Luận án tiến sĩ nông nghiệp xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây lan hài (paphiopedilum sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ***** VŨ QUỐC LUẬN XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU TRONG NGHIÊN CỨU TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY LAN HÀI (Paphiopedilum sp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ***** VŨ QUỐC LUẬN XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU TRONG NGHIÊN CỨU TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY LAN HÀI (Paphiopedilum sp.) Chuyên ngành Mã số : Khoa học trồng : 62.62.01.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Dương Tấn Nhựt TS Đỗ Khắc Thịnh 2017 i LỜI CAM ĐOAN Các số liệu luận án kết nghiên cứu tơi nhóm tác giả nghiên cứu từ năm 2010 đề tài dự án phòng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên: (1) Đề tài cấp sở chọn lọc, thực năm 2011-2012: Bước đầu nghiên cứu tái sinh lan hài (Paphiopedilum sp.), theo định số 26, ngày 14 tháng 03 năm 2011 Viện Sinh Học Tây Nguyên (2) Đề tài cấp sở, thực năm 2013-2014: Nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng ánh sáng đơn sắc lên trình sinh trưởng phát triển in vitro ex vitro lan hài (Paphiopedilum sp.), theo định số 19, ngày 25 tháng 02 năm 2013 Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (3) Đề tài cấp Quốc gia: Hệ thống chiếu sáng đơn sắc – nguồn sáng nhân tạo cho nghiên cứu tái sinh nhân giống số loại trồng nuôi cấy in vitro, mã số: 106.16-2012.32, Quỹ Khoa học Công nghệ Quốc Gia (NAFOSTED) thuộc Khoa học Công nghệ quản lý (4) Dự án sản xuất cấp Viện Hàn Lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam: Hồn thiện quy trình nhân giống Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với số lượng lớn hệ thống chiếu sáng đơn sắc (LED) phục vụ nhu cầu tỉnh Quảng Nam; nên phép sử dụng để báo cáo với kết tơi thực Tồn số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa sử dụng để công bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm cam đoan Đà Lạt, ngày 22 tháng 02 năm 2017 Người cam đoan Vũ Quốc Luận ii LỜI CẢM ƠN Trong sống người, phải có ước mơ, hồi bão, lý tưởng cho riêng Nhưng điều thực hay khơng tâm thân, giúp đỡ tận tình mặt vật chất tinh thần người xung quanh Từ ngày chập chững tìm hiểu nghiên cứu khoa học 14 năm, quãng thời gian khơng dài, đủ em hiểu “công việc người làm nghiên cứu khoa học ln đầy dãy khó khăn thách thức” Để thực ước mơ khám phá điều lạ, cần phải có quãng thời gian đủ dài với lòng say mê làm việc cách nghiêm túc Cảm ơn Thầy Dương Tấn Nhựt giúp em bay cao hơn, xa thực ước mơ, hoài bão, lý tưởng Thầy truyền cho em niềm say mê làm việc, say mê nghiên cứu khoa học, làm việc u thích niềm hạnh phúc vô lớn Cảm ơn Thầy Đỗ Khắc Thịnh (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam), tận tình hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực luận án Cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập trình thực đề tài Cảm ơn toàn thể anh chị em Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên nơi thực nội dung đề tài luận án, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Cuối xin gởi lời cảm ơn thiêng liêng đến gia đình, vợ, ln nguồn động viên, an ủi, giúp đỡ suốt trình làm luận án Đà Lạt, ngày 22 tháng 02 năm 2017 Tác giả luận án Vũ Quốc Luận iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt xiii Danh mục bảng xiv Danh mục hình xvii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu yêu cầu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài Những đóng góp luận án Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lan hài (Paphiopedilum) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Nguồn gốc phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái - đặc trưng lan hài 1.1.4 Sinh thái 1.1.5 Giá trị kinh tế lan hài 12 1.1.6 Sự suy thoái tuyệt chủng loài lan hài tự nhiên 13 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển in vitro thực vật 13 1.2.1 Ảnh hưởng mẫu cấy đến khả phát sinh hình thái 13 1.2.1.1 Tuổi 14 1.2.1.2 Tuổi mô quan 14 1.2.1.3 Tình trạng sinh lý 14 1.2.1.4 Điều kiện phát triển 14 1.2.1.5 Vị trí mẫu cấy 15 iv 1.2.1.6 Kích thước mẫu cấy 15 1.2.1.7 Vết thương 15 1.2.1.8 Phương pháp cấy 15 1.2.1.9 Ảnh hưởng ánh sáng 16 1.2.1.10 Ảnh hưởng chất khoáng 16 1.