0810 nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theobroma cacao l) chuyển gen luận văn tốt nghiệp

VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM VIỆNCÔNGNGHỆSINHHỌC HÀHỒNGHẠNH NGHIÊNCỨUTÁISINHINVITRO VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacaoL.)CHUYỂNGEN LUẬNÁNTIẾNSĨSINHHỌC HÀNỘI-2015 VIỆNCÔNGNGHỆSINHHỌC HÀHỒNGHẠNH NGHIÊNCỨUTÁISINHINVITRO VÀTẠOCÂYCACAO(TheobromacacaoL.)CHUYỂNGEN Chuyên ngành: Di truyền họcMãsố:6242 0121 LUẬNÁNTIẾNSĨSINHHỌC Ngƣờihƣớngdẫnkhoahọc: 1.TSLÊTHỊ THUHIỀN 2.PGS.TSNÔNGVĂNHẢI HÀNỘI -2015 LỜICAMĐOAN Tơixincamđoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi, thực hướng dẫn khoahọccủa TS LêThịThuHiềnvàPGS.TS.NôngVănHải Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đượccông bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép cácđồngtácgiảkhác.Phầncịnlạichưađượcaicơngbốtrongbất kỳcơngtrìnhnàokhác Hà Nội, ngàythángnăm2 Tá cgiảluậnán HàHồngHạnh i LỜICẢMƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Thu Hiền - Phó Viện trưởngViện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trưởngphòng Đa dạng sinh học hệ gen người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiệnthuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu thực luận án.Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nông Văn Hải - Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệgen,ViệnHànlâmKhoahọcvàCơngnghệViệtNamđãnhiệttìnhhướngdẫn,giúpđ ỡtơitrongqtrìnhthựchiệnluậnán Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo cán thuộc Viện Nghiên cứuhệ gen, đặc biệt tập thể cán nghiên cứu Phòng Đa dạng sinh học hệ gen lnquantâmvàgiúpđỡ,gópýchotơithựchiệnvàhồnthànhbảnluậnán Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Chu Hồng Hà cán Phịng Cơngnghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệViệtNamđãgiúpđỡvàtạođiềukiệnthuậnlợichotơiđượcthựchiệnmộtsốthínghiệm Phịng Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp,Th.S Bùi Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiệnthuận lợi mặt, hỗ trợ thực thủ tục cần thiết để tơi hồn thànhchươngtrìnhhọctậpvànghiêncứucủaNghiêncứusinh Tơi muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình người thân bên tơi,chăm sóc, động viên giúp yên tâm học tập nghiên cứu Tôi gửi lời cảm ơntớicácbạnbèvàđồngnghiệpđãđộngviên,khíchlệtơithựchiệnluậnán Luận án thực khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu tái sinhin vitrovàtạo ca cao (Theobroma cacaoL.) chuyển gen” thuộc Chương trình Trọng điểmphát triển ứng dụng Công nghệ sinh học lĩnh vực Nông nghiệp Phát triểnnông thôn đến năm 2020 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn quản lý Tôi xintrân trọng cảm ơn trợ giúp quý báu chuyên viên Vụ Khoa học Công nghệ vàMôitrường,BộNông nghiệpvàPháttriểnNôngthôn Tácgiảluậnán ii MỤCLỤC MỤCLỤC III DANHMỤCHÌNH VI DANHMỤCBẢNG .VIII DANHMỤCCÁCTỪVÀCHỮVIẾTTẮT .IX MỞĐẦU CHƢƠNG1:TỔNGQUANTÀILIỆU 1.1 GIỚITHIỆUCHUNGVỀCÂYCACAO 1.1.1 Nguồngốc vàvịtríphânloạicacao .4 1.1.2 Đặcđiểmhìnhthái củacâycacao 1.1.3 Ýnghĩa kinhtếcủacâycacao .8 1.1.4 Bệnhdonấmởcâycacao .9 1.1.5 PháttriểncâycacaoởViệtNam .11 1.2 NGHIÊNCỨUDITRUYỀN VÀCHỌNTẠOGIỐNGỞCÂY CACAO .12 1.2.1 Nghiênc ứ u d i t r u y ề n v c h ọ n t o g i ố n g c a c a o t h e o p h n g p h p t r u y ề n thống 12 1.2.2 Chọntạ ogiốngca ca o s ửd ụ n g côngnghệs inh h ọ c 15 1.3 GENMÃ HÓACHITINASE .26 1.3.1 Nguồng ố c v c ấ u t r ú c c ủ a c h i t i n a s e t ự n h i ê n 26 1.3.2 Chitinaseở m ộ t s ốđ ối t ợ n g s i nh v ậ t 27 1.3.3 Vaitrò c ủ a ge n m ã h óa c h i t i n a s e 29 CHƢƠNG2:VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁP 32 2.1 VẬTLIỆU .32 2.1.1 Mẫuthựcvật 32 2.1.2 Cácvectorvàchủngvi khuẩn 32 2.13.H óa chất,thiếtbị 33 2.2 PHƯƠNGPHÁP 34 2.2.1 Cácphươngphápliênquanđếntáisinhinvitrocâycacao 34 iii 2.2.2 Cácphươngphápliênquanđếnphânlậpgenmãhóachitinasevàthiếtkếcácvectorc huyểngenthựcvật .38 CHƢƠNG3:KẾTQUẢ .48 3.1 TÁISINHINVITROMỘTSỐDÒNG CACAONGHIÊNCỨU 48 3.1.1 Thuthậpmẫu 48 3.1.2 Xácđịnhkhảnăng tạomơ sẹotừnhịlépvàcánhhoaởcácdịng cacao 49 3.1.3 Xác định khả nhân sinh khối mô sẹo từ nhị lép cánh hoa dịng cacao 51 3.1.4 Cảmứngtạophơisomasơcấp 53 3.1.5 Cảmứngtạophôisomathứ cấp 55 3.1.6 Tạocâycacaoinvitrohoànchỉnh .57 3.1.7 Khảnăngthíchứngcâycacaoinvitroravườnươm .60 3.1.8 Quytrìnhtáisinhinvitrocâycacao .62 3.2 PHÂNL Ậ P G E N M Ã H Ó A C H I T I N A S E V À T H I Ế T K Ế V E C T O R B I Ể U HIỆNTHỰCVẬT 63 3.2.1 Nhânvàtạo dòngvùng genTcChi1_W .63 3.2.2 Thiếtk ế v e c t o r b i ể u h i ệ n t h ự c v ậ t m a n g g e n m ã h ó a c h i t i n a s e s d ụ n g h ệ vectorpCB301 70 3.2.3 TạocácchủngvikhuẩnA.tumefacienstáitổhợpchứavectorbiểuhiệnthựcv ậtđãthiếtkế 73 3.2.4 Kiểmtrahoạtđộngcủacấutrúcgenchuyểntrêncâythuốc 75 3.3 CHUYỂNGENCHỈ THỊGUS/GUSPLUSVÀOCÂY CACAO 77 3.3.1 Lựachọnc hủngvi k h u ẩ n , vectort h í c h h ợ p thờ igia n lâynhiễmvi khuẩ nchochuyểngenvàocacao 78 3.3.2 Chuyểngenchỉthịgus/gusplusvàodòngcacaoTD8 80 3.3.3 Phântíchvàđánhgiá mơ,câychuyểngen 81 3.4 CHUYỂNGENMÃHÓACHITINASE VÀOCÂYCACAO 84 3.4.1 BiếnnạpgenmãhóachitinasevàodịngcacaoTD8 84 3.4.2 Kiểmtracâycacaochuyểngenbằngcácphươngphápsinhhọcphântử 87 iv 3.4.3 QuytrìnhchuyểngenthơngquaA.tumefaciensvàodịngca caoTD8 89 CHƢƠNG4:THẢO LUẬN .91 KẾTLUẬNVÀĐỀNGHỊ 102 NHỮNGCƠNGTRÌNHCƠNGBỐ LIÊNQUANĐẾNLUẬNÁN 104 TÀILIỆUTHAMKHẢO 105 SUMMARY PHỤL Ụ C v DANHMỤCHÌNH Hình1.1 Bệnhnấmở câycacao……………………………………………… 10 Hình2.1.Mộtsốvectorsửdụngtrongnghiêncứu…………………………… 32 Hình2.2.Sơđồbốtríthínghiệm……………………………………………… 34 Hình2.3.Hoacacao…………………………………………………………… 35 Hình3.1.Ảnhhưởngcủanồngđộ2,4-DvàTDZđếntỷlệtạophơitừnhịlép mộtsố dịngcacaonghiêncứu…………………………………… 50 Hình3.2 Ảnhhưởngcủakiểugen đếntỷlệtạo mơsẹotừnhịlép…………… 51 Hình3.3 Mơsẹo từnhịlépvàcánh hoatrên mơitrường PCGvàSCG……… 52 Hình3.4 Tỷlệ tạo phơisơcấptừnhị lépvàcánh hoacacao………………… 54 Hình3.5 Táisinh phơi sơcấptừnhị lépvàcánhhoacacao………………… 54 Hình3.6 Tỷlệtạo phơisomathứcấptừtrụcmầmvàlá mầm……………… 56 Hình3.7 Táisinhphơi somathứcấptừtrục mầmvàlá mầmcủa phơisomasơ cấpdịngcacaoTD8………………………………………………… 57 Hình3.8 Tỷlệphơisomasơcấp tạochồi vàrarễ…………………………… 59 Hình3.9 Tạochồivàrarễtừ phơisomasơcấpvàthứcấp…………………… 59 Hình3.10 Tỷlệcâyconsốngtrên cácloạigiá thể khácnhausau20ngày…… 60 Hình3.11 Cáccâyca caoinvitrotrênmơitrườngracây…………………… 61 Hình3.12.Quytrìnhtáisinhinvitrocâycacao……………………………… 62 Hình3.13 TáchchiếtDNAtổngsốtừlácacaodịngTD3…………………… 63 Hình3.14.SảnphẩmnhânvùnggenT c C hi 1- W vàxửlýpJET+TcChi1-W/ 1, pJET+TcChi1-W/7vàpJET+TcChi1-W/ 65 13bằngB g l IItrêngelagarose0,8% ………………………………………………………… Hình3 15 T rì nh t ự n u c l e o t i d e v ù n g g e n T c C h i U phânlậptừdòngcacao 67 TD3…………………………………………………………………… Hình3 16 S o s n h t r ì n h t ự p r o t e i n T c C h i c a c a o d ò n g T D v i m ộ t s ố trìnhtựchitinaselớpIcủamộtsốlồithựcvậtkhác…………… 69 Hình3.17.SảnphẩmPCRnhângenTcChi1vàsảnphẩmxửlýBglIIvàNotI cácplasmidtáitổhợppJET+TcChi1trêngelagarose0,8% 70 vi