Thông tin tài liệu
VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀ CÔNGNGHỆVIỆTNAM VIỆNCÔNGNGHỆSINHHỌC ĐỖHẢI LANI LAN ẾTKẾVÀCHUYỂNGEN AGPoptTỔNGHỢPNHÂNTẠO VÀOCÂYSẮN(ManihotesculentaCrantz) LUẬNNÁNTIẾNNSĨSINHHỌCC HÀNỘI,2017I,2017 VIỆNNHÀNLÂMKHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆ VIỆTC VÀCÔNGNGHỆN VIỆNTNAM VIỆNNCÔNGNGHỆNSINHHỌCC ĐỗHải Lan NGHIÊNCỨUTHIẾTKẾVÀCHUYỂNGEN AGPoptTỔNGHỢPNHÂNTẠO VÀOCÂYSẮN(ManihotesculentaCrantz) Chuyênngành: Sinh lýhọccthựccvậtt Mãsố:62420112 LUẬNNÁNTIẾNNSĨSINHHỌCC NGƯỜIIHƯỚNGNGDẪN KHOAN KHOAHỌC VÀCƠNGNGHỆ VIỆTC: 1.GS.TS.LêTrầnBìnhnBình ViệnnC n g nghện sinhhọcc 2.PGS.TS.LêVănSơnn ViệnnC ô n g nghện sinhhọcc HàNội,i,2017 LỜICẢMƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình PGS TS LêVăn Sơn, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ ViệtNam người thầy tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trongsuốtqtrìnhnghiêncứuthựchiệnvàhồnthànhluậnánnày Tơi xin cảm ơn lãnh đạo tập thể cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật,Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phịng Thí nghiệm trọng diểm cơng nghệ gen,Ban Lãnh đạo, PhòngQuản lý tổng hợp, bộp h ậ n Q u ả n l ý đ o t o s a u đ i h ọ c , Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi mọimặt, hỗ trợ thực thủ tục cần thiết để tơi hồn thành chương trìnhhọctậpvànghiêncứucủaNghiêncứusinh Tơi xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ quý báu TS Hoàng Văn An vàNCS Võ Thị Xuân Kiều, College of Life Science, Kyung Hee University, HànQuốctrongqtrìnhtơi thựchiệnluậnán Tơi nhận tạo điều kiện giúp đỡ mặt từ Ban Giám hiệu, BanChủ nhiệm khoa Sinh - Hóa, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Đào tạo sau đại học,Trường Đại học Tây Bắc suốt trình thực luận án Tôi xin trân trọngcảmơn Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, đồng nghiệpđãlnđộngviênvàkhíchlệtơitrongthờigianqua HàNội,t h n g 11năm2 Tácgiảluậnán ĐỗHảiLan LỜICAMĐOAN Tôixincamđoan: Đây công trình nghiên cứu tơi, thực hướng dẫnkhoahọccủaGS.TS.LêTrầnBìnhvàPGS.TS.LêVănSơn Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đãđược công bố trêncáctạp chíkhoa học chuyênngànhvớis ự đ n g ý v c h o phép đồng tác giả khác Phần cịn lại chưa cơng bố bất kỳcơngtrìnhnào khác HàNội,ngày tháng11n ă m Tácgiảluậnán ĐỗHảiLan MỤCLỤC Nộidung Trang MỞĐẦU CHƢƠNG 1.TỔNGQUANVẤNĐỀNGHIÊNCỨU 1.1.Giớithiệuchungvềcâysắn 1.1.1.