Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LƯU THỊ TÂM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠO SINH KHỐI GIÀU ASTAXANTHIN CỦA LOÀI VI TẢO LỤC Haematococcus pluvialis FLOTOW NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LƯU THỊ TÂM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠO SINH KHỐI GIÀU ASTAXANTHIN CỦA LOÀI VI TẢO LỤC Haematococcus pluvialis FLOTOW NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: PGS TS Đặng Diễm Hồng, ngun Trưởng phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - người thầy định hướng, bảo kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ động viên tơi vượt qua trở ngại khó khăn suốt thời gian thực luận án Ban Lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học (ThS Bùi Thị Hải Hà – phụ trách đào tạo), Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp tơi hồn thành thủ tục cần thiết trình làm nghiên cứu Sự giúp đỡ, bảo tận tình cô chú, anh chị, bạn đồng nghiệp làm việc phịng Cơng nghệ Tảo: TS Ngơ Thị Hoài Thu, TS Hoàng Thị Lan Anh, TS Hoàng Thị Minh Hiền, ThS Lê Thị Thơm, ThS Nguyễn Cẩm Hà, ThS Đinh Đức Hồng, ThS Bùi Đình Lãm, ThS Đinh Thị Ngọc Mai, ThS Nguyễn Thị Thu Thủy, KTV Đỗ Thị Là Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu Luận án thực khuôn khổ đề tài cấp Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn “Nghiên cứu công nghệ nuôi vi tảo Haematococcus pluvialis công nghệ chiết xuất astaxanthin” 2010 – 2013 thuộc Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực thủy sản ThS Ngơ Thị Hồi Thu làm chủ nhiệm đề tài cán trẻ cấp Viện Cơng nghệ sinh học “Tách dịng gen mã hóa cho tổng hợp astaxanthin - carotenoid hydroxylase (CHY) từ vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin” năm 2016 tơi làm chủ nhiệm Xin cảm ơn Ơng Vũ Văn Cảnh - Công ty Cổ phẩn Thủy điện Chu Va, huyện Tam Đường, tỉnh Lai Châu giúp đỡ luận án thực thí nghiệm cá hồi ni Công ty Tôi xin chân thành cám ơn ThS Võ Văn Bình - Viện Ni trồng thủy sản giúp đỡ thực thí nghiệm cá Koi Nhật Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp - người bên cạnh, khuyến khích ủng hộ tơi suốt q trình thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả Lưu Thị Tâm i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Nếu có sai sót tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm./ Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2017 Lưu Thị Tâm ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………… CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 1.1 Giới thiệu chung astaxanthin………………………………… 1.1.1 Đặc điểm chung…………………………………………………… 1.1.2 Cấu trúc astaxanthin…………………………………………… 1.1.3 Sinh tổng hợp astaxanthin………………………………………… 1.1.4 Các nguồn cung cấp astaxanthin…………………………………… 1.1.5 Sinh hóa học astaxanthin……………………………………… 12 1.1.6 Đặc tính chống ơxy hóa astaxanthin…………………………… 12 1.1.7 Ứng dụng astaxanthin………………………………………… 13 1.2 Giới thiệu chung chi vi tảo lục Haematococcus……………… 16 1.2.1 Vị trí phân loại phân bố………………………………………… 16 1.2.2 Các loài Haematococcus………………………………………………… 16 1.2.3 Đặc điểm sinh học đặc điểm hình thái…………………………… 17 1.2.4 Thành phần sinh hóa học tảo H pluvialis………………………… 19 1.2.5 Quy trình sản xuất astaxanthin H pluvialis………………………… 21 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất astaxanthin từ H pluvialis 21 1.3 Tình hình nghiên cứu công nghệ nuôi trồng tảo H pluvialis cho sản xuất astaxanthin………………………………………………… 22 1.3.1 Nuôi cấy quang tự dưỡng…………………………………………… 23 1.3.2 Nuôi cấy dị dưỡng tạp dưỡng…………………………………… 28 1.3.3 Nâng cao hiệu sản xuất astaxanthin từ H pluvialis……………… 30 1.4 Thách thức sản xuất astaxanthin thƣơng mại từ tảo H pluvialis 35 1.5 Ứng dụng sinh khối tảo H pluvialis nuôi trồng