0733 nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất có cấu trúc lai từ betulin luận văn tốt nghiệp

BỘGIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNGNGHỆ - NGUYỄNTHỊHIỂN NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNHGÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤTCĨCẤUTRÚCLAI TỪBETULIN Chunngành: Hóa hữu Mãsố : 9.44.01.14 TĨM TẮTLUẬNÁNTIẾNSĨHĨAHỌC Hà Nội–2017 Cơngtrìnhđược hồnthànhtại:Học việnK h o a h ọ c v C ô n g n g h ệ ViệnHàn lâmKhoahọcvàCông nghệViệt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Văn TuyếnPhảnbiện 1: GS.TSTrần Văn Sung Phản biện 2: PGS.TS Lê Thị Anh ĐàoPhảnbiện3:PGS.TSHoaHữuThu Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Họcviện,h ọ p t i H ọ c v i ệ n K h o a h ọ c v C ô n g n g h ệ V i ệ n H n l â m K h o a họcvàCơngnghệViệtNamvàohồi…giờ.’,ngày…tháng…năm201… Cóthểtìmhiểu luậnántại: - Thưviện HọcviệnKhoahọcvàCơngnghệ - ThưviệnQuốcgiaViệtNam A-GIỚITHIỆULUẬNÁN Lý chọn đềtài Thuật ngữ “lai hóa thuốc” (pharmacophone hybridation) – hai hoặcnhiều thành phần có hoạt tính sinh học liên kết thành phân tử lai nhấtđượcbiếtđếnnhưmộtphươngpháphiệuquảvàtiệnlợiđểtạoracáchợpchấtmớic ó hoạt tính chống ung thư Sự lai ghép phân tử đem lại lợi tổng hợp thơngquaviệcthayđổihóahọccóchọnlọccủathànhphầntronghệthốnglai.Hơnnữ a,khicáctácnhâncóhoạttínhsinhhọcđượckếthợpvớinhau,cáccấutrúclaimớicóthể mang lại lợi ích sinh học tổng hợp Trong nghiên cứu tổng hợp nhằm tìmkiếm hợp chất có hoạt tính tiềm năng, việc lựa chọn phân tử với hoạt tínhsinhhọccaođểlaitạođóngmộtvaitrịquantrọng Các nghiên cứu trước chỉra việc đưa axit dicacboxylic (hoặc anhydrit dicacboxylic) succinic,maleic, glutaric, chất tương tự vào khung tritecpen betulin nhóm tạiC-3 C-28có thể tạo nhiều dẫn xuất có hoạt tính tốt [5, 41, 88–94].Nhiều hợp chất lai axit betulinic, axit ursolic, axit oleanolic dẫn xuất củanó với zidovudin (AZT) với lamivudine (3TC) thể hoạt động chống HIVcao [102], số hợp chất lai tritecpenoit dẫn xuất với AZT quacầu nối triazole thể tác nhân chống HIV tiềm chấtức chế tế bào ung thư [38, 40] Từ ý tưởng trên, luận án nghiên cứu tổng hợp cáchợp chất có cấu trúc lai betulin, tritecpenoit khung lupan tiêu biểu, vớiAZT qua cầu nối este-triazole qua cầu nối amit-triazole, luận án thực hiệntổngh ợ p c c h ợ p c h ấ t l a i g i ữ a b e t u l i n v d T ; T C q u a c ầ u n ố i e s t e ; đ n g t h i nghiêncứuthửhoạttínhgâyđộctếbàotrêncácdịngtếbàoungthưgan(Hep-G2),ung biểu mô (KB) sản phẩm lai tổng hợp nhằm tìm kiếm hợp chấtmới có hoạttínhsinhhọc lýthú Đối tượngvànhiệmvụcủa luận án 2.1 Đối tượng nghiêncứucủaluậnán CáchợpchấtlaicủabetulinvớithuốcchốngHIVlàAZT,d4Tvà3TCquacầunốiestevàcầunốitr iazole 2.2 Nhiệmvụcủaluậnán 2.2.1 Nghiêncứutổnghợpcácdẫnxuấtbetulin-diaxitcacboxylic(vớicácanhydritcủaaxit succinic; axit glutaric, axit metylglutaric, axit metylsuccinic,axit maleic axit1,2,3,6tetrahydrophtalic) 2.2.2 Nghiêncứutổnghợpcácdẫnxuấtestepropagylcủacácaxitbetulin-diaxit 2.2.3 Nghiêncứutổnghợpcácdẫnxuấtamitpropagylcủacácaxitbetulin-diaxit 2.2.4 NghiêncứutổngcácdẫnxuấtlaicủabetulinvớiAZTquacầueste-triazole 2.2.5 NghiêncứutổngcácdẫnxuấtlaicủabetulinvớiAZTquacầuamit-triazole 2.2.6 Nghiêncứutổngcácdẫnxuấtlaicủabetulinvớid4Tqualiênkếteste 2.2.7 Nghiêncứutổngcácdẫnxuấtlaicủabetulinvới3TCqualiênkếteste 2.2.8 Xácđịnhhoạttínhgâyđộctếbàocủacáchợpchấtlai Cácdẫnchấtlaicủabetulinđượcthửhoạttínhgâyđộctếbàotrên2dịngtếbàoungthư:tếbàoKB(u ngthưbiểumơ),tếbàoHep-G2(ungthưgan) Phươngphápnghiêncứu Cácchấtđượctổnghợptheocácphươngpháptổnghợphữucơhiệnđạiđãbiết,cócảitiếnvàvậ ndụngthíchhợpvàocáctrườnghợpcụthể.Sảnphẩmphảnứngđượclàm sạchbằngphươngphápsắckícột.Cấutrúccủasảnphẩmđượcxácđịnhbằngcácphươngphápphổ như:IR,1H-NMR,13C-NMR,HMBC,HSQC,NOESYvàHRMS Nhữngđiểmmới củaluậnán Luận án thiết kế tổng hợp thành cơng 22 hợp chất lai betulinvàcácthuốcHIV(AZT,d4T,3TC)và11hợpchấttrunggiancónhómankinvà6dẫnxuất estegiữabetulinvà axitdicacboxylic,baogồm: * 6dẫn xuấtestegiữabetulin vàcácaxit dicacboxylickhácnhau121a-f  dẫn chất trung gian mới122a-f, betulin-este-propagyl có chứa liênkết -C≡CH  dẫn chất trung gian mới124a-f, betulin-amit-propagyl có chứa liênkết -C≡CH Các dẫn xuất tham gia phản ứng click với thuốc chất có hoạttínhkhác chứa liênnhómazit–N3đểtổnghợp cáchợpchấtlaimới  6hợp chấtlai giữabetulin vàAZTquacầunối este-triazol123a-f * 5hợpchấtlai giữabetulin vàAZTquacầunối amit-triazol125a-e  6hợp chấtlai giữabetulin vàd4Tquacầu nốieste126a-f  5hợp chấtlai giữabetulin và3TCquacầunối este127a-e Đã khẳng định cấu trúc hợp chất lai từ kết phân tích dữliệu phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1H-NMR và13CNMR,HMBC,HSQC vàNOESY) phổ khốilượng(HRMS) Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 22 hợp chất lai 2dịngtếbàoungthưởngười,tếbàoKb(ungthưbiểumơ)vàtếbàoHep-G2(ungthư gan),trongđócó19hợpchấtcókhảnănggâyđộctếbàoungthưkhảosát,trongđó có hợp chất thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh với giá trị IC50< 5µMlà123b-fvà126f Đã tổng hợp hợp chất lai có giá trị IC50tốt chất chuẩn đốichứngE l l i p t i c i n e :1 f :I C 50= , µ M ( K B ) ; , µ M ( H e p G ) ; f :I C 50= 0,87µM(KB);2,8µM(Hep-G2).Hợpchất123ccó giá trị IC50tương đương với chấtchuẩnEllipticine,IC50=1,38µM(KB) Bốcục củaluận án Luận án trình bày 134 trang đánh máy với 36 sơ đồ, 39 hình 17bảng.Phânbốcụthểnhưsau:Mởđầu:3trang;Tổngquan:26trang;thựcnghiệm: 32trang;Kếtquảvàthảoluận:57trang;kếtluận:1trang;Danhmụccáccơngtrìnhcủa tác giả: trang; Tài liệu tham khảo: 12 trang Ngồi cịn có phần phụ lục 71tranggồmcác phổ đồ Chương1.TỔNGQUAN Tổng quan gồm 26 trang, tổng kết tài liệu tình hình nghiên cứu Betulin,tổng hợp dẫn chất lai tritecpenoit hợp chất lai betulin với hợpchất thuốcđã biếtc ủ a c c t c g i ả t r o n g vàngoàinước Chương2.THỰCNGHIỆM Thực nghiệm gồm 32 trang, trình bày chi tiết phương pháp nghiên cứu,quy trình tổng hợp, tinh chế, tính chất vật lý sản phẩm nhận như:điểm chảy, hình thái, màu sắc, hiệu suất phản ứng liệu chi tiết phổ HRMS,IR,1HNMR,13CNMRvàmộtsốphổtươngtácHMBC,HSQC,NOESY Đãđưaraquytrìnhtổnghợpthànhcơngcácdãyhợpchấtsauđây: Cácdẫnxuấtestecủabetulinvớicácanhydritaxitdicacboxylic121a-f Cácdẫnxuấtpropargyleste122a-fcủacủacáchợpchất121a-f Cácdẫnxuấtpropargylamit124a-ecủacủacáchợpchất121a-e Cáchợpchấtlai123a-fcủadẫnxuất-betulinvớiAZTquacầueste-triazole Cáchợpchấtlai125a-ecủadẫnxuất-betulinvớiAZTquacầuamit-triazole Cáchợpchấtlai126a-fcủadẫnxuất-betulinvớid4Tquacầueste Cáchợpchấtlai127a-ecủadẫn xuất-betulinvới3TCquacầueste CHƯƠNG 3: KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN Đểthựchiệncácmụctiêucủaluậnán,trướctiênnhómOHcủaC28đượcchuyểnhóathành chức estekhiphảnứngvớicácanhidritaxitdicacboxylic Từc c a x i t a - f ,nh óm c a x i t C O O H đ ợ c c h u y ể n h ó a t h n h n h ó m cầ u n ố i estevới thành phầnhoạttính thứhai làstavudinvàlamivudin (d4Tvà 3TC) Hướng thứ hai chuyển hóa nhóm axit -COOH axit121a-fthành cácpropagyl este propagyl amit, thực phản ứng “Click” AZT cácpropagyl este propagyl amit hợp chất lai qua cầu nối triazol Tổnghợp cácchấtlaigiữabetulin AZT qua cầunốitriazol 3.1.Tổng