Đặc điểmthựcvậthọc 1.1.2.Vaitròvàgiátrịkinhtế 1.1.3.Tìnhhìnhpháttriểncâysắn 1.2.Nghiêncứunuôi cấyinvitrovàhệ thốngchuyểngenởcâysắn 10 1.2.1.Nghiêncứuchọn tạogiốngsắntheo phươngpháp truyềnthống 10 1.2.2.Nghiêncứuni cấyinvitrovàtáisinh 11 1.2.3.Cácnghiêncứuquytrìnhchuyểngen câysắn 15 1.2.4.Tạocâysắnchuyểngentăngcườnghàmlượngtinhbột 18 1.3.Tinh bộtvàqtrìnhtạotinhbộtởcâycócủ 23 1.3.1.Giớithiệuvềtinhbột 23 1.3.2.Cơ chếtổnghợp tinhbột 24 1.3.3.Cácenzimvàgenliênquantíchlũytinhbột 26 1.4.Gentổnghợpbiểuhiệntrongthựcvật 31 CHƢƠNG2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 35 2.1.Vậtliệunghiêncứu 35 2.2.Phƣơngphápnghiêncứu 36 2.2.1.Cácphươngphápliênquanđếnnuôicấymô,táisinhcâysắnvà chuyểngen 37 2.2.2.Cácphươngphápliênquanđếntổnghợpgenvàthiếtkếvector manggennhântạomãhóaenzymeAGPasephụcvụchochuyển gen 2.2.3.C c phương phápliênquanđế n phânt í c h c c d ò n g c â y chuyể n 42 49 gen 2.2.4.Phươngpháptínhtốnvàxửlýsốliệu 52 CHƢƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU 53 3.1.Kếtquảxây dựngquy trìnhni cấyvàtáisinhcâysắn 53 3.1.1.Kếtquảđánhgiá khảnăngtạophôi soma 54 3.1.2.Kết quảđánhgiá khảnăngtáisinhcủaphôisoma 3.2.Kếtquảtốiƣuhóaquytrìnhchuyểngenchỉthịgusvàocâysắn 58 62 3.2.1.TốiưuchủngvikhuẩnA.tumefaciensvàvectorchuyểngenvào câysắn 62 3.2.2.TốiưuvậtliệuvàphươngpháplâynhiễmvikhuẩnA.tumefaciens vàocâysắn 64 3.2.3.TốiưuthờiđiểmlâynhiễmvàmậtđộvikhuẩnA.tumefaciens chochuyển genvàomảnhlá mầmcâysắn KM94 3.2.4.Tốiư u n n g đ ộ ( A S ) v t h i g i a n l â y n h i ễ m v i k h u ẩnA 66 66 tumefaciens 3.2.5.Tốiưuthờigianđồngnuôicấy 68 3.2.6.Tốiưuloạikhángsinhvàngưỡngchọnlọc 69 3.2.7.PhântíchcâysắnKM94/pCB-gus 72 3.3.Kếtquảthiếtkếvectormang gen mãhóaAGPase 73 3.3.1.Tổnghợp gennhântạo mãhóaAGPase 73 3.3.2.Thiết kếvectortáitổhợpchứacấutrúcgenAGPopt 77 3.3.3.Tạoc h ủ n g v i k h u ẩ n A t u m e f a c i e n s t i t ổ h ợ p c hứavector 79 pBI121/AGPoptđãthiếtkế 3.3.4.Đánhgiásự biểu hiệncủagenAGPopttrongcâythuốc 80 3.4.ChuyểngenAGPoptvàocâysắn 88 3.4.1.B i ế n n p g e n A G P o p t v o c â y s ắ n K M n h A t u m e f a ciens 88 CV58/pGV2260 3.4.2.PhântíchcâysắnchuyểngenKM94/AGPopt 90 CHƢƠNG4.BÀNLUẬNKẾTQUẢNGHIÊNCỨU 93 4.1.Nuôi cấy mô vàtáisinhcây sắnphụcvụchuyểngen 93 4.2.Chuyểngenchỉthịchọnlọcgusvàocâysắn 99 4.3.T ổ n g h ợ p g e n n h â n t o A G P o p t m ã h ó a e n z y m e A G P a s evà 103 thiếtkếvectorpBI121/AGPopt 4.4.ChuyểngenAGPoptvàocâysắn KM94 108 KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ 111 DANHMỤCCÁCCƠNGTRÌNHCƠNGBỐKẾTQUẢNGHIÊN CỨUCỦAĐỀTÀILUẬNÁN 112 SUMMARY 113 TÀILIỆUTHAMKHẢO PHỤLỤC 117 DANHMỤCBẢNG STT Bảng1.1 Tênbảng Trang Danhmục5loạicâychiếmkimngạchxuấtkhẩucaotrong ngànhnôngnghiệp 2015 Bảng1.2 Diệntích,năngsuất,sảnlượngsắnnăm2016 Bảng3.1 Ảnhh n g c ủ a , D , p i c l o r a m N A A l ê n t ỉ l ệ t o p h ô i somatừ6loại vậtliệucủa2giống sắnKM140vàKM94 Bảng3.2 56 Ảnhh n g c ủ a n n g đ ộ p i c l o r a m t i s ự h ì n h t h n h p h ô i somat đ ỉ n h c h i v l n o n c ủ a h a i g i ố n g s ắ n K M 94và Bảng3.3 58 KM140nuôicấyinvitro Ảnh hưởng củaBAPvàIBAlên khảnăngtạochồicủaphôi somat l n o n v đ ỉ n h c h i c ủ a g i ố n g s ắ n K M v KM94 Bảng3.4 Ảnhh n g c ủ a n n g đ ộ B A P đ ế n q u t r ì n h t o c h i từ Bảng3.5 phôisomasau4tuầnnuôicấy Khảnăngtạorễcủa chồi Bảng3.6 ẢnhhưởngcủacácchủngvikhuẩnA.tumefaciens,vecto 59 60 61 rvàloạivậtliệulâynhiễmđếnhiệuquảhiệuquảchuyểngen gusvàocâysắnKM94 vàKM140 Bảng3.7 63 Ảnhhưởngcủaphươngphápvàcácloạivậtliệulâynhiễmđếnh iệuquảchuyểngengusvàocủacâysắnKM94và KM140 Bảng3.8 Ảnhhưởngcủamậtđộvikhuẩn vàthờiđiểmlâynhiễmđến hiệuquảchuyểngengusvàolámầmcâysắnKM94 Bảng3.9 67 Ảnhhưởngcủathờigianđồngnuôicấy vànồngđộASđến hiệuquảchuyểngengusvàolámầmcâysắnKM94 Bảng3.11 66 Ảnhhưởng củanồng độASvàthời gianlâynhiễmđếnhiệu quảchuyểngengusvàolámầmcâysắnKM94 Bảng3.10 65 68 Ảnhhưởngngưỡngchọnlọccủakanamycin,neomycinvà 70 paromomycinlênhiệuquảchuyểngengusvàolámầmcây sắnKM94 Bảng3.12 HiệuquảchuyểngenAGPoptvàocâythuốcláK326 81 Bảng3.13 Hàm lượng tinh bột thuốc K326/pBI121/AGPopt Bảng3.14 Khản ă n g t o t o c h i v r a r ễ c ủ a c c m ẫ u s ắ n K M94 /AGPopt 87 90 DANHMỤCHÌNH STT Tênhình Trang Hình1.1 Diệntíchtrồngsắn phântheovùngkinhtế Hình1.2 Cơcấusửdụngsắnở ViệtNam 10 Hình1.3 Sơđồcácbướctái sinhởcâysắn 12 Hình1.4 Sơđồbốnhệthốngchuyểngenvàocâysắn 16 Hình1.5 Cácphảnứng sinhtổnghợptinhbột 26 Hình1.6 Cácenzimthamgiasinhtổnghợptinhbột 19 Hình1.7 CấutrúccủaenzimAGPase 24 Hình2.1 Sơđồthínghiệm 36 Hình2.2 Sơđồcác bướcthiếtkếvectorpBI121/AGPopt 42 Hình2.3 SơđồtổnghợpvectorpBI121/AGPopt 47 Hình2.4 Sơđồcácbước táchchiếtenzimAGPase 51 Hình3.1 Hìnhảnhminhhọacácbướcchuẩnbị,tạovậtliệukhởiđầu phụcvụtái sinhcâysắn 53 Hình3.2 Cácloạivậtliệuchonicấymơvàtáisinhcâysắn 54 Hình3.3 Hìnhảnhmẫuqua cácgiaiđoạntái sinhcâysắnkhácnhau 62 Hình3.4 KếtquảnhuộmX-gluc vớicácloạivật liệu lâynhiễm 64 Hình3.5 Sốl ợ n g c â y KM94/pCBgusđ ợ c t o t h n h t r ê n m i Hình3.6 trườngchọnlọc vớicáckhángsinhcónồngđộkhácnhau Kếtquảđiệndisản phẩ m PCRnhâ n genn p t I I từ dòng sắnchuyển gen Hình3.7 73 Kết quảsosánhtrình tự nucleotidecủa genAGPoptvàglgC ởE.coliK12 Hình3.8 72 75 Hình3.8.Kếtquảsosánhtrìnhtựproteinsuydiễntừg e n AGPoptv i glgC(E.coliK12) 76 Hình3.9 Sơđồcấutrúcgen AGPopttổnghợpnhân tạo 77 Hình3.10 Kếtq u ả đ i ệ n d i s ả n p h ẩ m p h ả n ứ n g c ắ t v e c t o r p B I v 78 pUCIDT/AGPoptbằngXbaIvàSacI
Ngày đăng: 30/08/2023, 20:43
Xem thêm:
