0856 nghiên cứu phân tích thành phần cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh nha trang luận văn tốt nghiệp

I GIỚITHIỆULUẬNÁN I.1 Đặtvấn đề Fucoidan sulfate polysacarit có thành phần củangành rong nâu mà khơng có thành phần lồi thực vật hayđộngvậtkhác Fucoida nc ócấ u trúchóahọcphứctạpbởitínhđa dạngcủa liênkếtglycosidevàkhảnăngphânnhánhvớicácvịtrínhómsulfateđược xếp khơng theo quy luật mạch polymer Thành phần chínhcủa fucoidan fucose sulfate, ngồi chúng cịn có thêm gốcđườngk h c n h g a l a c t o s e , g l u c o s e , m a n o s e , x y l o s e , … v đ ô i k h i l c ả gốcacetyl.Nhờsựđadạngvềcấutrúcmàfucoidansởhữunhiềuhoạttinh sinh học quý kháng đông tụ máu, kháng ung thư, kháng viêm,kháng virút, chống oxi hóa,… với tiềm ứng dụng lớn cáclĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm chức dược phẩm Mặc dù có rấtnhiều cơng trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết fucoidan,nhưngcáckếtquảnghiêncứupháthiệnđượctínhquyluậttrongcấu trúccủa chúng trật tự liên kết gốc đường, phân nhánh vị trícác gốc sulfate cịn hạn chế Mặt khác, mối quan hệ cấu trúcvà hoạt tính sinh học fucoidan thực tế chưa đượcsángtỏ.Để gi úpc ho việ cnghiêncứu cơchếtácdụng củaf uc oi da n lêncá ctếbàosinhvậtvàtiếntớisửdụngfucoidanđểlàmdượcliệuthìviệcxác định xác thành phần cấu trúc hóa học fucoidan điềutiênquyết đangthuhút ýcủanhiều nhà khoahọc trênthế giới Ở nước ta có khoảng 147 lồi rong nâu phân loại,trong lồi rong thuộc chiSargassumcó trữ lượng lớn với hơn60 lồi sản lượng ước tính đạt tới 10.000 rong khơ/năm Tuy nhiêncho đến nước ta chưa có cơng trình nghiên cứu có tính hệthống thành phần hóa học, cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidantừrongnâu Việt Nam Do vậy, chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần,cấut r ú c h ó a h ọ c c ủ af u c o i d a n c ó h o t t í n h s i n h h ọ c t m ộ t s ố l o i rong nâu vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm nghiên cứuvề fucoidan rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm nhữngnguồn dược liệu phục vụ sức khỏe cộng đồng phát triển kinh tế xãhội I.2 Mục tiêu luậnán Nghiên cứu chiết tách phân đoạn fucoidan từ số loài rongnâu Việt Nam Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc mốiquan hệ cấu trúcvớihoạttínhsinhhọccủafucoidan I.3 Nhữngđónggóp mớicủaluậnán 1/ Việc khử trùng ngưng thực phương pháp tự thủyphân (autohydrolysis)sửdụng cácnhóm (-SO 3H)của phântửfucoidan làm nguồn axít để chuyển hóa fucoidan polysacarit dạngfucoidan oligosacarit điều kiện nhẹ nhàng, nên hạn chế tối đa qtrìnhbẻngắnmạchqmứcvềdạngcácmonomerkhơng mong muốn.Nhờvậyđãthuđượccácsảnphẩmfucoidanoligosacaritphùhợpchophântíchkhốiphổ 2/ Lần Việt Nam kết hợp 02 kỹ thuật phân tích khối phổ nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS ESI-MS/MS phân tích cấutrúccủapolysacarit.Việckếthợpnàygiúpchúngtanhậnđượcđầyđủhơncácthơngtinvềcơchế phân mảnh ion carbohydrate phổ khối,nhờvậyđãchophépgiảiđượcmộtcáchtườngminhcấutrúcphứctạpcủafucoidancónguồn ngốctừrongnâuViệtNam 3/ LầnđầutiêncấutrúccủaphânđoạnfucoidanSmF3cóhoạttínhgâyđộctếbàoungthưtừron gS.mcclureiđãđượcthiếtlập.MạchchínhcủafucoidanSmF3gồm→3)-Fucp(4,2SO )-(1→3)-Fucp(4,2SO-)-(1→họa 3 tiếtxenvàocácgốc(1→4)-Fucp(3SO- )và(→6)-Galpở cuối đầukhử 4/ Tất phân đoạn fucoidan từSargassum mcclureiít gây độc tếbào ức chế hình thành tế bào ung thư kết tràng DLD-1, vìvậychúnglàcác tác nhân khángungthưtiềmnăng I.4 Bố cụccủaluậnán Luậnán gồm 113tr a ng: M đ ầ u (02 tr a ng), Nội d un g chínhgồm 98 trang chia làm 03 chương gồm: Chương Tổng quan (33 trang),Chương2 Đ ố i t n g , p h n g p h p n g h i ê n c ứ u v t h ự c n g h i ệ m (11trang),Chương3.Kếtquảvàthảoluận(52trang),Kếtluậnvàkiếnnghị (2 trang), Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án(01trang), 143 tàiliệu thamkhảo (12 trang) II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁNMỞĐẦU Phần mở đầu đề cập tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, đối tượngnghiêncứu,mục tiêu nhiệmvụ luận án CHƯƠNG1.TỔNGQUAN Giới thiệu sơ lược phân bố phân loại rong nâu giới vàởViệt Nam