thủy sản… 36 1.6 Tình hình nghiên cứu ni trồng tảo H pluvialis Việt Nam 38 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Vật liệu……………………………………………………………… 40 2.1.1 Vật liệu……………………………………………………………… 40 2.1.2 Các kít sinh phẩm……………………………………………… 40 iii 2.1.3 Động vật thí nghiệm………………………………………………… 40 2.1.4 Hóa chất…………………………………………………………… 40 2.1.5 Máy móc thiết bị……………………………………………… 41 2.1.6 Môi trường nuôi cấy……………………………………………… 42 2.1.7 Địa điểm nghiên cứu……………………………………………… 42 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………… 42 2.2.1 Các phương pháp liên quan đến sàng lọc, định tên khoa học chủng vi tảo lục Haematococcus sp HB.…………………………… 2.2.2 Các phương pháp liên quan đến sinh trưởng, đặc điểm sinh học chủng vi tảo lục Haematococcus sp HB…………………………… 2.2.3 42 45 Các phương pháp liên quan đến sử dụng sinh khối chủng HB giàu astaxanthin cho cá hồi Vân cá Koi Nhật………………………… 48 2.3 Bố trí thí nghiệm…………………………………………………… 49 2.3.1 Nghiên cứu thay đổi hình thái, kích thước tế bào vịng đời chủng Haematococcus pluvialis HB cấp độ bình tam giác 250 – 1000 mL bình nhựa 1,5 10 L……………………………….…… 2.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng chủng Haematococcus pluvialis HB điều kiện phịng thí nghiệm………………………………………………………………… 2.3.3 50 Nghiên cứu điều kiện ni thích hợp cho sinh trưởng tảo Haematococcus pluvialis HB đạt MĐTB cao 2.3.4 49 51 Nghiên cứu điều kiện ni cấy tối ưu cho tích lũy astaxanthin tảo Haematococcus pluvialis HB pha 53 2.3.5 Thu hoạch sinh khối tảo…………………………………………… 55 2.3.6 Sử dụng sinh khối chủng vi tảo lục Haematococcus pluvialis HB 2.4 3.1 làm thức ăn cho cá Koi Nhật cá hồi Vân……………………… 56 Xử lý số liệu………………………………………………………… 57 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………… 58 Sàng lọc đặc điểm sinh học chủng vi tảo tiềm cho sản xuất astaxanthin………………………………… 58 iv 3.1.1 Sàng lọc chủng vi tảo tiềm cho sản xuất astaxanthin……… 3.1.2 Định tên khoa học mức độ phân tử dựa vào đọc so sánh trình tự gen 18S rRNA…………………………………………… 3.1.3 64 Sự thay đổi hình thái kích thƣớc tế bào vòng đời H pluvialis HB…………………………………………………… 3.2 60 Tách dịng phân tích trình tự gen mã hóa cho enzyme carotenoid hydroxylase (CHY)…………………………………… 3.1.4 58 67 Nuôi trồng vi tảo lục H pluvialis HB giàu astaxanthin hệ thống khác nhau………………………………………………… 75 3.2.1 Nuôi cấy vi tảo lục H pluvialis HB pha 75 3.2.2 Điều kiện tối ưu cho tích lũy astaxanthin chủng HB pha 91 3.3 Thử nghiệm bổ sung sinh khối tảo H pluvialis HB giàu astaxanthin cho cá Koi Nhật cá hồi Vân……………………… 107 3.3.1 Đánh giá chất lượng sinh khối tảo H pluvialis HB………………… 107 3.3.2 Thử nghiệm thức ăn có phối trộn astaxanthin từ sinh khối tảo H 4.1 pluvialis HB lên màu sắc cá Koi Nhật cá hồi Vân………… 108 CHƢƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 117 Đặc điểm sinh học chủng Haematococcus sp HB lựa chọn đƣợc…………………………………………………………… 4.2 Nuôi trồng vi tảo lục H pluvialis HB giàu astaxanthin hệ thống khác 4.3 117 120 Sử dụng sinh khối tảo H pluvialis HB giàu astaxanthin nuôi trồng thủy sản……………………………………………… 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………… 132 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ 134 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH…………………… 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 140 PHỤ LỤC…………………………………………………………… v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết Tên đầy đủ Tên Tiếng Việt tắt AAPH 2,2'-Azobis (2-amidinopropane) 2,2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride ACC dihydrochloride 1-aminocyclopropane-1-cacboxylic acid Axit 1-aminocyclopropane-1cacboxylic APXs Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase ARA Arachidonic acid Axít arachidonic BHA Hydroxyanisole