cho màu sắc thịt của cá (Tolasa và cs, 2005) Bổ sung sinh khối tảoH. pluvialisgiàu astaxanthin vào thức ăn đã dẫn đến lắng đọng đáng kể astaxanthin trong thịt vàda, tăng cường màu sắc thịt, tăng cường hệ thống chống ôxy hóa, tăng chất lượngtrứng cá, giúp tăng trưởng tốt hơn và tăng tỷ lệ sống sót của cá bột một số loài cánhư cá hồi, cá tráp biển và cá hồi Vân (Sheikhzadeh và cs, 2012a, b); các loài cácảnh (Amar và cs, 2001) và tôm (Parisenti và cs, 2011) Một nghiên cứu gần đây đãchỉ ra rằng chế độ ăn bổ sung tảoH pluvialisđã cải thiện tốc độ tăng trưởng của cáĐù Vàng (yellow croaker) tốt hơn chế độ ăn bổ sung astaxanthin tổng hợp (Li và cs,2014).

Nghiên cứu của Pham và cộng sự (2014) về ảnh hưởng của nguồn carotenoid(astaxanthintổnghợphóahọc,astaxanthinchiếtxuấttừcâyớtvàtừtảoH pluvialis) lên sinh trưởng, màu sắc da, hoạt tính chống ôxy hóa và thành phần hóahọc của ấu trùng cá Bơn (Paralichthys olivaceus) đã được công bố Kết quả chothấy,sửdụngnguồnastaxanthintừtảoH.pluvialisởnồngđộ100m g astaxanthin/kg thức ăn cho hiệu quả cao hơn 2 nguồn carotenoid còn lại ở tất cả cácthôngsố kiểm nghiệm.

Thử nghiệm của Negre-Sadargues và cộng sự (1993) bổ sung sắc tố vào thứcăn nuôi cá hồi với 3 nghiệm thức khác nhau gồm: astaxanthin 100 mg/kg thức ăn,canthaxanthin 100 mg/kg thức ăn và một hỗn hợp 100 mg của astaxanthin vàcanthaxanthin.Kếtquảchothấyrằngchếđộănbổsungastaxanthinchophéptícht ụastaxanthintrong thịtcaohơn128%sovớicanthaxanthinvàcao hơn135%s ovới hỗn hợp astaxanthin - canthaxanthin Tuy nhiên, nghiên cứu của Nihat và cộngsự(2011)lạichothấykhichocáănthứcăncóbổsungastaxanthinv à canthaxanthin với các công thức khác nhau trong cùng một khoảng thời gian thì sựtích tụ astaxanthin trong thịt cá nhiều hơn canthaxanthin nhưng về màu sắc thịt thìthức ăn có chứa astaxanthin không đậm bằng canthaxanthin Điều này cho thấy sựtích tụ nhiều không đồng nghĩa với màu sắc thịt sẽ đậm hơn Hàm lượng astaxanthinbổ sung vào thức ăn còn phụ thuộc vào màu đỏ mong muốn của cơ thịt cá. NghiêncứuTorrissenvàcộngsự(1990)đãchỉrarằngcáhồicần50-

60mgastaxanthin trong 1 kg thức ăn hoặc có thể cao hơn và 190 mg canthaxanthin/kg thức ăn để cungcấp đầy đủ sắc tố đỏ dùng trong 10 tuần Nghiên cứu trên cá hồi Vân trong nướcngọt và nước mặn đã chỉ ra rằng tích tụ canthaxanthin trong thịt của cá hồi chưatrưởng thành tăng khi nồng độ canthaxanthin trong thức ăn tăng từ 0 đến 200 mg/kgthức ăn Tuy nhiên, với hàm lượng canthaxanthin cao hơn 50 mg/kg thức ăn thì tỷ lệtíchtụlạigiảmđi, nguyênnhânlàdonồngđộcanthaxanthin trongcơthịtcáhồ iVânđangdầnđạtđiểmbãohòa(Torrissenvàcs,1990;Choubertvàcs,1998).

Nguyễn Thị Trang và cộng sự (2013) cũng báo cáo rằng khi bổ sung hỗn hợpastaxanthin và canthaxanthin ở tỷ lệ khác nhau vào thức ăn nuôi cá hồi Vân thì màusắc cơ thịt cá hồi Vân đỏ đẹp nhất khi sử dụng thức ăn có bổ sung astaxanthin vàcanthaxanthin với tỷ lệ 40 mg/kg astaxanthin + 40 mg/kg canthaxanthin và cao hơnsovớinghiệmthứcsửdụngtỷlệ60mg/kgastaxanthin+20mg/kgcanthaxant hinvà80 mg/kg astaxanthin.