Giới thiệu fucoidan, tình hình nghiên cứu cấu trúc, hoạt tính sinhhọcvà ứngdụngcủa fucoidan từrongnâutrên giớivàởViệt Nam Cácphươngpháp chiết tách phân tíchcấutrúc củafucoidan CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVÀTHỰC NGHIỆM 2.1 Đốitượngnghiêncứu Đốitượng lựa chọn nghiênc ứ u l l o i r o n g n â u p h ổ b i ế n có trữ lượng lớn vùng biển vịnh Nha Trang bao gồm loàirongSargassum denticapum,Sargassum polycystum, Sargassum binderi,Sargassumoligocystum,Sargassumswartzii,Sargassummcclurei,T urbinaria ornata, Padina australis,các mẫu rong thu thập, phânloạivàđịnhdanh chuyên gia phânloàirongbiểnTS.Lê NhưHậu 2.2 Phươngphápnghiêncứu 2.2.1 Phương pháp chiếttách phân đoạn tinhc h ế f u c o i d a n t r o n g nâu: fucoidan thu nhận cách chiết rong dung mơi axitlỗng( p H: ) , s a u đ ó s dụ ng p hư n g p h p s ắ c k ý t r a o đ ổi a n i o n đ ể táchphân đoạntinh chếfucoidan 2.2.2 Các phương pháp phân tích thành phần fucoidan: phương pháptrắcquang,đođộđụcvàphươngphápsắckýlỏng hiệunăngcao(HPLC) 2.2.3 Cácp h n g p h p p h â n t í c h c ấ u t r ú c c ủ a f u c o i d a n : p h â n t í c h l i ê n kếtbằngmethylhóa,phântíchphổhồngngoại(IR),phổcộnghưởngtừhạt nhân (1H-NMR,13CNMR), phổ khối nhiều lần Negative-ion tandemESI-MS/MSvà MAILDITOF/MS/MS 2.2.4 Phươngp h p t h n g h i ệ m h o t t í n h g â y đ ộ c t ế b o c ủ a f u c o i d a n : đượcthực hiệntheo phươngphápcủaLikhitwitaywid vàColburn 2.3 Thựcnghiệm 2.3.1 Phươngphápchiếtvà táchphânđoạn fucoidantừrongnâu Phương pháp chiết fucoidan: Fucoidan thu nhận cáchchiết rong dung mơi axit HCl lỗng (pH: 2-3) 70 oC, thờigian giời (chiết lặp lại lần) Dịch chiết gom lại cô đặc bằngmàng siêu lọc 10kDa, dịch chiết sau kết tủa cồn 98% hoặcđôngkhô để thu bột fucoidan Phươngp h p t c h p h â n đ o n f u c o i d a n :F u c o i d a n s a u k h i đ ợ c phân lập từ rong nâu tiến hành tách phân đoạn tinh chế sắckýtrao đổi aniontrên cột DEAE-cellulose 2.3.2 Cácphươngpháp phântíchthànhphầncủafucoidan Phântíchhàmlượngtổngcarbohydrate:đượcthựchiệnbằngphươngpháp so màuvới phenolvà axitsulfuric đậmđặc, ởλ =490 nm Phân tích thành phần đường đơn: thực sắc ký lỏnghiệunăngcao(HPLC),saukhifucoidanđượcthủyphânbằngtrifluoroaceti c axít Phân tích hàm lượng sulfate: thực phương pháp đođộđục với BaCl2/gelatin,ởbướcsóngλ = 360 nm Phânt í c h h m l ợ n g a x í t u r o n i c : đ ợ c t h ự c h i ệ n b ằ n g p h n g phápso màu vớithuốcthửCarbazol,ởbướcsóngλ=525 nm 2.3.3 Cácphươngpháp phân tích cấutrúc fucoidan Phân tích liên kết methyl hóa: fucoidan methyl hóa bằngmethyl iodua dung mơi dimethylsulfoxide, sau tiến hành thủyphân, khử mở vịng acetylhóa Sản phẩm saukhia c e t y l h ó a đ ợ c phântíchbằngGC-MS Thủy phân tạo oligosacarit-fucoidan sử dụng cho phân tích khốiphổ: đượctiếnhành bằngphươngpháptựthủyphân(autohydrolysis) CHƯƠNG3.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN 3.1 CHIẾTTÁCHVÀPHÂNLẬPFUCOIDANTỪRONGNÂU Fucoidan từ 08 loài rong nâu thuộc chi rongSargassum, PadinavàTurbinađã đượcchiết tách vàp h â n t í c h h m l ợ n g ( b ả n g 3.1) K ế t quảchothấyhàmlượngfucoidandaođộngtừ0,82% (Sargassumswartzii) đến 2,57 % (Sargassum polycystum), hàm lượng fucoidan tronghai loài rongPadina australisvàTurbina ornatatương ứng 1,93 % và1,23 % Như vậy, ta thấy hàm lượng fucoidan loài rong thuộccác chi khác khác chi (Sargassum) cũngkhông giống Sự khác hàm lượng fucoidan lồirongcóthểđượcgiảithíchlàdoảnhhưởngcủacácyếutốsinhtrưởng rongnhưvị tríđịa lý, thời gian thurongvà phươngpháp chiết Bảng 3.1 Hàm lượng thành phần monosacarit fucoidantừ08 loài rongnâuViệt Nam 2Stt Loài rong Hàmlượng fucoidan %* 0,82 Thành phần đường đơn fucoidan(%mol) Fuc Man Gal Xyl 35,8 19,2 32,3 9,9 Glc 2,8 3,4 SO4 % w/w** Axítu ronic %w/w** 20,40 14,28 22,46 21,54 S.swartzii S.oligocystum 1,78 42,3 8,9 38,3 7,1 S.denticapum 2,00 40,1 15,9 38,7 5,3 nd 25,69 21,20 S.mcclurei 2,37 38,5 4,2 33,1 3,6 20,6 33,15 17,87 S.polycystum 2,57 42,4 12,6 23,5 1,3 10,2 25,60 23,74 S.binderi 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 nd 21,47 5,35 Turbinaornata 1,23 55,8 9,2 24,8 9,0 1,2 25,30 