butylated Hydroxyanisole butylated BKT β - carotene oxygenase β - carotene oxygenase CHY β -carotene hydroxylase β -carotene hydroxylase C/N Carbon/nitrogen Các bon/nitơ DHA Docohexanenoic acid Axít docohexanenoic DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic DPA Docosanpentaenoic acid Axít docosanpentaenoic E coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli EMS Etyl methanesulphonate Etyl methanesulphonate EPA Eicosapentaenoic acid Axít eicosapentaenoic EPR 2, 4-epibrassinolide 2, 4-epibrassinolide GA3 Gibberellic acid Axít gibberellic HB Hịa Bình Hịa Bình HTNK Hệ thống ni kín Hệ thống ni kín HTNH Hệ thống ni hở Hệ thống ni hở JA Jasmonic acid Axít jasmonic LB Lauria Betani Mơi trường LB MB Methylene Blue Xanh methylene MĐTB Mật độ tế bào Mật độ tế bào vi MJ Methyl jasmonate Methyl jasmonate MNNG Methylnitronitrosoguanidine Methylnitronitrosoguanidine MV Methyl viologen Methyl viologen NTTS Nuôi trồng thủy sản Nuôi trồng thủy sản ORAC Oxygen radical absorbance capacity Chỉ số đánh giá khả chống ơxy hóa chất PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp ROS Reactive oxygen species phân tử xy có hoạt tính rRNA Ribosomal ribonucleic acid ARN riboxom SOD Superoxide dismutase Super oxide dismutase SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét SKK Sinh khối khô Sinh khối khô TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TB Tế bào Tế bào vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 1.4 Bảng 1.5 Bảng 1.6 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Trang Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau……………………… 10 So sánh hiệu phương pháp sản xuất astaxanthin khác nhau……………………………………………………………… 11 Thành phần dinh dưỡng tảo H pluvialis giai đoạn sinh trưởng khác nhau……………………………………………… 20 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo lục H pluvialis………………………………………………… So sánh số thông số kiểu nuôi trồng tảo khác nhau… Nuôi trồng vi tảo lục H pluvialis hệ thống nuôi khác nhau…………………………………………………………… Bảng thống kê tỷ lệ phần trăm tương đồng (ma trận tam giác trên) khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dưới) đoạn gen 18S rRNA loài thuộc chi Haematococcus………… Bảng hệ số tương đồng trình tự nucleotide gen chy loài H pluvialis HB loài Haematococus ngân hàng gen Quốc tế……………………………………………………… Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a vi tảo H pluvialis HB giai đoạn sinh trưởng khác nhau………………………… Bảng so sánh thông số sinh trưởng tảo H pluvialis HB môi trường nuôi cấp độ nuôi khác nhau…… Sự thay đổi pH nhiệt độ hệ thống bể hở kín……… Sinh trưởng chủng HB HTNK 26 L…………………… Sinh trưởng chủng HB HTNK 50 100 L…… Thành phần dinh dưỡng, kim loại nặng, vi sinh vật tổng số hàm lượng astaxanthin sinh khối tảo H pluvialis HB nuôi trồng dùng để phối trộn với thức ăn nuôi cá hồi Vân …… Đánh giá người có lứa tuổi giới tính khác màu sắc cá giai thí nghiệm giai đối chứng……………… Sinh trưởng cá hồi Vân lơ đối chứng thí nghiệm khác Thành phần dinh dưỡng, hàm lượng kim loại nặng thịt cá hồi Vân lô thức ăn khác nhau…………………………… Hàm lượng lipít thành phần axít béo thịt cá hồi Vân lơ thí nghiệm đối chứng……………………………………… 22 23 29 63 66 70 77 85 87 90 107 109 111 114 115 viii 14/ Phụ lục 14 Vịng đời chủng HB bình tam giác 1000 mL mơi trường RM Hình P9 Một số hình ảnh đặc trưng giai đoạn vịng đời H pluvialis HB ni bình tam giác 1000 mL môi trường RM   15/ Phụ lục 15 Vịng đời chủng HB bình nhựa 1,5 lít mơi trường RM Hình P10 Một số hình ảnh đặc trưng giai đoạn vòng đời H pluvialis HB ni bình tam giác 1,5 lít mơi trường RM     11 16/ Phụ lục 16 Vịng đời chủng HB bình nhựa 10 lít mơi trường RM Hình P11 Một số hình ảnh đặc trưng giai đoạn vịng đời H pluvialis HB ni bình tam giác 10 lít mơi trường RM   17/ Phụ lục 17 Nuôi trồng VTL H pluvialis HB qui mô nuôi cấy khác A   B   C   D   Hình P12 Ni trồng H pluvialis HB môi trường dinh dưỡng quy mô khác nhau: bình tam giác 250 (A), 500 mL (B), 1,5 L (C) 10 L (D) 12   18/ Phụ lục 18 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng chủng HB Hình P13 Hình ảnh minh họa tảo cơng thức nhiệt độ sau 30 ngày thí nghiệm 19/ Phụ lục 19 Ảnh hưởng pH môi trường lên sinh trưởng chủng HB A B Hình P14 Ảnh hưởng mơi trường RM có pH khác lên sinh trưởng chủng HB sau ngày (A) 30 ngày (B) thí nghiệm 13   20/ Phụ lục 20 Ni chủng HB hệ thống ni kín 26 L Hình P15 Hình ảnh minh họa trình ni chủng HB hệ thống kín 26 L chiếu ánh sáng cao kết hợp với UV 21/ Phụ lục 21: Ni chủng HB hệ thống kín 50 100 L 1N 2N 3N A B Hình P16 Hình ảnh minh họa cho việc ni thành cơng chủng HB hệ thống 50 100 L A- hệ thống 50 L; B- hệ thống 100 L 14   22/ Phụ lục 22 Ảnh minh họa thí nghiệm chuyển đỏ vi tảo lục H pluvialis HB hệ thống kín 26, 50 100 L           26 L 50 L 100 L             50 L Hình P17 Ảnh chụp hệ thống kín 26, 50 100 L vi tảo lục H pluvialis HB chuyển trạng thái tích lũy cao astaxanthin 15   23/ Phụ lục 23: Nghiên cứu độc tính sinh khối tảo H pluvialis HB mơ hình động vật thực nghiệm Địa điểm: Thử nghiệm độc tính cấp bán trường diễn sinh khối tảo H pluvialis HB tiến hành Phòng Dược học Các hợp chất tự nhiên, phần xét nghiệm huyết học hóa sinh tiến hành Phòng nghiên cứu ứng dụng lâm sàng (Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Y Dược học, Học viện Quân y), phần đánh giá mô bệnh học thực Khoa Giải phẫu bệnh (Bệnh viện 103, Học viện Quân y) Phương pháp: Phương pháp xác định độc tính cấp: theo phương pháp Abrham (1978) Turner (1965); quy định Bộ Y tế Việt Nam Tổ chức Y tế giới (WHO, 1993) nghiên cứu độc tính thuốc y học cổ truyền Thí nghiệm tiến hành chuột nhắt trắng: Chuột chia ngẫu nhiên làm 09 nhóm, nhóm 10 Từng nhóm chuột cho uống bột tảo với mức liều 400 mg, 600 mg, 800 mg, 1000 mg, 1200 mg, 1400 mg, 1600 mg, 1800 mg 2000 mg/kg thể trọng thể-TLCT Sau uống, chuột nuôi dưỡng theo dõi liên tục 72 Đánh giá thay đổi tập tính tỷ lệ chuột chết theo nhóm thí nghiệm Liều cao không gây chết chuột liều thấp gây chết toàn chuột sử dụng để tính LD50 Thiết kế thí nghiệm thỏ: Thỏ thí nghiệm phân chia ngẫu nhiên thành nhóm, nhóm có 10 Nhóm (nhóm chứng): cho uống nước cất liều mL/kg thể trọng/24h liên tục 42 ngày Nhóm 2: cho uống sinh khối tảo với liều 200 mg/kg thể trọng /24h (mức liều 1) liên tục 42 ngày Nhóm 3: cho uống sinh khối tảo với liều 400 mg /kg thể trọng/24 h (mức liều 2) liên tục 42 ngày Các tiêu đánh giá: Sinh lý - dược lý (tình trạng chung, hoạt động, ăn uống, trọng lượng thể, điện tim) Huyết học (số lượng hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu tiểu cầu) Hóa sinh (aspartate amino transferase (AST), alanin amino transferase (ALT), ure creatinin) Mô bệnh học gan, lách thận thỏ (vào ngày thứ 42, giết thỏ, làm xét nghiệm mô bệnh học gan, lách thận thỏ thực nghiệm) Thời điểm xét nghiệm: Tại thời điểm: xuất phát điểm (trước uống sinh khối tảo), sau tuần (ngày thứ 21) sau tuần (ngày thứ 42) uống sinh khối tảo Theo dõi diễn biến thỏ thí nghiệm liên tục thời gian 42 ngày 16   Kết quả: Nghiên cứu xác định LD50 Kết nghiên cứu xác định liều chết 50% (LD50) chuột nhắt trắng bột tảo H pluvialis HB trình bày bảng 3.20 Bảng phụ Số chuột nhắt trắng chết thời gian 72 sau uống bột tảo H pluvialis HB STT Lô nghiên cứu (n=10) mg/kg KLCT/24 h 400 600 800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 Số chuột chết 0 0 0 0 Số chuột 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ghi chú: KLCT- Khối lượng thể; n- số chuột lơ thí nghiệm Sau dùng