hợpcáchợpchấtlaigiữabetulinvàAZTqua cầueste-triazol CáchợpchấtlaicủabetulinvàAZTquacầuestetriazolđượctổnghợptheosơđồ3.1 [ Sơđồ3.1.Tổnghợpcác chấtlaibetulinvàAZTqua cầu este-triazol Sản phẩm este hóa nhóm OH C-28 chứng minh phổ hồng ngoại phổcộng hưởng từ proton Khi phân tích phổ cộng hưởng từ proton hợp chấtnghiên cứu, khung lupan đánh số theo quy định, nhánh cầu nối quyđịnh đánh số từ nguyên tử C nhóm C=O nhóm este với OH C-28 C-1’ vàtiếp tục đến nguyên tử C nhóm COOH (hình 3.1) Kết phân tích phổ proton củacáchợpchấttrongdãyđược tổnghợp ởbảng3.1 Phổ hồng ngoại (IR) hợp chất121a-fcó vân hấp thụ vùng 1680-1730 cm với cường độ mạnh, đặc trưng nhóm C=O chức axit este tạothành mà trênphổcủabetulin khơngcócácvânhấp thụ Hình 3.1.Cơngthứccấutrúc vàmộtsốđặc trưng vậtlí cáchợpchất121 Bảng3.1.Một sốtínhiệuđặctrưng củakhung lupan trongcáchợp chất121a-f Betulin 121d 121a 121b 121c 121e 121f 11;5 Hz 3,79;d, 10,5 Hz 3,33;d, 10,5 Hz 3,19; dd, 11;5 Hz 4,31;d, 11,0 Hz 3,90;d, 11,0 Hz 3,19; dd, 11;5 Hz 4,27;d, 11,0 Hz 3,85;d, 11,0 Hz 3,19; dd; 11;5 Hz 4,27;d, 11,0 Hz 3,85;d, 11,0 Hz 3,19; dd; 11;5 Hz 4,30;d, 11,0 Hz 3,88;d, 11,0 Hz 3,19; dd, 11;5 Hz 4,51;d, 11,0 Hz 4,07;d, 11,0 Hz 4,69;s 3,19; dd, 11;5 Hz 4,34;0,5H; 4,22;0,5H; 3,90;0,5H; 3,79; 0,5H;d,J=1 1Hz 4,67;s Ha-29 4,67;s 4,68;s 4,68;s 4,72;s Hb-29 4,57;s 4,35;s 4,58;s 4,62;s 4,59;s 4,57;s 4,62;s H-30 1,67;3H,s 1,68;3H,s 1,67;3H,s 1,68;3H,s 1,68;3H,s 1,67;3H,s 1,69;3H,s H-19 H-26 2,37-2-39; 1H,m 1,02; 3H;s 2,40-2,46; 1H; m 1,02;3H,s 2,40-2,46; 1H; m 1,02;3H,s 2,40-2,46; 1H; m 1,02;3H,s 2,40-2,44; 1H; m 1,02;3H,s 2,40-2,46; 1H; m 1,01;3H,s 2,40-2,46; 1H; m 1,04;3H,s H-27 0,97;3H,s 0,97;3H,s 0,97;3H,s 0,97;3H,s 0,97;3H,s 0,96;3H,s 0,99;3H,s H-23 0,96;3H,s 0,96;3H,s 0,96;3H,s 0,96;3H,s 0,96;3H,s 0,95;3H,s 0,97;3H,s H-25 0,81;3H,s 0,82;3H,s 0,82;3H,s 0,82;3H,s 0,82;3H,s 0,81;3H,s 0,84;3H,s H-24 CH3 khác 0,75;3H,s 0,75;3H,s 0,75;3H,s 0,78;3H,s 0,76;3H,s 0,75;3H,s 0,77;3H,s 1,00;3H,s 1,27;3H,s HC h ấ t 3,20; dd, H-3 Ha-28 Hb-28 4,71;s Khi phân tích phổ1H-NMRcủa hợpchất121f, hai protona n k e n t r o n g h ợ p phần maleic ban đầu có số tương tác vơ hướng 13 Hz 12,5 Hz, chưakhẳng định cấu hình nhóm anken nên chúng tơi phân tích phổ tươngtác proton NOESY, phổ NOESY hợp chất121fkhông thấy có tín hiệu tươngtác hai proton H-2’ H-3’, điều chứng tỏ hai proton cách xa nhauvềmặtkhơng gian,nhưvậycấuhìnhphùhợplàtrans Cách ợ p c h ấ t a f t h a m g i a p h ả n ứ n g v i p r o p a g y l b r o m u a t o t h n h c c este có mặt Cs2CO3 Phản ứng xảy nhanh có hiệu suất cao, sảnphẩmcủa phản ứngrấtchọnlọc Cấu trúc sản phẩm este122a-fđược khẳng định liệu phổ cộng hưởngtừ1H và13C Một số tín hiệu cộng hưởng đặc trưng phổ1H-NMR cácpropagyl este122a-fđược tổnghợptrongbảng3.2 Bảng3.2.Cácpiccộnghưởngđặctrưngcủacáceste122a-f Hợpchất H-C≡ CH2-C≡ H-3 Ha-28 Hb-28 Ha-29 Hb-29 H-30 H-26 H-27 H-23 H-25 H-24 H-19 122a 2,47 ppm 4,70;s 3,18; dd, 11,0;5,0 Hz 4,29; d, 10,5Hz 122b 2,47 ppm 4,69;s 3,18; dd, 10,5; 4,5 Hz 4,28; d, 11,0Hz 3,89; d, 10,5Hz 4,69;s 4,59;s 1,68;3H, s 1,03;3H, s 0,972;3H,s 0,967;3H,s 0,82;3H, s 0,76;3H, s 2,42-2,45, 1H,m 3,86; d, 11,0Hz 4,68;s 4,59;s 1,68;3H, s 1,03;3H, s 0,973;3H,s 0,967;3H,s 0,83;3H, s 0,76;3H, s H-2’ H-3’ H-4’ H-5’ khác 2,69;4H, s 122c 2,47 ppm 4,68;s 3,18; dd, 11,5;4,5 Hz 4,28; d, 11,5Hz 3,86; d, 11,5Hz 4,68;s 4,59;s 1,68;3H, s 1,03;6H, s 0,974;3H,s 0,967;3H,s 0,82;3H, s 0,76;3H, s 2,40-2,52; 4H, m; 2,39-2,45, 5H,m ( H - 2,24-2,32; 19; 2H-2’; 2H,m 2H-4’) H-3’:1 , 2,01; m 122d 2,47 ppm 4,70;s 3,18; dd, 11,5;5,0 