7,50 Padina australis 1,93 47,1 2,5 22,3 11,5 16,6 21,90 21,02 * Hàmlượngtínhtheokhốilượng rongkhơđãloạichấtbéo **Hàmlượngtínhtheokhốilượng fucoidan; nd:khơng pháthiệnthấy 3.2 PHÂNTÍCH THÀNHPHẦNHĨAHỌCCỦAFUCOIDAN Để xác định thành phần hóa học fucoidan tiến hànhthủy phân fucoidan thành monomer môi trường axít Việc thủyphân hồn tồn để xác định thành phần đường đơn fucoidan trênthực tế khó xảy ra, chúng tơi tiến hành xác định theo tỉ lệ molgiữa gốc đường thủy phân Sắc ký đồ mẫu đườngchuẩnđượctrìnhbàytrênhình3.1.Kếtquảphântíchthànhphầnmonosacarit, hàm lượng sulfate uronic axít mẫu fucoidanđược trình bàytrênbảng3.1 Hình3.1 Sắc kýđồ HPLCcủacác mẫu đườngđơnchuẩn Kết bảng 3.1 cho thấy fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ35,8-55,8 % tất mẫu fucoidan, cao fucoidantừrongTurbinaornata(55,8%)vàthấpnhấtlàfucoidantừrongS.swartzii(35, 8%) Hàm lượng galactose fucoidan chiết từ loàirong thuộc chiSargassumchiếm tỉ lệ gần hàm lượng fucose, ngoạitrừ fucoidan từ rongS.polycystumcó tỉ lệ fucose:galactose = 2:1 Trongkhi đó, mẫu fucoidan từ hai chi rong khác làTurbina ornatavàPadinaaustraliscũnggiống nhưfucoidan củal o i r o n g S.polycystumhàm lượng galactose chiếm gần nửa so với fucose Ngồi haithành phần fucose galactose, tất mẫu fucoidan 08loài rong nghiên cứu có chứa đường đơn khác với hàm lượng nhỏhơn mannose (2,5-19,2%), xylose (1,3-11,5%) glucose (0-20,6%).Hàm lượng gốc đường biến đổi theo chi rong loàirong, nhiên chi rong chúng biến đổi khơng nhiều Các kếtquả hồn tồn phù hợp với cơng bố trước đa dạngcủat h n h p h ầ n h ó a h ọ c c ủ a f u c o i d a n B ê n c nh t h n h p h ầ n l c c g ố c đường, phân tử fucoidan chứa gốc sulfate vàa x í t uronic Hàm lượng sulfate mẫu fucoidan khác không nhiều(bảng 3.1), dao động khoảng 20,40-33,15%, lớn làfucoidan rongS.mcclurei(33,15%) nhỏ fucoidan từ rongS.swartzii(20,40%), Do phức tạp thành phần cấu trúc, nên việc xácđịnh đặc trưng cấu trúc fucoidan khó khăn Phân đoạntinh chế fucoidan bước quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tíchcácđặc trưngcấu chúng 3.3 TÁCHP H Â N Đ O Ạ N V À P H Â N T Í C H T H À N H P H Ầ N C Ủ A CÁCPHÂNĐOẠN FUCOIDAN 05 loại fucoidan phân lập từ loài rongSargassum swartzii,Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapumvàTurbina ornatađược lựa chọn để tiến hành phân đoạn phântích đặc trưng cấu trúc chúng Vì lồi rong phổ biến,cótrữ lượnglớn có khả năngkhaithácởquy mơ cơngnghiệp Kết phân đoạn tinh chế mẫu fucoidan sắc ký trao đổianion cộtDEAE-cellulose (3,2x32 cm)đ ợ c c h ỉ r a t r ê n h ì n h hình 3.6 Kết tách phân đoạn mẫu fucoidan cho thấy fucoidantừcác loài rongS.denticapum, S.polycystumvàS.mcclureiđều thu được03 phân đoạn khác Kết cho thấy fucoidan từ lồi rongnày tồn 03 kiểu cấu trúc khác Trong fucoidan từhai loài rongTurbinaria ornatavàS.swartziilần lượt thu 04 05phân đoạn khác nhau, fucoidan từ hai loài rong tồntại 04 05 dạng cấu trúc khác Tuy nhiên, phân đoạntương ứng với loài rong rửa giải nồng độ muối NaClkhácnhau, đặc điểm cấu trúccủa cácphânđ o n t n g ứng với lồi rong khơng giống Kết phân tích thành phầnhóahọccủamỗiphânđoạnfucoidantừ05lồirongnghiêncứuởtrên(bảng 3.2-3.6) cho thấy thành phần hóa học phân đoạn fucoidangiữa loài rong khác loại rong khácnhau Tuy nhiên,chúngđềucóđặcđiểm chunglàh m l ợ n g s u l f a t e phân đoạn fucoidan tăng dần theo nồng độ rửa giải muốiNaCl, hàm lượng fucose galactose tăng tỉ lệ nghịch với hàm lượng củacác gốc đường khác, đặc biệt phân đoạn SmF3 từ rongS.mcclureichỉ tồn hai gốc đường fucose galactose Như với phần chínhlà fucose, galactose sulfate fucoidan từ 05 lồi rong xếp vàonhómcác sulfatedgalactofucan, khácvớicácsulfatefucantừrongơn đới SdF1 1,4 2 0,1 1,5 SdF2 DO,490nm NaCl,M 0,6 1,5 SwF1 0,08 0,8 SwF4 SwF5 0,06 NaCl,M SdF3 DO,490nm SwF2SwF2 SwF3 0,12 1,2 0,04 0,5 0,5 0,02 0,2 0,4 50 100 150 200 250 300 350 400 500 450 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V, ml V, ml đoạn fucoidan từ Hình 3.2 Tách phân rongS.denticapumbằng sắc ký trao đổi anion trêncộtDEAE-cellulose 2 SmF2 0,25 1,5 SpF3 1 A490nm 1,5 1,5 SmF1 0,2 NaCl,M SpF1 A,490nm 0,3 SpF2 2,5 SmF3 0,15 NaCl,M Hình 3.3 Tách phân đoạn fucoidan từ rongS.swartziibằng sắc ký trao đổi anion trêncộtDEAE-cellulose 0,1 0,5 0,5 0,05 0,5 0 100 200 300 400 500 600 0 700 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V (ml) V, ml Hình 3.4 Tách phân đoạn fucoidan từrongS.polycystumbằng sắc ký trao đổianiontrêncột DEAE-cellulose 1,4 ToF3 1,2 ToF2 ToF4 1,5 ToF1 0,8 0,6 NaCl,N A,490nm Hình 3.5 Tách phân đoạn fucoidan từrongS.mcclureibằng sắc ký trao đổianiontrêncộtDEAE-Macroprep 0,5 0,2 0,4 0 600700800 0100200300400500 Hình 3.6 Tách phân đoạn fucoidan từ rongTurbinariaornatabằng sắc ký trao đổianiontrên cột DEAE-cellulose V, ml Bảng 3.2 Hàm lượng thành phần đường phân đoạn fucoidantừrongS.denticapumthuđược bằngsắc kýtrao đổi anion Phân đoạnfucoida n SdF1-0,5МNaCl Hàml ượng (%)* 17,2 Tổngcarboh ydrate (%)* 48,04 23,67 Thànhphầnmonosacarit, mol% Fuc Man Gal Xyl 38,6 22,1 24,6 14,7 SdF2-1,0МNaCl 45,7 54,12 27,64 48,6 12,8 28,2 10,4 SdF3-1,5МNaCl 15,3 54,09 39,14 51,9 5,8 33,4 8,9 *:t í n h t h e o khối lượngcủafucoidan SO24 (%)* Bảng 3.3 Hàm lượng thành phần đường phân đoạn fucoidantừrongS.swartziithu bằngsắc ký traođổi anion Phânđoạn Hàm SO42fucoidantheo lượng (%) nồngđộNaCl (%) SwF1-0,5М 2,0 5,6 SwF2-0,8М 20,2 14,6 SwF3-1,0М 33,3 18,4 SwF4-1,2М 26,2 28,0 SwF5-1,5М 16,0 42,3 nd: khôngpháthiện thấy Thànhphầnmonosacarit,mol% Fuc Man Gal Xyl Rham Glc nd 49,5 56,0 55,6 57,1 nd 4,7 3,0 3,6 4,0 nd 29,4 28,9 27,9 27,4 nd 2,7 1,9 2,4 0,9 nd 2,7 1,9 3,3 2,0 nd 3,0 3,2 2,8 2,0 Bảng 3.4: Hàm lượng thành phần đường phân đoạn fucoidantừrongS.polycystumthu bằngsắc kýtrao đổianion Phânđoạnf ucoidan theonồng độNaCl SpF1-0,5М SpF2-1,0М SpF3-1,5М Hàm lượng( %) Tổngcarboh ydrate(%) SO24 (%) Thànhphầnmonosacaritcủafucoidan, %mol Fuc Man Gal Xyl Rham Glc 18,3 43,2 21,0 56,43 59,15 54,97 20,11 25,67 33,99 28,0 59,2 68,6 26,7 6,0 nd 12,7 26,6 26,9 11,3 0,2 4,5 13,1 8,0 nd Bảng 3.5 Hàm lượng thành phần đường phân đoạn fucoidantừrongS.mcclureithuđược bằngsắc ký trao đổi anion Phânđoạnf ucoidan theonồng độN a C l SmF1-0,8M SmF2-1,2M SmF3-1,6M Hàm lượng( %)* Tổngcarbohy drate(%)* SO24 (%)* Thànhphầnmonosacarit,%mol Fuc Man Gal Xyl Gluc 8,4 18,2 10,5 44,65 64,59 55,62 16,8 25,7 35,0 27,2 44,8 58,5 34,0 5,4 nd 19,6 34,1 41,5 6,4 5,3 nd 12,8 10,4 nd Bảng 3.6 Hàm lượng thành phần đường phân đoạn fucoidantừrongTurbinaornatathuđược bằngsắc kýtrao đổi anion Phân đoạn fucoidantheonồngđộ NaCl ToF1-1,15М ToF2-1,25М ToF3-1,50М ToF4-1,80М Hàmlư ợng(%) SO24 (%) Thànhphần monosacarit,mol% Fuc Man Gal Rham 6,6 29,7 10,3 18,4 23,87 43,26 38,75 32.36 71,9 69,6 82,1 75,6 4,5 nd 2,4 2,9 23,6 27,7 9,4 18,8 nd 2,7 6,1 2,7 8,2 nd nd Theo tài liệu cơng bố, fucoidan rong nâu nói chung vàgalactofucan sulfate hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rộngvàđa dạng hoạttính kháng ung thư, kháng đơng tụm u , k h n g v i rút,Do vậy,trướckhitiếptụcnghiêncứusâuhơnvềcácđặctrưng cấu trúcc ủ a f u c o i d a n r o n g n â u V i ệ t N a m n h ằ m m ụ c đ í c h ứ n g d ụ n g c h ú n g làm thực phẩm dược liệu Chúng tơi tiến hành khảo sát hoạttính ức chế số dịngtếbào ungthưngười 3.4 HOẠTTÍNH SINHHỌCCỦAFUCOIDAN 3.4.1 Hoạttính gây độc tếbào ung thưcủafucoidan Fucoidan từ 06 loài rongS.mcclurei(F-Sm), S.polycystum(FSp),S.swartzii(F-Ss),S.denticapum(F-Sd),S.oligocystum(F-So)vàTurbinaria ornata(F-To) chúng tơi lựa chọn thử nghiệm hoạt tínhgây độc tế bào 05 dòng ung thư người ung thư gan (Hep-G2),ung thư màng tim (RD), ung thư phổi (LU), ung thư ruột kết (DLD-1) vàung thưv ú ( M D A - M B ) T h í n g h i ệ m đ ợ c t h ự c h i ệ n t i V i ệ n H ó a học Hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam,Viện Hóa sinh Hữu Thái Bình Dương - Nga Viện Sinh học vàCôngnghệsinhhọcHànQuốc.Kếtquảchothấytấtcảcácm ẫ u fucoidan thử nghiệm cho kết dương tính với 02 dịng tếbào ung thư, fucoidan từ rongS.swartziicho kết dương tínhtrên04 dịngtế bàoungthư(bảng3.7 3.8) Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc tế bào fucoidantừ06 lồi rongnâucủa Việt Nam Fucoidan Dịngtế bào ungthưcủangười Kếtluận