Jagruthivàcộngsự(2014)đãthôngbáovềảnhhưởngcủanồngđộastaxanthinbổsu ng(daođộngtừ0,25,50,và100mg/ kgthứcăn)vàotrongthứcănc ơ b ả n n h ằ m t ă n g k h ả n ă n g m i ễ n d ị c h v à k h á n g b ệ n h ở c á K o i (Cyprinuscarpio).Kếtquảchothấykhicáănvớithứcăncóbổsung

50và100mgastaxanthin/kg thức ăn, tỷ lệ tử vong giảm xuống còn 10-20%, các tế bào máu đỏ,các tế bào máu trắng, hemoglobin và giá trị hematocrit, hoạt tính lysozyme huyếtthanh và hoạt tính diệt khuẩn gia tăng đáng kể, giúp thúc đẩy sự tăng trưởng và điềuchỉnhhệthốngmiễndịchtrongC. carpiochốnglạiAeromonashydrophila.

Hiện nay ở trong nước, loài vi tảo này mới được nghiên cứu và có những kếtquảbướcđầuvềtốiưuđiềukiệnnuôitrồngcũngnhưtíchlũyastaxanthincaonhất.

Tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tác giảNguyễnThịHườngvàcộngsự(2008)đãnghiêncứuastaxanthintừcác chủn gvitảoH a e m a t o c o c c u s p h â nl ậ p ở V i ệ t N a m N h ó m t á c g i ả đ ã t u y ể n c h ọ n đ ư ợ c 5 chủngHaematococcuskí hiệu là H1, H3, H4, H7 và H8 có khả năng sinh tổng hợpastaxanthin.T r o n g đ ó c h ủ n g H 1 c h o h à m l ư ợ n g a s ta x a n t h i n ca o n h ấ t l à 0,

Chủng vi tảo này đã được xác định tên khoa học chính xác làHaematococcuspluvialisdựa vào trình tự gen 18SrRNA

PhòngCôngnghệTảo,ViệnCôngnghệsinhhọc,ViệnHànlâmKhoahọc và Công nghệ Việt Nam cũng bước đầu nghiên cứu sâu ở loài tảo này và đã có mộtsố công bố nghiên cứu thành công ban đầu như phân lập được các loài tảo thuộc chiHaematococcustại một số ao hồ nước ngọt của Việt Nam và chúng được lưu giữtrong môi trường C ở Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệsinh học; lựa chọn được môi trường tối ưu cho sinh trưởng của tảoH pluvialis(Đặng Diễm Hồng và cs, 2010) hay đưa ra được các điều kiện về môi trường tối ưunhư pH, nhiệt độ, ánh sáng…

Từ các nghiên cứu bước đầu đã chỉ ra được môitrường tối ưu nuôi tảoH. pluvialisđạt mật độ cao nhất là môi trường RM có MĐTBđạt caonhất là5 , 0 7 x 1 0 5 TB/mL Nghiên cứu về vòng đời của tảoH pluvialisc ũ n gđã được công bố(Đinh Đức Hoàng và cs, 2011) Tuy nhiên, trong các điều kiện thínghiệm đã được nghiên cứu, MĐTB tảo mới chỉ đạt gần 1 triệu TB/mL Do vậy,việc tìm kiếm các điều kiện nuôi trồng cho tảoH pluvialisđạt được MĐTB cao đến4 triệu TB/mL và hàm lượng astaxanthin chiếm 4% SKK là nhiệm vụ cần giải quyếthiện nay để cung cấp sinh khối tảo giàu astaxanthin làm thức ăn bổ sung cho một sốđốitượng NTTS ở Việt Nam.

Nhằm góp phần tham gia giải quyết những vấn đề nêu trên, chúng tôi đã lựachọn đề tài“ Nghiên cứu đặc điểm sinh học của loài vi tảo lục

Haematococcuspluvialis Flotow giàu astaxanthin để ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản ”vớimục tiêu chính là lựa chọn và nuôi trồng thành công loài vi tảo lục nước ngọtH.pluvialisphân lập tại Việt Nam có tốc độ sinh trưởng nhanh, hàm lượng astaxanthincao để ứng dụng làm thức ăn trong NTTS Chúng tôi cũng hy vọng rằng những kếtquả nghiên cứu thu được trong đề tài này sẽ đóng góp những số liệu khoa học cơbản, cung cấp những cơ sở khoa học cho việc lựa chọn thích hợp nuôi trồng 2 phaloài vi tảo nêu trên nhằm thu được sinh khối tảo giàu astaxanthin làm thức ăn cho cáhồivà cá cảnh trong thờigian tới ở Việt Nam.

Các chủng vi tảo thuộc chiHaematococcusđược sử dụng trong nghiên cứuthuộc tập đoàn giống vi tảo quang tự dưỡng của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Côngnghệ sinh học Các chủng tảo này được phân lập tại các hồ nước ngọt tại tỉnh LàoCai, Hòa Bình, Tam Đảo, Thái Nguyên và Lâm Đồng của Việt Nam (được lưu giữtrongbộsưutậpgiốngvớikýhiệutươngứnglàHaematococcussp.TN4,TN 8,TĐ0 1 , T Đ 0 8 , L C , L C 0 5 , L C 0 6 , H B , L Đ ) C á c m ẫ u t ả o đ ư ợ c l ư u g i ữ ổ n đ ị n h trong môi trường C lỏng dưới điều kiện nuôi 25 o C, cường độ chiếu sáng 1,5 klux,chukỳ sáng:tối là 12: 12 giờ.

Kit Wizart SV clean-up (Promega) để tinh sạch ADN, kit tách dòng TOPOTACloning ® k i t (Invitrogen TM ),k it làmphả nứ ng xá cđ ịn h trình tự AB

IP ri sm ® Big Dye ® Terminator v3.1 cycle sequencing (Applied) Kít tinh sạch sản phẩm

PCR(GenjetPurification,ThermoScientific TM (EU)),kíttáchchiếtARNtổngs ố RNAiso Plus (Takara, Tokyo, Nhật Bản), kít tổng hợp cDNA (RevertAid FirstStrandcDNA -Thermo Fisher ScientificInc., Singapore).

CáhồiVân(Oncorhynchusmykiss)đượcnuôivàcungcấpbởiTrạicánướclạnhBảnChu Va,côngtyCổphầnThủyđiệnChuVa,huyệnTamĐường,tỉnhLaiChâu.

Cá Koi Nhật (Cyprinus carpio) do Trung tâm Quốc gia giống thủy sản nướcngọtmiền Bắc,Viện nghiêncứu Nuôitrồng Thủysản Icung cấp.

Các hóa chất dùng để giữ giống và pha môi trường nuôi tảo như: C, RM,OHM và BG11 - cải tiến (BG11 - mod); các vitamin B12, Biotin (VTM H), Thiamin(VTMB1) đều doTrung Quốc và ViệtNam sản xuất.

Cáchóa chấtsử dụng chotách chiếtprotein vàsắc tố: aceton90%, NaCl0,01 và 1M, Na2CO3, NaOH 0,1N, CuSO4trong dung dịch natri kalitactrat, thuốc thửFolin(natri1,2-naphtoquinon-4- sunfonat),albuminchuẩnđềudoViệtNamvàTrungQuốc sản xuất.

Hóa chất dùng để tách chiết lipít và nhuộm tế bào: chloroform, methanol, n- hexan, Na2SO4,thuốc nhuộm Nile Red (9-(Diethylamino)-5H benzo [α] phenoxazin-α] phenoxazin-5- one)do Sigma -Aldrich (Mỹ) sản xuất.

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR gồm đệm MgCl2, dNTPs,TaqDNApolymerase.V e c t o r t á c h d ò n g p J E T ( d o h ã n g F e r m e n t a s c u n g c ấ p ) , v e c t o r t á c h dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.Tế bào khả biếnE coliDH5-α do Phòng Công nghệ ADN ứng dụng cung cấp Cặpmồi Alex 18F-U18R, CHY F-R được dùng để nhân gen 18S rRNA và genchydoPhòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học ViệtNamthiết kế vàđược công ty Invitrogen(Mỹ) tổng hợp.

Các hóa chất dùng để cố định mẫu như glutaraldehyde, formol và ethanol doTrungQuốc sản xuất.

Vật liệu

Vậtliệu

Các chủng vi tảo thuộc chiHaematococcusđược sử dụng trong nghiên cứuthuộc tập đoàn giống vi tảo quang tự dưỡng của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Côngnghệ sinh học Các chủng tảo này được phân lập tại các hồ nước ngọt tại tỉnh LàoCai, Hòa Bình, Tam Đảo, Thái Nguyên và Lâm Đồng của Việt Nam (được lưu giữtrongbộsưutậpgiốngvớikýhiệutươngứnglàHaematococcussp.TN4,TN 8,TĐ0 1 , T Đ 0 8 , L C , L C 0 5 , L C 0 6 , H B , L Đ ) C á c m ẫ u t ả o đ ư ợ c l ư u g i ữ ổ n đ ị n h trong môi trường C lỏng dưới điều kiện nuôi 25 o C, cường độ chiếu sáng 1,5 klux,chukỳ sáng:tối là12: 12 giờ.

Các bộkít sinhphẩm