Hz 4,32 và4,26 (1H);3,85và 3,91;(1H);d, 11Hz 122e 2,45 ppm 4,72;s 3,19; dd, 11,5;4,5 Hz 4,12(0,5H); 4,01(0,5H); 3,68(0,5H); 3,57(0,5H); 4,45;s 4,35;s 1,68;3H, s 1,03;6H, s 0,971;3H,s 0,967;3H,s 0,82;3H, s 0,76;3H, s 2,40-2,49; 2H, m; 2,77-2,82, 1H,m; 2,95-2,99, 1H,m 4,68;s 4,58;s 1,67;3H, s 1,02;3H, s 0,97;6H, s 0,82;3H, s 0,76;3H, s 2,39-2,44; m 3,08-3,11; m 122f 2,51 ppm 4,79;s 3,18; dd, 11,0;5,0 Hz 4,38; d, 11,0Hz 3,99; d, 11,0Hz 4,69;s 4,59;s 1,68;3H, s 1,04;3H, s 0,98;3H,s 0,97;3H,s 0,83;3H,s 0,76;3H,s 2,42-2,47, 1H,m 6,31;1H, d, 11,5Hz 6,26;1H, d, 11,5Hz 5,68;s 1,25;3H-5’, 2,39-2,44; d, J=7Hz m,H-7’ Hình3.2.Cấutrúchóahọcvàmộtsốđặctrưngvậtlícủacáchợpchất122a-f Các tín hiệu cộng hưởng phổ13C-NMR hợp chất122a-fđược trình bày ởbảng 3.3 Kết phân tích bảng 3.3 cho thấy tín hiệu cộng hưởng 30nguntửCtrongkhunglupanítthayđổi.C-28cónhómchứcbịbiếnđổitrựctiếpnênđộ dịch chuyển thayđổilớnnhất,củabetulinδC-28= 60,75 ppm [1, 106], cacbon nàychuyểndịchvềphíatrườngyếu hơnkhinhómOHđượcchuyểnthành nhómesteδC-28 =63,1-63,3ppm,rấtítthayđổigiữacáchợpchấttrongdãy Bảng 3.3.Một số tínhiệuđặc trưng phổ13C-NMRcủa cáchợpchất122a-f C 122a 122b 122e 122f C 122a 122b 122c 122d 122e 122f C-1 37,6 37,6 37,6 37,6 37,6 37,6 C-21 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6 C-2 27,4 27,4 27,4 27,4 27,4 27,4 C-22 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 79,0 38,9 55,3 18,3 34,5 40,9 50,4 37,2 20,8 25,2 38,7 79,0 38,9 55,3 18,3 34,5 40,9 50,4 37,2 20,8 25,2 38,7 79,0 38,9 55,3 18,3 34,5 40,9 50,4 37,2 20,8 25,2 38,7 79,0 38,9 55,3 18,3 34,5 40,9 50,4 37,2 20,8 25,2 38,7 79,0 38,9 55,3 18,3 34,5 40,9 50,4 37,2 20,8 25,2 38,7 79,0 38,9 55,3 18,3 34,6 40,9 50,4 37,2 20,8 25,2 38,7 C-23 C-24 C-25 C-26 C-27 C-28 C-29 C-30 C-1’ C-2’ C-3’ 28,0 15,4 16,1 16,0 14,8 63,2 109,9 19,2 172,3 29,1 29,0 28,0 15,4 16,1 16,0 14,8 63,2 109,9 19,2 173,2 33,3 20,1 28,0 15,4 16,1 16,0 14,8 63,2 109,9 19,2 172,3 40,9 27,5 28,0 15,4 16,1 16,0 14,8 63,1 109,9 19,2 175 35,7 35,9 28,0 15,4 16,1 16,1 14,8 64,1 109,9 19,2 173,4 39,9 26,0 28,0 15,4 16,1 16,1 14,8 64,1 109,9 19,2 165,5 130,9 128,6 C-14 C-15 C-16 42,7 27,0 34,2 42,7 27,0 34,2 42,7 27,0 34,2 42,7 27,0 34,2 42,7 27,0 34,2 42,7 27,0 34,2 C-4’ C-5’ C-6’ 171,5 33,0 172,1 40,5 171,5 172 17,0 125,3 125,0 164,3 C-17 C-18 48,8 46,4 48,8 46,4 48,8 46,4 48,8 46,4 48,8 46,4 48,9 46,4 C-7’ C≡ C-19 C-20 47,7 47,7 47,7 47,7 47,7 150,1 150,1 150,1 150,1 150,1 47,7 150 ≡CH CH2 C-8’ 122c 122d 19,8 25,7 77,5 77,6 77,5 77,5 75,0 52,2 74,9 52,3 75,0 51,8 75,0 52,2 39,6 77,6 74,9 52,1 172,4 77 75,5 52,7 Trên phổ1H-NMR hợp chất122dcó số tín hiệu cộng hưởng kiểu “cặp”.Proton Ha-28 tách thành hai tín hiệu duplet cạnh với tổng cường độ 1H,bao gồm 0,76 H δ = 4,27 ppm 0,27 H δ = 4,42 ppm Phổ 13C-NMR hợpchất122dvà123dđều thấy có hai pic tương ứng với tín hiệu cộng hưởng hainguyên tử cacbon nhóm cacbonyl este Cặp tín hiệu thứ 175,2 174,4 ppm, cặpthứ 171,9và 171,0 ppm Như phản ứng betulin anhydrit axit 2metylsuccinictạorasảnphẩmgồmhaiđồngphânvớitỉlệ1:3.Theocơchếphảnứngestehóaxúc tác bazơ AcB2, tác nhân RCH2O dễ cơng vào nhóm C=O bị cản trở khơnggianhơnnênsảnphẩm121dmànhómCH3củacầunốiởxakhunglupanhơnchiếmưuthếhơ nsovới121d1.KếtquảnàyđượckhẳngđịnhkhiphântíchphổHMBCvàHSQCcủahợpchất123 d Cáchợpchấtlai123afđượctổnghợpbằngphảnứng“Click”giữacácpropagyle s t e 2 a f vớ i , đ n g l ợ n g A Z T t r o n g d u n g m ô i t -butanolở o C,xúc tác CuI (0,2 đương lượng) trong12.Cấutrúchóahọc,mộtsốđặctrưngvậtlívàđánh số nguyên tử C hợp chất lai betulin AZT qua cầu nối este-triazol123a-fnhưhình3.3dướiđây Hình 3.Cấutrúc hóa họcvà mộtsốđặctrưngvậtlícủa cáchợpchất123a-f Cơchếphảnứng“Click”giữanhómazitN3vàankinC≡CvớixúctácCuIđượcmơtảtheosơđồ 3.2 [107–111].Phản ứngnàycó độchọn lọcvàhiệu suấtcao Sơđồ3.2.Cơ chếphản ứng “Click”tổnghợpcáchợpchất lai123a-f Bảng 3.6.Phân tíchphổHMBCvàHSQC củahợpchất123dphầnkhunglupan Cacbon C δ(ppm) C-1 37,6 C-2 27,0 C-3 80,0 C-4 38,9 C-5 55,3 C-6 18,3 C-7 34,5 C-8 40,8 C-9 50,3 C-10 37,1 C-11 20,8 C-12 25,2 C-13 38,7 C-14 42,7 C-15 27,0 C-16 34,2 C-17 48,8 C-18 46,4 C-19 47,7 C-20 150,2 C-21 29,7 C-22 29,6 C-23 28,0 C-24 15,4 C-25 16,1 C-26 16,0 C-27 14,7 C-28 63,2 C-29 109,9 C-30 19,1 Tín hiệu tươngtácvới protontrên phổ HMBC H(δ,ppm) H-25(0,80;s) HSQC H-23(0,95;s), H-24(0,74;s) H-3(3,18,dd;4,5;11Hz);H-24(0,74;s)yếu H-23(0,95;s),H-24(0,74;s),H-25 (0,80;s) 3,18; dd H-26(1,00;s) H-27(0,95;s), H-26(1,00;s) H-25(0,80;s), H-26(1,00;s) H-27(0,95;s) H-26(1,00;s), H-27(0,95;s) H-27(0,95;s) Ha-28(4,26, d,11Hz); Hb-28 (3,88;d, 11Hz) H-19(2,38-2,42,m) Ha-28(4,26, d,11Hz); Hb-28 (3,88;d, 11Hz) Ha-29(4,67, s);Hb-29 (4,57, s) Ha-29(4,67,s); Hb-29(4,57, s);H-30 (1,66;s) Ha-28(4,26, d, 11Hz); Hb-28(3,88; d, 11Hz); H-19 H-3(3,18,dd;4,5;11Hz);H-24(0,74;s) H-3(3,18,dd; 4,5;11Hz);H-23 (0,95;s) H-5(0,66;br.d) H-19(2,38-2,42, m);H-30 (1,66; s) H-19(2,38-2,42,m);Ha-29(4,67, s);Hb-29(4,57,s) 2,38-2,42;m 1,90-1,93;m 0,95;s 0,74;s 0,80;s 1,00;s 0,95;s 4,26; 3,88 4,67;4,57 1,66;s Bảng 3.7.PhântíchphổHMBCvà HSQCcủahợp chất123dphầnAZTvà cầu nối Cacbon C δ(ppm) C-1’ 172,2 C-2’ 37,7 C-3’ 35,8 C-4’ 175,1 C-5’ 17,0 C-6’ 58,4 C-1” 89,1 C-2” 37,4 C-3” 59,3 C-4” 85,3 TươngtácchínhC-HtrênphổHMBC H_δ (ppm)δ (ppm) Ha-28(4,26,d, 11Hz);Hb-28 (3,88;d, 11Hz) H-5’(1,23,s); H-3’(2,91-3,01,m, overlap) H-2’a(2,73-2,79); H-2’b (2,44-2,48);H-3’, H-6’ H-2’a(2,73-2,79); H-2’b(2,44-2,48) =CH-triazol(7,75) H-3” (5,41-5,45;m);=CH-thymidin(7,41,s) H-4”(4,41-4,43; m); H-5”a(4,01, dd, 2,0; 12,5Hz); H-5”b (3,79; dd,2,0; 12,5Hz); H-1”(6,20-6,22; m) H-5”a (4,01, dd, 2,0; 12,5Hz); H-2” (2,91-3,01;m) HSQC δ (ppm) H-2’a; H-2’b 2,01-3,01;m 1,23;s(CH3) 5,22-5,29;m 6,20-6,22;m 2,91-3,01;m 5,41-5,45;m 4,41-4,43 C-5” =CHtriazol =Ctriazol C=Othymidin NCON =Cthymidin =CHthymidin 61,6 123,8 143,4 163,5 150,3 111,3 137,9 H-3”(5,41-5,45; m); H-6’ (5,22-5,29;m); H-3”(5,41-5,45;m) H-6’(5,22-5,29;m);=CH-triazol(7,75) =CH-thymidin(7,41,s) =CH-thymidin(7,41,s);H-1”(6,20-6,22; m) =CH-thymidin(7,41,s) H-1”(6,20-6,22; m) H-5”a;H-5”b 7,75; s 7,41; s Như vậy, qua phân tích liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H,13C kết hợpphổ tương tác cacbon-hydro, cấu trúc sản phẩm lai betulin-este-triazolAZT dựkiếnđã khẳngđịnh 3.3.Tổnghợpcáchợpchấtlai củabetulinvàAZTquacầunốiamit-triazol Cáchợpchất lai giữabetulin vàA Z T q u a c ầ u n ố i a m i t - t r i a z o l đ ợ c t ổ n g h ợ p t dẫn xuấta x i t a - e theo sơ đồ3 H i ệ u s u ấ t t ổ n g hợp đạttừ 50% đến % Bằngc c p h n g p h p p h ổ h n g n g o i , p h ổ c ộ n g h n g t h t n h â n đ ã c h ứ n g minhđượccấutrúccủacácpropagylamittổnghợpđược Sơđồ3.3.TổnghợpcácchấtlaibetulinvàAZTquacầu amit-triazol Hình3.4.Cấutrúchóahọcvàmộtsốđặctrưngvậtlícủacáchợpchất124a-e Bảng 3.8.Một số tínhiệuđặctrưngphổ1H-NMRcủacáchợpchất124a-e Hợpchất NH H-C≡ 2H,C H2C≡ H-3 Ha-28 Hb-28 Ha-29 Hb-29 H-30 H-26 H-27 H-23 H-25 H-24 H-19 H-2’ H-3’ H-4’ H-5’ Khác 124a 124b 124c 124d 124e 4,02-4,07;m; 1H; 3,683,69;m;1H 3,18;d d , 1 , và5,0Hz 4,32; d, 11Hz 5,93; br.s 5,93; br.s 2,22; s 2,23; t;2,5Hz 4,02-4,07;m; 4,04; d, 2Hz4,05; 1H; 3,68d;2Hz 3,69;m;1H 3,18;dd, 10,5 3,18;d d , 1 , và4,5Hz và4,5Hz 4,08; d, 1Hz 4,27; t, 10 Hz 6,15; br.s 2,21; t;2,5Hz 4,35;d; 11Hz;1H 4,19-4,28;m; 3,95;d, 11Hz; 2H 1H 3,18;d d , 1 , 3,18;d d , 1 , và4,5Hz và4,5Hz 4,08; d, 17Hz 4,24;d;10,5Hz, 3,85; d, 11Hz 4,69; s 4,59; s 1,66; 3H, s 1,03; 3H, s 0,97; 3H, s 0,96; 3H, s 0,82; 3H, s 0,76; 3H, s 2,39-2,45, 1H, m 2,66-2,70; 2H, m; 2,722,77;m;2H 3,96; d, 11Hz 4,68; s 4,59; s 1,68; 3H, s 1,03; 3H, s 0,973; 3H, s 0,967; 3H, s 0,83; 3H, s 0,76; 3H, s 3,99; d, 17Hz 4,68; s 4,58; s 1,67; 3H, s 1,02; 3H, s 3,84;d, 11Hz;1H 4,68; s 4,58; s 1,67; 3H, s 1,02; 3H, s 0,97; 6H, s 0,97; 6H, s 3,86; d, 10 Hz 4,68; s 4,58; s 1,67; 3H, s 1,03; 6H, s 0,97; 3H, s 0,96; 3H, s 0,82; 3H, s 0,76; 3H, s 2,39-2,48; 3H, 2,39-2,45, 5H, m m( H 2,10-2,14; 1H, 19;2Hm 2’; 2H-4’) 1,94- 2,27-2,32; 2H, Hm 3’:2,01 ;m 5,94; br.s 2,22; s 0,82; 3H, s 0,85; 3H, s 0,77; 3H, s 0,76; 3H, s 2,40-2,49; 2H, 2,39-2,44;m m; 2,773,06-3,09;m 2,82,1H,m; 2,95-2,99, 1H, 2,37-2,57; m; m 4H(H-3’; H-6’) 3H-6’(1,03ppm) 1,25;3H-5’,d , J=7Hz 5,73; s 2,94-2,98; H-7’ m, Trên phổ cộng hưởng từ proton hợp chất124a-eđều tìm thấy píc cộnghưởng đặc trưng nhóm NH rộng, tù với độ chuyển dịch khoảng 6-9 ppm Phổ 1HNMR hợp chất dãy amit124a-eđược phân tích tổng hợp bảng 3.6.Cơc h ế p h ả n ứ n g a m i t h ó a c ủ a c c h ợ p c h ấ t a e v i p r o p a g y l a m i n v i x ú c tácDCCvàHOBtđượcđềxuấttheosơđồ3.4[112– 114] Sơđồ3.4.Cơchếphảnứngamithóatổnghợpcácpropagylamit124a-e Phản ứng “Click” tiếp tục sử dụng để tổng hợp hợp chất lai betulin vàAZTquacầuamit-triazol.Tỉlệcácchấtthamgiaphảnứng,tỉlệxúctácvàđiềukiệnphản ứng giữ nguyên phản ứng tổng hợp chất lai123a-f Cấu trúc củacác chất lai chứng minh phổ cộng hưởng từ hạt nhân khẳng địnhsaukhiphântíchphổkhốilượngMS Hình 5.Cấutrúc hóa họcvà mộtsốđặctrưngvậtlícủa cáchợpchất125a-e Bảng 3.9.Một sốtínhiệu cộnghưởngprotonđặctrưng cácchất lai125a-e Hợp phần proton H-3 Ha-28 Hb-28 Khungtrite cpenoit Ha-29 Hb-29 CH3 Gốcđiaxit NH-CH2triazol Hợp phầnAZT CH2 =CH NH H-1” H-4” 2H-5” =CH CH3 NH 125a 125b 3,18 125c 3,16-3,17;m 125d 3,18; dd;J= 11,0và4,5Hz 4,25; t, 11Hz 4,25; t, 10Hz 4,25; t, 10Hz 4,25(0,3H) 4,20(0,7H) 3,88; t;11Hz 3,85; t;10Hz 3,82; t;10Hz 3,94và 3,89 (1H) 4,68; s 4,67; s 4,66; s 4,67; s 4,58; s 4,57; s 4,56; s 4,57; s 1,67(3H); 1,66(3H); 1,65 (3H); 1,66(3H); 1,02(3H); 1,01(3H); 0,99(3H); 0,99(3H); 0,97(3H); 0,95(6H) 0,95(3H) 0,96(3H) 0,96(3H); 0,80(3H); 0,94(3H) 0,95(3H) 0,87(3H); 0,74(3H) 0,79(3H); 0,79(3H); 0,86 (3H) 0,73(3H) 0,74(3H) 2,70;s; 2H; 0,97; d; 6,5 Hz 1,0; d; Hz 2,53; s; 2H (3H-6’) (3H-5’) 4,50; br.s 4,48;svà 4,47; s 4,47; s 4,48-4,49;m 7,76; s 7,85; s 7,88; s 7,85; s 6,70; br.s 6,96; br.s 7,14; br.s 6,96; br.s 6,24; s 6,29; t;6,5Hz 6,31; s 6,31; s 5,41; br.s 5,42; m 5,44; s 5,44; s 3,99;d,11,5Hz 3,97; d; 11Hz 3,96; d; 10Hz 3,96; d; 10Hz 3,79;d,11,5Hz 3,85; d; 11Hz 3,80; d; 10Hz 3,80;d;10Hz 7,47; s 7,57; s 7,62; s 7,62; s 1,92; s 1,88; s 1,87; s 1,89; s 9,18; br.s 9,84; br.s 10,0; br.s 9,70; br.s 125e 3,18; dd;J= 11,0và4,5Hz 4,32(0,5H) 4,20(0,5H) 3,94(0,5H) 3,80(0,5H) 4,67; s 4,57; s 1,66(3H); 1,01(3H); 0,95 (6H) 0,80 (3H); 0,74 (3H) 5,71; t;2H (H4’; H-5’) 4,45-4,55;m 7,78; s ? 6,25, t, 6Hz 5,38-5,4; m 3,78-3,81;m 7,52; t;6Hz 1,92; s 9,28; br.s Bảng 3.10.Tín hiệucộnghưởng13Cđặctrưng cáchợpchất125a-e Cacbon CO-NH NCONH =CHthymidin =Cthymidin C-1” C-2” C-3” C-4” C-5” =Ctriazol =CHtriazol CH2-AZT C=O cầunối 125a 163,5 150,3 138,0 111,4 89,6 37,3 59,4 85,3 61,8 143,3 123,8 57,8 172,6 172,2 125b 164,2 150,6 137,3 111,1 87,2 37,7 59,4 85,2 61,4 137,9 121,5 55,3 173,7 172,8 125c 164,1 150,6 137,3 111,1 87,4 37,6 59,3 85,2 61,4 145,2 122,7 53,5 173,2 172,3 125d 164,1 150,6 137,4 111,1 87,5 37,1 59,4 85,2 61,4 145,3 122,7 57,8 175,1 172,1 125e 163,9 150,1 137,5 111,2 88,0 37,2 59,3 85,3 61,4 145,5 125,9 59,2 174,4 174,3 CH3-AZT C khác 12,5 12,4 12,5 19,9(C-3’) 12,5 17,3 (C-5’) 12,5 124,7;124,8(C4’,C-5’) Đi từ các hợp chất121a-ecó nhóm chức axit, thực chuyển hóa theo sơđồ3.6luận án tổng hợp hợp chất lai betulin AZT qua cầu nối amittriazol125a-e 3.3 TổnghợpcáchợpchấtlaigiữabetulinvàStavudin(d4T) Các dẫn xuất121a-fphản ứng với 1,5 đương lượng mol Stavudin (d4T)trong dung môi dimetylfoocmamit với xúc tác DCC, HOBt nhiệt độ phòng 20giờtheosơđồ3.5.Hiệusuấttổnghợpcáchợpchất1 a - f đạt từ 42% đến 68%.Kiểm tra phản ứng sắc kí mỏng với pha động hện-hexan : etyl axetat(3:7), sản phẩm có đặc điểm hấp thụ UV giống Stavudin với R fgần sát với d4Tnhưngkhihiệnmàu bằngCe(SO4)2thì cómàuxanhđậm Sơđồ3.5.Tổng hợpcác hợp chất lai126a-fgiữabetulinvàd4T Cấutrúccủacáchợpchấtlaiđượckhẳngđ ị n h k h i p h â n t í c h p h ổ c ộ n g hưở ng từ hạt nhân1H và13C Kết phân tích khẳng định phân tích phổHMBCvàHSQCcủahợpchất126b.Thựchiệnphản ứnglầnlượtvớicácaxit121a-f,thuđược6 sản phẩm lai tương ứng126a-f Cơ chế phản ứng este hóa đề xuấttươngtựcơchếphảnứngamithóatổnghợpcáchợpchất124a-e,tácn h â n nucleophin phản ứng đơi electron ngun tử oxi nhóm OH d4Tthaychocặp electroncủaN-propagylamin( S đ 3.6)[112–114] Sơđồ3.6.Cơ chếphản ứngtổng hợpcácchất126a-f Phổ cộng hưởng từ hạt nhân sử dụng để xác định cấu trúc sảnphẩm lai126a-f Trên phổ1H-NMR hợp chất dãy xuất đầy đủc c tín hiệu đặc trưng hợp phần tritecpenoit, hợp phần d4T, đặc biệt có hai protonanken vòng 2,5-dihydrofuran hợp phần d4T proton thơm thymidinrất dễ nhận biết Các tín hiệu phổ 13C-NMR C-20, C-29, C-3, C-28 tínhiệu cộng hưởng đặc trưng khung lupan, tín hiệu đặc trưng hợp phần d4T là2C nhóm C=O amit, 2C anken tín hiệu C nhóm este tìm thấytrên phổ13C hợp chất lai126a-f.Kết phân tích phổ tổng hợp trongbảng3.11và bảng3.12 Bảng 3.11.Tínhiệucộnghưởng13Chợpphầnd4Tcủa cáchợpchất126a-f Cacbon 126a 126b 126c 126d 126e 126f CO-NH 165,9 163,7 163,5 166,3 164,2 164,3 NCONH 152,7 151,0 150,1 151,4 150,0 150,9 =CHthymidin 137,5; 135,5 135,4; 137,9; 135,5; 133,1; =Cthymidin 111,7 111,2 110,8 111,6 111,2 110,8 C-1” 91,4 90,0 89,6 91,4 90,1 89,6 C-2” 127,2 127,4 126,9 127,8 126,9 128,0 C-3” 135,5 133,3 133,1 134,9 133,6 133,9 C-4” 84,2 84,3 83,9 85,3 84,3 85,6 C-5” 64,9 64,9 64,5 66,3 65,1 66,5 CH3thymidin 12,5 12,7 12,2 12,7 12,3 12,7 Hình3.6 Cấutrúchóa họcvàmộtsốđặctrưngvậtlícủa cáchợp chấtlai126a-f Bảng3.12.Cáctín hiệuđặctrưngphổ1H-NMRcủacácchất126a-f Hợp phần proton H-3 Ha-28 Hb-28 Khung Ha-29 tritecpen Hb-29 oit CH3 Gốc điaxit 126a 3,05;t,11 Hz 4,22;d, 11Hz 3,77;t; 11Hz 126b 126c 3,09;t,11 3,04;t, 8,5Hz Hz 4,22;d,11Hz 4,17;d,11Hz 3,78;t;11Hz 3,74;t;11Hz 126d 3,18;dd;11,5 và4,5Hz 4,35 4,27 1H;11,5Hz 3,83 3,88 1H;11,5Hz 126e 126f 3,07-3,09; m 3,19; dd,10; 5Hz 4,32(0,5H) 4,40;d, 4,20(0,5H) 11Hz 3,83(0,5H) 3,99; d; 3,73(0,5H) 11Hz 4,58;s 4,62;s 4,57;s 4,68;s 4,60;s 4,70;s 4,48;s 4,51;s 4,47;s 4,58;s 4,50;s 4,60;s 1,56(H-30); 0,91(6H); 0,86 (3H) 0,83 (3H);0,71 (3H)0,63(3H) 1,67(H-30); 1,02(3H); 0,96(6H) 0,82(3H) 0,76(3H); 1,57(H30); 1,61(H-30); 0,93(3H); 0,99(3H); 0,87(3H) 0,90(3H) 0,84(3H); 0,87(3H); 0,72(3H) 0,76(3H) 0,64(3H) 0,68(3H) 2,52-2,60; 2,30-2,37;m; m;4H(2H- 5H(H-19;2H 2’; 2H-3’); 2’; 2H-4’) 0,91;trùngvới H-tritecpen 1,68(H-30); 1,03(3H); 0,98(3H); 0,97(3H) 0,83(3H); 0,76(3H) 6,93;d,16 Hz;H-2’; 6,85;d,16 Hz;H-3’ 6,26-6,30; m 6,22-6,27; m 6,31;d,6Hz 6,97-6,99; m 6,86-6,87; m 7,0; br.s 5,89-5,92; m 5,85; br.s 5,93; d;6Hz 5,04; br.s 4,94; br.s 5,09; br.s 4,31; dd; 12,5; 4,15 3,30 4,50; dd; 4,5 Hz4,16; (overlap) 12,5; Hz; 4,40; dd; dd; 12,5;4,5Hz 12,5;3 Hz H-3” H-1” H-2” H-4” 2H-5” 6,18-6,2; m 6,23-6,25; m 6,86-6,87; m 6,85; br.s 5,8-5,81; m 5,80-5,81; m 4,93; br.s 4,93; br.s 4,34; dd; 4,31; dd; 12,5; Hz; 12,5; 4,5 4,12; dd; Hz4,16; dd; 12,5;4,5Hz 12,5;3 Hz =CH 7,18;s 7,15;s 7,11;s 7,21;s 7,14; d; 7,5Hz 7,12;s CH3 1,78;s 1,83;s 1,83;s 1,91;s 1,82;s 1,90;s NH - - - 8,36; br.s - 8,26;s Hợp phầnd 4T 6,18-6,20; m 6,89-6,90; m 5,83-5,85; m 4,98; br.s 4,25-4,29;m; 4,09-4,12; m 1,59(H-30); 0,94(3H); 0,90(3H) 0,87(3H); 0,74(3H) 0,67(3H) 1,25;s;(3H-5’) 5,61 5,58; t; 2H(H-4’; H-5’); Khi phân tích phổ tương tác proton-cacbon hợp chất126bchúng nhậnđược kết phù hợp với kết phân tích phổ 1H-NMR và13C-NMR hợp chấtnày Trong đó, hợp phần betulin tín hiệu cộng hưởng proton cacbon hầu nhưkhơng có thay đổi Kết phân tích phổ HMBC HSQC hợp phần d4T hợpchất126bđượctrìnhbàytrongbảng3.13 Việc quy kết tín hiệu proton vịng 2,5-dihydro furan khơng chínhxác tín hiệu cộng hưởng phía trường yếu gần nhau, hình dạngphânphổkhơngrõvàđềulàcáctínhiệumultriplet.TrênphổHMBC,tínhiệuH-1”có tín hiệu tương tác với =CH-thymidin, C-1” C-4” có tín hiệu tương tác vớiH-2” H-3”, đồng thời nguyên tử cacbon hydro vị trí 2” 3” cịn tươngtác chéo lẫn nhau, nhiên C-3” có tín hiệu tương tác với H-5”a H-5”b Vì vậy,kết hợp với phổH S Q C x c đ ị n h đ ợ c đ ú n g c c t í n h i ệ u C - ” , C - ” , C - ” , C - ” v cáctínhiệuprotontươngứng Các hợp chất lai126a-fsẽ nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào hai dịngtếbàoungthưởngườilàtếbàoKB(ungthưbiểumơ)vàHepG2(ungthưgan)cùngvớicáchợpchấtlaidãy123af,125a-evà127a-e Bảng 3.13.PhântíchphổHMBCvà HSQChợp phần d4Tvà cầu nối của126b C-1’ C-2’ C-3’ C-4’ C-5’ Cacbon C δ(ppm) 173,3 33,3 20,1 33,2 172,7 C-1” 90,0 C-2” C-3” 127,4 133,3 C-4” 84,3 C-5” C=Othymidin NCON =Cthymidin =CHthymidin CH3thymidin 64,9 163,5 151,0 111,2 135,5 12,7 TươngtácchínhC-HtrênphổHMBC H_δ (ppm)δ (ppm) Ha-28(4,22,d, 11Hz);Hb-28 (3,78;d, 11Hz) H-2’=H-4’= H-19(2,31-2,39, m) H-2’=H-4’=H-19(2,31-2,39,m),yếu H-2’=H-4’= H-19(2,31-2,39, m) H-5”a(4,31;dd;4,5;12,5Hz);H-5”b (4,16;dd;3,0; 12,5Hz) H-2” (5,83-5,85; m);H-3”(6,23-6,25;m); =CHthymidin(7,15,s) H-3”(6,23-6,25; m); H-5”a(4,31;dd;4,5;12,5Hz);H-5”b (4,16;dd;3,0; 12,5Hz);H-2”(5,83-5,85;m) H-2”(5,83-5,85; m);H-3”(6,23-6,25;m); H-5”b(4,16; dd;3,0; 12,5Hz) =CH-thymidin(7,15,s);CH3-thymidin(1,83;s) =CH-thymidin(7,41,s);H-1”(6,20-6,22; m) =CH-thymidin(7,41,s);CH3-thymidin(1,83;s) H-1”(6,89-6,90; m) =CH-thymidin(7,41,s) HSQC δ (ppm) H-2’a;H-2’b 2,01-3,01;m 1,23;s(CH3) 6,89-6,90;m 5,83-5,85;m 6,23-6,25;m 4,97-4,99 4,31; 4,16 7,15; s 1,83; s 3.4 TổnghợpcáchợpchấtlaibetulinvàLamivudin(3TC) Tiếpn ố i t h n h c ô n g k h i t ổ n g h ợ p c c h ợ p c h ấ t l a i g i ữ a b e t u l i n v S t a v u d i n phản ứng este hóa, chúng tơi tiến hành thực phản ứng dẫn xuất axit121afvới3T C trongđiềukiệnphảnứngvàt ỉl ệ t ácnhân tươngt ựquytrìnht ổnghợp hợpchất126a-f(sơ đồ 3.7) Kết thu hợp chất lai mới127a-e Cấutrúcvàđánhsố cacboncủacácsảnphẩmnhưhình3.7,cáccấutrúcnàyđượcchứngminh phương pháp phổ IR, phổ MS phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H và13C,đồngt h i c h ú n g t ô i c ũ n g p h â n t í c h p h ổ H M B C v H S Q C c ủ a h ợ p c h ấ t a đ ể khẳngđịnhtínhchínhxác cáctínhiệuquykết