Hep-G2 RD LU DLD-1 + MDA-MB231 nd F-Sp + nd nd F-Sm + - nd nd + F-So + + nd nd nd F-Ss + + + + - F-Sd + + nd nd - F-To + + nd nd nd Dươngtính 02dịng Dươngtính 02dịng Dươngtính 02dịng Dươngtính 04dịng Dươngtính 02dịng Dươngtính 02dịng Bảng3.8.Giá trịIC50củacác mẫufucoidancó hoạt tính gâyđộc tếbào Fucoidan GiátrịIC50(µg/ml) Dịngtếbào Kếtluận HepG2 RD LU DLD-1 MDAMB-231 Chứng(+) 0,25 0,1 0,32 0,1 0,2 F-Sp 4,5 7,1 CXĐ CXĐ CXĐ Dươngtính02 dịng F-Sm 2,4 20,0 CXĐ 6,5 CXĐ Dươngtính02 dịng F-So 18,5 10,4 CXĐ CXĐ CXĐ Dươngtính02 dịng F-Ss 3,8 16,7 15,5 CXĐ 5,4 Dươngtính04 dịng F-Sd 8,1 15,4 CXĐ CXĐ CXĐ Dươngtính02 dịng F-To 12,8 10,9 CXĐ CXĐ CXĐ Dươngtính02 dịng 3.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn fucoidan phânlậptừrongSargassum swartziivàSargassum mcclurei Trongs ố m ẫ u f u c o i d a n đư ợc t h n g h i ê m h oạ t t í n h g â y đ ộ c t ế bàoởt rên,chúngtơilựachoncácphânđoạncủafucoidantừS.swartziivàS.mcclure itiếp tục thử nghiệm với dịng tế bào ung thư vú ung thưruột kết Kết cho thấy tất phân đoạn thử nghiệm cho kếtquả dương tính với mức độ ức chế khác (hình 3.7 3.8) Nhưvậy thấy hoạt tính sinh học fucoidan phụ thuộc vào yếu tốđặc trưngcấutrúc fucoidan Sựứcchếpháttriểntếbào,% 120 100 μg/mlg/ml 0,5 μg/mlg/ml 80 60 40 20 Đốichứng SwF1 SwF2 SwF3 SwF4 SwF5 Nồngđộcácphânđoạnfucoidan Hình 3.7 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MDA-MB231củacácphân đoạnfucoidantừ rongSargassumswartzii Đốichứng SmF1 (100μg/ml)g/ml) SmF2 (100μg/ml)g/ml) SmF3 (100μg/ml)g/ml) SmF3-DS (100 μg/ml)g/ml) Hình 3.8: Hiệu ức chế phát triển tế bào ung thư kết tràng DLD1củacácphân đoạnfucoidanđược chiết tách từrongSargassum mcclurei 3.5 ĐẶCTRƯNGCẤUTRÚCCỦACÁC PHÂNĐOẠN FUCOIDAN 3.5.1 Cácđặctrưngcấutrúcthu đượctừphổIR Các phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3, SmF3 ToF2 từ 05 lồi rongcó hoạt tính sinh học tốt, đồng thời có thành phần đường đơn giản sovớicácphânđoạn fucoidan lại lựa chọn để phân tích đặctrưng cấu trúc Kết phân tích phổ hồng ngoại phân đoạnfucoidan thu dải hấp thụ số sóng từ 1240-1272cm-1cho thấy có mặt nhóm sulfate Ngồi ra, dao độnghấp thụ vùng số sóng từ 800-845 cm -1cho biết vị trí nhómsulfate trêncác gốc đườngpyrannose(bảng3.9) Bảng 3.9 Một số vân phổ đặc trưng phổ hồng ngoại fucoidanđượcchiếttách từmột số loàirongnâuViệt Nam Mẫu Số sóngdao động Vịtrí nhómsulfate đặctrưng(cm-1) SdF3 847,90 Nhómsulfatechủ yếu vị tríC4 SpF3 835,40 Nhómsulfatechủ yếu vị tríC4 SwF5 803,77 Nhómsulfatechủ yếu ởvị tríC2 và/hoặcC3 SmF3 839,22 Nhómsulfatechủ yếu vị tríC4 ToF2 820,00 Nhómsulfatechủ yếu ởvị tríC2 và/hoặcC3 3.5.2 CácđặctrưngcấutrúcthuđượctừphổNMR * Phổ13C-NMR: Giống nhiều fucoidan rong nâu khác giới đượccông bố, fucoidan rong nâu Việt Nam có phổ 13C-NMR phứctạp với nhiều vùng tín hiệu trùng lặp chồng lấn phân tử củachúngđượccấutạobởicácgốcđườngfucose(C6H12O5)vàhexose(C6H12O6)khácnha u, điều rấtkhó đểg i ả i t h í c h đ ợ c m ộ t c c h đ ầ y đủvềcấutrúccủa chúng.Tuynhiên,trênphổ13C-NMR tất cácphân đoạn fucoidan có đặc điểm chung để nhận biết fucoidanthơng qua tín hiệu gốc α-L-Fucpđó tín hiệu mạnh xuấthiện vùng trường cao 15-18 ppm đặc trưng cho nhóm metyl (CH3-)và tín hiệu vùng trường thấp 97-102 ppm đặc trưng cho cacbonα-anomeric (C1) gốc đường 1→3)-α-L-fucopyranose, vùng tín hiệu67-86 ppm vùng cacbon C2-C5 vịng pyranoid Bên cạnh đó,phổ13C-NMR cho thấy có mặt gốc đường β-DGalactosethơng qua tín hiệu đặc trưng cho cacbon C6 khơng liên kết cacbonC1 gốc β-D-Galactose tương ứng độ dịch chuyển hóa học trongvùng 61-62 ppm 103-104 ppm Ngồi ra, tín hiệu độ dịch chuyểnhóa học 20,9 ppm vùng (173-175 ppm) phổ13C-NMR cácphân đoạn SpF3 SwF5 cịn có mặt nhóm O-acetyl trongphântử hailoại fucoidannày α-L-Fucp-C6 α-L-Fucp C2-C5 α-(1,3)-L-Fucp-C1 β-D-Gal-C6 β-D-Gal-C1 Hình3.11.Phổ13C-NMR củaphânđoạnfucoidanSdF3 từS.denticapum * Phổcộnghưởngtừhạtnhân1H-NMR: Phổcộnghưởngtừhạtnhân1H-NMRcủacácpolysacaritn ó i chungvàcủafucoidannói riêng phức tạp, độ phân giải khơngcaovớirấtnhiềupictrùngchậpvàchenlấnnhau.Vìvậy,rấtkhóđểgiải thích thỏa đáng tất tín hiệu phổ Mặc dù vậy, giốngnhư