bột tảo theo đường uống đến mức liều cao cho chuột uống 2000 mg bột tảo/kg khối lượng thể (KLCT)/24 h, tất chuột thí nghiệm lơ ăn uống bình thường; tình trạng phân, nước tiểu bình thường; quan sát hoạt động chuột thấy bình thường Theo dõi sau ngày, khơng có chuột thí nghiệm bị chết, phẫu thuật chuột thấy quan bình thường Như vậy, chưa tìm thấy LD50 bột tảo H pluvialis HB theo đường uống chuột nhắt trắng với mức liều cao cho chuột uống 24 h 2000 mg bột tảo /10 g KLCT/24 h tức 20 g/kg KLCT chuột nhắt trắng/24 h Các kết nghiên cứu thu nêu cho thấy bột tảo Haematococcus pluvialis HB không độc Xác định độc tính bán trường diễn Sự thay đổi khối lượng thể điện tim (đạo trình DII) Kết nghiên cứu thay đổi khối lượng thể thỏ điện tim thỏ trình bày bảng phụ Bảng phụ Sự thay đổi khối lượng thể thỏ thí nghiệm (n = 10) Thời điểm xét nghiệm T0 T3 Khối lượng thể thỏ (kg) Lô chứng (a) 1,98 ± 0,11 2,20 ± 0,17 Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h Bột tảo 400 mg /kg (liều 1) (b) KLCT /24 h (liều 2) (c) 1,96 ± 0,12 1,96 ± 0,10 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 2,17 ± 0,14 2,16 ± 0,15 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 2,29 ± 0,19 2,31 ± 0,20 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 17   2,32 ± 0,17 p3-0 < 0,05 p6-0 < 0,05 p6-3 < 0,05 P p3-0 < 0,05 p6-0 < 0,05 p6-3 < 0,05 p3-0 < 0,05 p6-0 < 0,05 p6-3 < 0,05 Ghi chú: T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần ; KLCT: khối lượng thể Kết nghiên cứu thu được Bảng phụ cho thấy: - Khối lượng thể thỏ lô nghiên cứu thời điểm xét nghiệm thay đổi ý nghĩa thống kê với p > 0,05 - Khối lượng thể thỏ thời điểm sau so với thời điểm trước lô nghiên cứu tăng có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Như vậy, bột tảo H pluvialis HB không làm ảnh hưởng đến phát triển bình thường thỏ nghiên cứu Bảng phụ Sự thay đổi điện tim thỏ thí nghiệm (đạo trình DII) Chỉ tiêu điện tim Chu kỳ (lần /phút) Thời điểm xét nghiệm Điện tim thỏ nhóm (± SD), n = 10 Đối chứng (a) T0 235,40 ± 33,56 251,00 ± 37,97 249,80 ± 32,72 T3 245,60 ± 33,74 239,80 ± 29,74 240,60 ± 33,05 T6 238,40 ± 32,71 244,20 ± 33,06 252,80± 32,73 > 0,05 > 0,05 P > 0,05 T0 0,375± 0,052 0,38 ± 0,052 0,377± 0,066 T3 0,373± 0,049 0,380 ± 0,057 0,367 ± 0,065 T6 0,372 ± 0,050 0,383 ± 0,051 0,378 ± 0,065 P > 0,05 > 0,05 > 0,05 Sóng bất thường Khơng Khơng Khơng Biên độ sóng QRS (mV) p Bột tảo 200 mg /kg Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) KLCT/24 h (liều 2) (c) > 0,05 > 0,05 - Kết nghiên cứu Bảng phụ cho thấy bột tảo H pluvialis HB khơng ảnh hưởng lên điện tim thỏ thí nghiệm (đạo trình DII) Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB đến số tiêu huyết học thỏ Kết nghiên cứu thay đổi số tiêu huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu bạch cầu) thỏ trình bày Bảng phụ 9, 10, 11 12 Bảng phụ Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB đến số lượng hồng cầu thỏ thí nghiệm Số lượng hồng cầu (T/l) Thời điểm xét nghiệm Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24h (liều 1) (b) 18   Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24h (liều 2) (c) T0 T3 T6 P 5,56 ± 0,82 5,81 ± 1,07 5,61 ± 0,43 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 5,69 ± 0,92 6,07 ± 0,89 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 5,98 ± 1,12 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 5,43 ± 0,64 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 6,10 ± 1,34 5,88 ± 0,97 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi : T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần; KLCT : khối lượng thể Từ kết nghiên cứu Bảng phụ cho thấy: Khi so sánh thời điểm xét nghiệm số lượng hồng cầu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05); so sánh thời điểm sau so với thời điểm trước lơ nghiên cứu số lượng hồng cầu không thay đổi với p > 0,05 Bảng phụ 10 Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên số lượng bạch cầu thỏ thí nghiệm Thời điểm xét nghiệm 5,18 ± 1,51 Số lượng bạch cầu (G /l) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24h (liều 1) (b) 4,94 ± 1,43 5,02 ± 1,55 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 5,21 ± 1,52 4,93 ± 1,31 4,89 ± 1,62 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 4,95 ± 1,87 5,12 ± 1,67 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Lô đối chứng (a) T0 T3 T6 P Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24 h (liều 2) (c) 5,10 ± 1,62 Ghi : T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần; KLCT : khối lượng thể Kết nghiên cứu Bảng phụ 10 cho thấy: Số lượng bạch cầu thỏ lô nghiên cứu thời điểm xét nghiệm không thay đổi với p > 0,05 Số lượng bạch cầu thỏ thời điểm sau so với thời điểm trước lô nghiên cứu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Bảng phụ 11 Ảnh hưởng bột H pluvialis HB lên số lượng tiểu cầu thỏ thí nghiệm Thời điểm xét nghiệm T0 Lô đối chứng (a) 258,40 ± 47,54 Số lượng tiểu cầu (G/l) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) 301,40 ± 68,09 19   Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24h (liều 2) (c) 281,50 ± 62,27 T3 T6 P 267,50 ± 32,25 277,50 ± 25,31 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 275,00 ± 52,23 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 289,50 ± 48,90 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 272,10 ± 40,83 290,70 ± 35,75 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi : T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần; KLCT : khối lượng thể Qua kết nghiên cứu trình bày Bảng phụ 11 cho thấy so với lô chứng, số lượng tiểu cầu thỏ lô uống bột tảo H pluvialis HB thời điểm xét nghiệm thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Số lượng tiểu cầu lô thỏ nghiên cứu thời điểm sau so với thời điểm trước thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Bảng phụ 12 Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên lượng huyết sắc tố thỏ thí nghiệm Hàm lượng huyết sắc tố (G/l) Thời điểm xét nghiệm T0 Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT/24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT/24 h (liều 2) (c) 116,90 ±13,40 130,90 ± 18,02 124,90 ± 16,43 T6 123,70 ± 10,78 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 126,90 ± 20,91 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 135,70 ± 20,37 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 T3 115,70 ± 12,10 121,70 ± 15,49 131,80 ± 16,52 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi : T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần; KLCT: khối lượng thể Kết nghiên cứu thu được bảng phụ 12 cho thấy: - Hàm lượng huyết sắc tố thỏ lô nghiên cứu thời điểm xét nghiệm không thay đổi với p > 0,05 - Hàm lượng huyết sắc tố thỏ thời điểm sau so với thời điểm trước lô nghiên cứu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên số tiêu hóa sinh thỏ Kết nghiên cứu ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên số tiêu chức thận (urê, creatinin), chức gan (AST, ALT) trình bày Bảng phụ 13, 14, 15 16 Bảng phụ 13 Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên nồng độ ure máu thỏ 20   Thời điểm xét nghiệm T0 4,05 ± 1,68 Nồng độ urê máu thỏ (mmol/l) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h Bột tảo 400 mg /kg (liều 1) (b) KLCT/24 h (liều 2) (c) 4,19 ± 1,42 3,74 ± 1,49 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 3,86 ± 1,54 4,29 ± 1,48 4,11 ± 1,69 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 3,90 ± 1,47 4,00 ± 1,54 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Lô đối chứng (a) 3,80 ± 1,48 T3 T6 P Ghi : T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần; KLCT: khối lượng thể Từ kết Bảng phụ 13 cho thấy: Nồng độ urê máu thỏ lô nghiên cứu thời điểm xét nghiệm thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Nồng độ urê máu thỏ thời điểm xét nghiệm sau so với thời điểm xét nghiệm trước lơ nghiên cứu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Bảng phụ 14 Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên nồng độ creatinin máu thỏ Thời điểm xét nghiệm T0 T3 T6 P Lô đối chứng (a) 57,50 ± 8,26 56,00 ± 5,42 53,30 ± 10,49 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Nồng độ creatinin máu thỏ (µ) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h Bột tảo 400 mg /kg (liều 1) (b) KLCT /24 h (liều 2) (c) 54,50 ± 10,11 61,30 ± 12,17 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 53,10 ± 9,72 54,60 ± 12,70 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 56,50 ± 12,09 58,10 ± 11,25 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p3-0 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú: T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần; KLCT: khối lượng thể Kết nghiên cứu thu được Bảng phụ 14 cho thấy so sánh giá trị nồng độ creatinin máu thỏ lơ thí nghiệm so với lơ chứng sinh học thời điểm xét nghiệm thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Nồng độ creatinin máu thỏ thời điểm xét nghiệm sau so với thời điểm xét nghiệm trước lơ nghiên cứu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Bảng phụ 15 Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên hoạt độ AST máu thỏ 21   Thời điểm xét nghiệm Lô đối chứng (a) 60,15 ± 21,81 T0 T3 T6 58,29 ± 16,87 58,32 ± 18,70 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 P Hoạt độ AST máu thỏ (UI/l) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) 55,92 ± 18,04 Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24 h (liều 2) (c) 59,38 ± 21,41 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 62,88 ± 17,15 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 64,67 ± 18,52 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 56,31 ± 16,93 61,48 ± 20,48 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú: T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần; KLCT: khối lượng thể; AST: Aspartate transaminase Từ kết nghiên cứu trình bày Bảng phụ 15 cho thấy: - Hoạt độ AST thỏ lô nghiên cứu thời điểm xét nghiệm thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 - Hoạt độ AST thỏ thời điểm sau so với thời điểm trước lơ nghiên cứu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Như vậy, bột H pluvialis HB không làm ảnh hưởng đến hoạt độ AST thỏ nghiên cứu Bảng phụ 16 Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên hoạt độ ALT máu thỏ Thời điểm xét nghiệm T0 T3 T6 P Lô đối chứng (a) 108,90 ± 17,32 119,50 ± 20,38 114,30 ± 19,89 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Hoạt độ ALT máu thỏ Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 Bột tảo 400 mg /kg KLCT h (liều 1) (b) /24 h (liều 2) (c) 110,90 ± 14,69 120,40 ± 24,96 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 109,80 ± 14,85 115,80 ± 17,03 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 118,60 ± 25,41 110,20 ± 22,12 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 p3-0 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú: T0: xuất phát điểm, T3: sau tuần, T6: sau tuần; KLCT: khối lượng thể; ALT: Alanine transaminase Kết nghiên cứu Bảng phụ 16 cho thấy so với lô chứng sinh lý, hoạt độ ALT thỏ lô uống bột H pluvialis HB thời điểm xét nghiệm thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Hoạt độ ALT thỏ thời điểm sau so với thời điểm trước lơ nghiên cứu thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 22   Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên số tiêu mô bệnh học thỏ Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên thay đổi mô bệnh học gan nhóm nghiên cứu Kết nghiên cứu thu cho thấy tế bào gan xung quanh có bào tương dạng hạt mịn màu hồng nhạt Các tế bào gần tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ sáng Các mẫu gan có cấu trúc mơ học bình thường Các tiểu thuỳ rõ Khoảng cửa có động mạch tĩnh mạch gan, ống mật lót biểu mơ khối vng, mơ đệm sợi tạo keo mảnh Các tế bào hình đa diện xếp thành bè nằm cạnh mao mạch nan hoa, hướng tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy Tế bào gan có nhân trịn, chất màu mịn, sáng nhạt, thường có hạt nhân nhỏ Bào tương tế bào gan dạng hạt mịn, bắt màu hồng nhạt Rải rác thành mao mạch có tế bào Kuffer với nhân nhỏ hình thoi dài Một số mao mạch chứa hồng cầu (Hình phụ 18) Như vậy, mơ bệnh học tạng gan lô thỏ nghiên cứu thời điểm 42 ngày sau uống bột vi tảo lục H pluvialis HB không bị biến đổi * Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên thay đổi mơ bệnh học lách nhóm nghiên cứu Cấu trúc tuỷ trắng tuỷ đỏ rõ Tuỷ trắng tập trung nhiều tế bào lympho thành ổ hay nang lympho với động mạch trung tâm có thành dầy Tủy đỏ với xoang lách chứa nhiều hồng cầu, số đại thực bào Như vậy, mô bệnh học thận lô thỏ nghiên cứu thời điểm 42 ngày sau uống bột vi tảo lục H pluvialis HB không bị biến đổi (Hình phụ 19) * Ảnh hưởng bột tảo H pluvialis HB lên thay đổi mô bệnh học thận nhóm nghiên cứu Thận có cấu trúc vùng vỏ vùng tuỷ Vùng vỏ có nhiều tiểu cầu thận với cuộn mạch nằm khoang Bowman Vùng tuỷ với ống thận lót biểu mơ khối vuông hay trụ, bờ tế bào rõ, bào tương mịn bắt màu hồng nhạt Như vậy, mô bệnh học lách thận lô thỏ nghiên cứu thời điểm 42 ngày sau uống bột vi tảo lục H pluvialis HB khơng bị biến đổi (Hình phụ 20) Kết luận: Từ kết nghiên cứu nêu phần trên, rút số kết luận sau: - Không xác định LD50 bột vi tảo lục H pluvialis HB theo đường uống chuột nhắt trắng, cho chuột uống với mức liều cao đưa vào dày chuột là: 20 g/kg KLCT Đây mức liều cao so với liều dùng thông thường người nên bột H pluvialis HB có mức độ độc thấp - Bột vi tảo lục H pluvialis HB có độ an toàn cao cho động vật nghiên cứu uống liên tục thời gian 42 ngày với mức liều 200 400 mg/kg KLCT không làm ảnh hưởng đến phát triển trọng lượng thể điện tim thỏ; không làm 23   thay đổi số huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu bạch cầu) Các số nồng độ urê creatinin máu mức bình thường Mơ bệnh học tạng gan lách thận lô thỏ nghiên cứu thời điểm 42 ngày sau uống bột vi tảo lục H pluvialis HB không bị biến đổi       Hình P18 Hình ảnh mơ bệnh học gan thỏ nhóm nghiên cứu (1: Lô đối chứng; 2: Uống bột H pluvialis HB liều 1; 3: Uống bột H pluvialis HB liều 2)       Hình P19 Hình ảnh mơ bệnh học lách thỏ nhóm nghiên cứu (1: Lô đối chứng; 2: Uống bột H pluvialis HB liều 1; 3: Uống bột H pluvialis HB liều 2)                                                                                    2                                                                        3   Hình P20 Hình ảnh mơ bệnh học thận thỏ nhóm nghiên cứu (1: Lơ đối chứng; 2: Uống bột tảo H pluvialis HB liều 1; 3: Uống bột tảo H pluvialis HB liều 2) 24   24/ Phụ lục 24 Phổ sắc ký đồ thành phần axit béo thịt cá hồi Vân lô thí nghiệm khác sau 55 ngày ni A B C Hình P21 Sắc ký đồ axit béo thịt cá hồi Vân lơ thí nghiệm khác (A: Cá ăn cám Pháp; B: Cá ăn cám Việt Nam; C: Cá ăn cám Việt Nam có bổ sung sinh khối vi tảo lục H pluvialis HB (61 mg astaxanthin/ kg thức ăn))     25