loại fucoidan cơng bố trước đó, phổ 1H-NMR cả05phânđoạnfucoidan SdF3,SpF3,SmF3,SwF5vàToF2đềuxuấthiệnnhững tín hiệu mạnh vùng trường cao 1,2-1,8 ppm đặc trưng cho protonH6củanhómmethyl vịngfucosevàcáctínhiệuxuất hiệntrongvùng4,9-5,2 ppm đặc trưng cho proton H1 vịng 1→3)-α-Lfucopyranose.Bêncạnhđótrênphổ1HNMRcũngxácnhậnsựcómặtcủag ố c galactose thơng qua tín hiệu độ dịch chuyển hóa học 3,1-3,3 ppm và5,3-5,4 ppm đặc trưng cho proton H6 H1 vịng β-DGalactose.Ngồi ra, phổ phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3 ToF2 cịnxuất nhóm tín hiệu vùng 2,1-2,3 ppm cho thấy có mặt củanhómO-acetyl C2-C5 β-D-Galp-H1 β-D-Galp-H6 α-(1,3)-L-Fucp-H1 α-L-Fucp-H6 OAc(CH3) Hình3.12.Phổ1H-NMRcủaphânđoạnfucoidanSdF3 (S.denticapum) Như vậy, từ kết phân tích thành phần hóa học, phổ hồng ngoạivàp h ổ c ộ n g h n g t h t n h â n ( 1H-NMRv CNMR)c h o t h ấ y đ ặ c điểm cấu trúc 05 phân đoạn fucoidan đại diện cho lồi rongS.polycystum, S.denticapum, S.mcclurei, S.swartziivàTurbinaria ornatathuộc nhóm sulfated galactofucan có cấu tạo mạch chủ yếu cácgốc 1→3)-α-L-Fucp, gốc βD-Galpcó thể tồn mạch và/hoặc ởmạch nhánh Chính phức tạp thành phần cấu trúcmạch nhánh, nên việc phân tích cấu trúc chi tiết fucoidan vơ cùngkhó khăn Do vậy, phân đoạn fucoidan SmF3 từ rongS.mcclureilà phânđoạn có hoạt tính sinh học tốt có thành phần hóa học đơn gian sẽđượclựa chọnđểtiếp tục nghiên cứuchitiếthơnvề cấu trúc hóahọc 3.6 PHÂNTÍCHCẤUTRÚCCỦAPHÂNĐOẠNFUCOIDANSmF3ĐƯ ỢCCHIẾTTÁCHTỪRONGNÂUSARGASSUMMCCLUREI Theo kết mục 3.3, phân đoạn SmF3 có thành phần làfucose, galactose vàs u l f a t e (35%), tỉ lệ fucose:galactose ≈ : , , n g o i rakhông chứa thêm thành phần đường khác (bảng 3.5).P h ổ F T - I R phân đoạn SmF3 giúp ta nhận biết có mặt nhóm sulfate thơngqua tín hiệu 1262,73 cm -1(S=O) 839,22 cm-1(S-C-S) (hình 3.13),ngồirađỉnhhấpthụởsốsóng839,22cm -1cịn cho biết vị trí nhóm thếsulfate phân tử fucoidan SmF3 ởa x i a l ( C ) c h i ế m u t h ế T u y nhiên, liệu phổ hồng ngoại cho biết thông tin nhóm sulfate vị tríaxial (C4) hay equatorial (C2 C3) vịng pyranose nói chung màkhơng phân biệt thuộc vịng fucose hay galactose Vì vậy, để giảiquyết vấn đề tiến hành phân tích phương pháp phổcộnghưởngtừ hạt nhân vàphổ khối Trên phổ13C-NMR (hình 3.14) fucoidan tự nhiên phân đoạnSmF3 S=O C-O-S Hình 3.13: Phổ FT-IR fucoidan- SmF3 từ rong nâu Sargassum mcclurei tín hiệu mạnh vùng trường cao 15,5-17,7 ppm vùnganomeric 96,0100,4 ppm đặc trưng cho C-1 C-6 vịng α-L-fucose Các tín hiệu 102,7 ppm, 61,7v , p p m l ầ n l ợ t đ ặ c t r n g c h o cacbon C-1, C-6 tự C-6 có liên kết gốc β-D-galactose Tổ hợpphức tạp tín hiệu vùng 67,8-85,0 ppm cacbon vịngpyranose C2-C5 Ngồi khơng phát thấy tín hiệu chứng tỏ sựcómặtcủacácnhómacetatvà axítu r o n i c trongphân tửfucoidan SmF3 Sự phức tạp phổ1H-NMR phân đoạn fucoidan SmF3 cũngtươngtựnhưcácloạifucoidankhácđãcơngbố,nênviệcgiảithíchthỏa đáng tín hiệu phổ điều khơng thể Tuy nhiên, phầnthông tin đặc trưng cấu trúc fucoidan thu nhận từphổ 1H-NMR thơng qua tín hiệu đặc trưng gốc đường fucose vàgalactose.Đ ó l c c t í n h i ệ u m n h t r o n g v ù n g t r n g c a o , , p p m củaprotonH6 (nhóm methyl)vàvùng 5,2-5,3ppm thuộcvềprotonH1(αanomeric) gốc 1→3)-α-L-Fucp,tín hiệu nhỏ 5,0 ppm làH1 gốc 1→4)-α-L-Fucp Bên cạnh đó, tín hiệu đặc trưng choproton H6 H1 gốc β-D-galactose xác nhận thơng qua tínhiệuởđộ dịchchuyển hóahọc 3,7 ppmvà 5,4 ppm α-L-Fucp-C6 C2-C5 α-(1,3)-L-Fucp β-D-Galp-C6 β-D-Galp-C1 Hình3.14: Phổ13C-NMRcủafucoidan-SmF3từrongSargassummcclurei * Khửsulfate Khử sulfate thực nhằm mục đích làm đơn giản hóa cấutrúccủafucoidanphânđoạnSmF3.Kếtquảđophổ 13C-NMRcủafucoidan đề sulfate hóa SmF3-Ds cho thấy tín hiệu đặc trưng cacbonC6khơngliênkếtcủagốcβ-D-Galactose ở61,7ppmđãtănglênđángkểsovớitrước khiđượckhửsulfate,điềunàychỉranhómsulfatedcóthểtồntạiởvịtríC-6 mộtsố gốc galactose * Phântích liên kếtbằngphươngphápmethylhóa Kết phân tích liên kết methyl hóa fucoidan SmF3(bảng 3.10) cho thấy chủ yếu gốc fucose liên kết (46%), với mộtlượngíthơn gốc galactose liên kết (18%), fucose liên kết 4chiếm12%v g a l a c t o s e l i ê n k ế t c hỉ c ó 2% F u c o i d a n S m F c ó c a gốc fucose galactose đầu mạch khơng khử có gốcgalactoseliên kết(1→6)ởcuốimạch khử Việcpháthiện cácgốc3,4-và2,4-di-O-methyl-galactitolc h o thấynhómsulfateở vịtríC2/C3và/hoặcC4củagốcgalactosevà/hoặcgốcgalactose tồn tạiở mạch nhánh Bảng3.10.Phântíchmethylhóacủafucoidanđề sulfatehóa SmF3-DS Thànhphầncácgốcđường mol Dạngliên kết (methylated fucitol % hoặcgalactitolacetate) 2,3,4-tri-O-methyl-fucitol Fuc1→ 2,3-di-O-methyl-fucitol 12 →4Fuc1→ 2,4-di-O-methyl-fucitol 46 →3Fuc1→ 2,3,4,6-tetra-O-methyl-galactitol Gal1→ 2,3,6-tri-O-methyl-galactitol 18 →4Gal1→ 2,3,4-tri-O-methyl-galactitol →6Gal1→ 3,4-di-O-methyl-galactitol →2,6Gal1→ 2,4-di-O-methyl-galactitol →3,6Gal1→ 1,2,3,4-tetra-O-methyl-galactitol →6Gal Nhưv ậ y , b ằ n g c c p h n g p h p p h â n t í c h h ó a h ọ c v p h â n t í c h phổ IR,NMR,đặctrưngcấutrúccủafucoidanSmF3đãđượcxácđịnhnhư sau: mạch tạo nên chủ yếu gốc α-L-fucose-(1→3),trong thành phần mạch và/hoặc mạch nhánh cịn chứa gốcα-L-fucose-(1→4); galactose-(1→4) galactose(1→6) Nhóm sulfate ởvịtríC2 và/hoặcC4 gốc đườngfucosevàgalactose Để khẳng định lại cấu trúc dự đoán xác định trật tự liên kết gốc đường phân tử fucoidan SmF3, oligofucoidanSmF3 phân tích khối phổ nhiều lần (MALDI-TOF/MS/MSvàESI-MS/MS) *Phổk h ố i c ủ a o l i g o s a c a r i t đ ợ c đ i ề u c h ế b ằn g p h n g pháp tựt hủy phânfucoidan SmF3 Hiệu suất phân đoạn oligosacarit SmF3-AH đạt 85% sovới SmF3.Kếtquảphântíchthànhphầnmonosacaritcủaphânđoạnnàycho thấy hàm lượng (% mol) fucose chiếm 68,5%, hàm lượng galactosechiếm 31,5% Kết phân tích thành phần monosacarit phân đoạntrọng lượng phân tử cao thu sau thủy phân cho thấy hàm lượnggalactose giảm xuống (14,7%) hàm lượng fucose tăng lên (85,3%) Sovới kết thu phân tích fucoidan từ loài rong thuộc bộLaminarialestrong điều kiện tự thủy phân cho thấy phân tửfucoidan SmF3 không chứa đoạn mạch dài tạo nên cácgốcgalactose.Đểchứngminhchodựđốnnàychúngtơitiếnhànhphân tích khối phổ nhiều lần với chế độ ion âm (negative-ion tandem MS) đoạn mạch ngắn nhằm xác định trật tự liên kết đường trongphânt f u c o i d a n P h ổ k h ố i c ủ a o l i g o f u c o i d a n S m F A H đ ợ c đ o t h e o haiphươngpháplàMALDI-TOF/MS/MSvàESI-MS/MS Hình 3.15 Phổ khối MALDI-TOF chế độ ion âm fucooligosacaritSmF3từrongS mcclureinhận bằngtự thủyphân Kết đo khối phổ hai phương pháp cho thấy tín hiệu lớnnhất mảnhởm/z: 243,0 monosulfated fucose [Fuc(SO 3)]-cùng vớimộttậphợpcácionmảnh khácnhư(m/z:224,98;387,09;533,14;695,15vàcácmảnhionkhác)vàlượnglớncácmonosulfatedfucooligosacarit(m/z: 389,10; 535,15; 681,16 827,13) (bảng 3.11) Tiếp theo lần lượtcác mảnh ion mảnh oligosacarit phân tích đặc trưngcấu trúc phương pháp khối phổ nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS vàESI-MS/MS Cơ chế phân mảnh xảy theo quy tắc đề xuất bởiDomonvà Costello Bảng 3.11 Các đặc trưng cấu trúc số oligosacarit nhận từfucoidanSmF3 rongS.mcclureibằngtự thủyphân m/z MALDI[ M*-Na]243,00 389,10 405,10 491,04 ESI [M-nNa]n− 243,016 259,012 389,077 405,070 234,0102- - 182,3233- - 187,6542- Thành phần/đặc trưng cấu trúc monosacaritvàoligosacarit − Fuc(4SO−3), Fuc(2SO− ),Fuc(3SO ) − − Gal(4(6)SO 3),Gal(2SO ) [Fuc2(SO3)]− Gal(2SO−3)-(1,3)-Fuc Fuc(2SO−3)-(1,3)-Fuc(2 SO− )3 Fuc-(1,3)-Fuc(2,4SO−3) Fuc(2SO−3)-(1,4)-Fuc(2 SO− )** Fuc(2SO− )-(1,4)-Fuc(2,3 SO− )33 Fuc(2,4SO−3)-(1,3)-Fuc** Gal(4/6,3SO−3)-(1,3/4)-Fuc(2/3SO− )3 Fuc(2,4SO−3)-(1,4)-Gal(2 SO− )3 507,03 242,008 535,15 551,15 653,05 681,16 697,15 783,04 799,03 - 535,136 231,007 236.341 315,0402380,0742388,0702285,0283- 827,13 843,12 859,10 944,97 960,95 989,05 1005,04 1062,79 1090,87 1106,87 460,0942339,0513338,551 541,065 *M:muốinatrisulfateoligosacarit Gal(2 SO3− )-(1,3)-Fuc(2SO− )3 Gal(2 SO3− )-(1,3)-Fuc(2 SO−3)** [Fuc3(SO3)]− [Fuc3(SO3)]3− Gal(2SO3− )-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc [Fuc2Gal(SO3)3]3− [Fuc2Gal(SO3Na)2−Na]− [Fuc4(SO3)]− [Fuc3Gal(SO3)]− [Fuc4(SO3Na)2−Na]− [Fuc3Gal(SO3Na)2−Na]− Gal(2SO- )-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(SO- )-(1,3)-Fuc(SO )33 Gal(4/6,2SO- )-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(2SO )33Fuc-(1,4)-Gal(3SO-3)-(1,3)-Fuc(2SO- )-(1,3)-Fuc(2SO )3 [Fuc5(SO3)]− [Fuc4Gal(SO3)]− [Fuc3Gal2(SO3)]− [Fuc4Gal(SO3Na)2-Na]− [Fuc3Gal2(SO3Na)2-Na][Fuc3Gal2(SO3)3]3− [Fuc5Gal(SO3)− [Fuc4Gal2(SO3)]− [Fuc3Gal2(SO3Na)3-Na][Fuc5Gal(SO3Na)2−Na]− [Fuc4Gal2(SO3Na)2−Na]− **Các ionmảnhđặc trưngchokiểuliênkếtcócườngđộthấp Trên phổ ion-âm ESI-MS/MS mảnh monosulfated galactose[GalSO3]-ở m/z 259,02 xuất hai tín hiệu có cường độ mạnhtương đương số khối m/z 138,98 ( 0,2X) m/z 198,99 (0,2A) Theocơng bố Tissot cộng sự, vị trí nhóm sulfate ảnh hưởng đến chếphân mảnh vịng đường Các tín hiệu m/z 138,98 ( 0,2X) m/z 198,99(0,2A) đặc trưng cho vị trí nhóm sulfate C-2 C-4 Kết đo phổ 13CNMR fucoidan khử sulfate SmF3-DS cho thấy tín hiệu nhóm methylC-6 khơng liên kết vòng Galactose tăng lên đáng kể so với fucoidanSmF3 trước khử sulfate, điều chứng tỏ nhóm sulfate có thểtồnt i v ị t r í C c ủ a g ố c đ n g n y N h v ậ y , m ả n h m -/ z , tươngứngvới haidạngcấutạolà Gal(4/6SO ) vàGal(2SO ) 3 Phổ ESI-MS/MS MALDI-TOF/MS/MS chế độ ion âm củamảnh fucose monosulfate [FucSO 3]-ở m/z 243,0 (hình 3.16 A,B) cũngxuất tín hiệu m/z 182,9 (0,2A) vàm / z , ( 0,2X) cho thấy vịtrí nhóm sulfate C-4 C-2 gốc α-L-Fucp Tuy nhiên, phổMALDI-TOF/MS/MS tín hiệu m/z 182,9 cao tín hiệu m/z 138,9(hình3.16A)chỉrarằnggốcfucoseđượcsulfatehóaởvịtríC-4nhiều hơnC-2.Nhưvậy,phổMS/MScủamảnhởm/z243,0chothấynólàhỗnhợpcủa hai monosulfatefucosegồmFuc(4SO- )và Fuc(2 SO- ) 3 Hình 3.16 Phổ MALDI-MS/MS mảnh [FucSO3]-ở số khối 225,0 (A)vàphổ ESI-MS/MS củamảnh [FucSO3]-ởsố khối 243,02 (B) Trên phổ MALDI-TOF/MS/MS mảnh [Fuc 2(SO3Na)2-Na]-ởm/z 491,0 (hình 3.17A) xuất tín hiệu mảnh ion B 1ở m/z 225,0;Y1ở m/z 243,0 với tín hiệu nhỏ gồm 0,2Xoởm/z 138,9;0,2A2ở m/z 329,0và0,2X1ở m/z 386,9 Cho thấy,mảnh[Fuc2(SO3Na)2-Na]-ở m/z 491,0 hỗn hợp hai disacarit đượctrình bày bảng 3.11 hình 3.17A Phổ ESI-MS/MS mảnh[Fuc2(SO3)3]3−tạim/z182,33 (3.17B) thu tín hiệu ion Y1’ ởm/z 160,98tương tứng với gốc disulfated fucose phía đầu khử, ion B1ởm/z 225,01 tương ứng với gốc monosulfated fucose đầu không khử, ion0,2Xoở m/z 138,9 tương ứng với gốc sulfate vị trí C-2, ion 2,4A2ở m/z181,99 sinh từ phân mảnh gốc fucose phía đầu khử đượcsulfatehóaképởvịtrí C-2vàC-3.Nhưvậy,mảnh[Fuc2(SO3)3]3-tạim/z182,33sẽ cócấutạo miêutatrênhình 3.17B Hình3.17.PhổMALDI-TOF/MS/MScủa[Fuc2(SO3Na)2-Na]-tạim/z 491,00(A)vàCIDESI-MS/MScủa[Fuc2(SO3)3]3−tạim/z182,33(B) Tiếpt h e o c h ú n g t ô i n g h i ê n c ứ u đ ặ c t r n g c ấ u t r ú c c ủ a c c m ả n h vớis ốkhốim/z 405,10và 507,03đâylầnlượtlàcácmảnhdi sac arit có chứagalactose[FucGal(SO - )]-và[FucGal(SO - )] 2-(bảng3.11).Kếtquả 32 phân tích phổ khối nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS mảnh ion nàychothấyvị trí liên kết thích hợp gốc galactose điểm cuốicủađầumạchkhơngkhử.Cáckếtquảnàychỉrarằngcácgốcgalactosecóthể ởvịtrícuốicùngtrêncácđoạnmạchcócấutạolàcácgốcα-LFucpliên kết Để làm sáng tỏ thêm nhận định trên, chúng tơi tiến hànhphântíchphổkhốinhiềulầnESI-MS/MScủamảnhion[GalFuc(SO- )] 333 số khối m/z 187,65 (Hình3.18) Hình 3.18 Phổ khối nhiều lần ESI-MS/MS mảnh ion[GalFuc(SO- )]333-tại sốkhối m/z 187,65 Trên phổ ESI-MS/MS mảnh [GalFuc(SO 3)3]3-m/z 187,65 chothấy tín hiệu mạnh mảnh m/z 159,97 ionB′1(phông innghiêng để ký hiệu ion hỗn hợp dấu “′” để ký hiệu ion sulfatehóa kép) tương ứng với gốc galactose sulfate hóa kép phía đầu mạchkhơng khử chiếm đa số (hình 3.18) Bên cạnh đó, tín hiệu cao củamảnh ion 0,2A1ở m/z 182,99 và0,2X1ở m/z 138,97 có mặt củagốc fucose khơng khử, sulfate hóa vị trí C-2 C-4, kết hợp vớitín hiệu mảnh ion 0,3A1ở m/z 168,98 cho thấy nhóm sulfate vị tríC3củagốcgalactosephíađầumạchkhử.Nhưvậy,mảnh[GalFuc(SO 3)3]3-m/z 187,65 hỗn hợp hai disacarit có cấu tạo nhưđượctrình baytrongbảng3.11 hình 3.18 KếtquảphântíchphổESI-MS/MScủaiontriplysulfatedtetrasacarit [Fuc3Gal(SO3)3]3-ởm/z 285,03(Hình 3.19)c h o t h ấ y k h ả mảnhnày tồn tạiítnhất3biến thể cấu trúc(bảng 3.11).L ầ n đ ầ u tiên,bằngphươngphápphântíchphổkhốinhiềulầnMS/MScủa