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên sinh trưởng phát triển thực vật 17 1.3.1 Auxin 17 1.3.2 Cytokinin 17 1.3.3 Gibberellin 17 1.4 Vai trò ánh sáng thực vật 19 1.4.1 Ảnh hưởng ánh sáng đến sinh trưởng thực vật 19 1.4.2 Ảnh hưởng ánh sáng đến trình quang hợp 19 1.4.3 Ánh sáng quang phát sinh hình thái 21 1.4.3.1 Thụ quan ánh sáng đỏ (phytochrome) thực vật 21 1.4.3.2 Các thụ quan ánh sáng xanh dương thực vật 21 1.4.4 Ánh sáng nhân tạo vi nhân giống trồng 23 1.4.4.1 Cơ sở việc sử dụng LED đỏ LED xanh dương nghiên cứu 25 1.4.4.2 Ảnh hưởng đèn LED đến sinh lý trồng 26 1.4.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng LED nuôi cấy in vitro 27 1.5 Ảnh hưởng hợp chất hữu đến trình sinh trưởng in vitro 29 1.5.1 Ảnh hưởng peptone đến trình sinh trưởng in vitro 29 1.5.2 Ảnh hưởng bột khoai tây đến trình sinh trưởng in vitro 29 1.5.3 Ảnh hưởng nước dừa đến trình sinh trưởng in vitro 30 1.5.4 Ảnh hưởng bột chuối đến trình sinh trưởng in vitro 31 1.6 M t số nghiên c u tái sinh nh n giống in vitro đối tượng lan hài 31 1.6.1 Các kết nghiên cứu tái sinh nhân giống đối tượng lan hài cơng bố tạp chí nước 32 v 1.6.2 Các kết nghiên cứu tái sinh nhân giống đối tượng lan hài đăng tạp chí ngồi nước 33 1.6.2.1 Phương pháp nhân giống truyền thống đối tượng lan hài 33 1.6.2.2 Tái sinh nhân giống phương pháp gieo hạt 33 1.6.2.3 Tái sinh nhân giống từ chồi đỉnh 36 1.6.2.4 Tái sinh nhân giống thông qua mô sẹo PLB 36 1.6.2.5 Tái sinh nhân giống thông qua hình thành chồi trực tiếp 39 1.6.2.6 Tái sinh nhân giống thông qua chồi nách 39 1.6.2.7 Tái sinh nhân giống phương pháp gây vết thương 40 1.6.2.8 Tái sinh nhân giống in vitro phương pháp cắt đốt, cắt theo chiều dọc ngang thân in vitro 41 1.6.2.9 Tái sinh chồi nhân giống từ phát hoa 42 1.6.2.10 Những ưu nhược điểm phương pháp nhân giống lan hài 42 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 44 2.1 Vật liệu 44 2.1.1 Nguồn mẫu từ hạt 44 2.1.2 Nguồn mẫu chồi non 44 2.1.3 Nguồn mẫu chồi non chồi non vườn ươm kéo dài nguồn sáng khác 44 2.1.4 Nguồn mẫu in vitro 46 2.1.5 Thiết bị - dụng cụ 46 2.1.6 Thiết bị chiếu sáng 46 2.1.6.1 Đèn huỳnh quang 46 2.1.6.2 Hệ thống chiếu sáng LED 46 2.1.7 Giá thể trồng điều kiện nuôi cấy in vitro ex vitro 47 2.1.7.1 Giá thể trồng 47 2.1.7.2 Điều kiện chiếu sáng nhiệt độ 48 2.2 Phương pháp nghiên c u 48 2.2.1 Phương pháp gieo hạt 48 vi 2.2.2 Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non 48 2.2.3 Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt thân 48 2.2.4 Nhân giống phương pháp cắt đốt 49 2.2.5 Phương pháp nhân giống thông qua mô sẹo 49 2.2.6 Phương pháp nhân giống thơng qua PLB có nguồn gốc từ hạt 49 2.2.7 Phương pháp hủy đỉnh 49 2.2.8 Phương pháp gây vết thương 50 2.3 N i dung nghiên c u 50 2.3.1 Phương pháp gieo hạt 50 2.3.1.1 Thí nghiệm Khả nảy mầm hạt lồi lan hài mơi trường khống khác 50 2.3.1.2 Thí nghiệm Ảnh hưởng mơi trường khống khác đến sinh trưởng chồi lồi lan hài ni cấy in vitro 51 2.3.2 Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh 51 Thí nghiệm Khảo sát thời gian khử trùng chồi non loài lan hài vườn ươm 51 2.3.3 Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt thân 51 2.3.3.1 Thí nghiệm Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến kéo dài lóng thân lồi lan hài vườn ươm 52 2.3.3.2 Thí nghiệm Ảnh hưởng mẫu cấy có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng khác đến khả tái sinh chồi in vitro lồi lan hài 52 2.3.3.3 Thí nghiệm Ảnh hưởng giá thể đến khả tái sinh chồi từ mẫu cấy đốt thân vườn ươm loài lan hài 52 2.3.4 Nhân giống phương pháp cắt đốt 53 2.3.4.1 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả kéo dài chồi in vitro loài lan hài 53 2.3.4.2 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng GA3 lên khả kéo dài chồi in vitro loài lan hài 54 vii 2.3.4.3 Thí nghiệm Kéo dài chồi in vitro loài lan hài điều kiện che tối hoàn toàn khả sống sót đốt thân ngồi vườn ươm 54 2.3.5 Phương pháp nhân giống thông qua mô sẹo 55 2.3.5.1 Thí nghiệm 10 Cảm ứng tạo callus từ lát cắt ngang lóng thân ngồi vườn ươm kéo dài điều kiện tối ngắt quãng loài lan hài 55 2.3.5.2 Thí nghiệm 11 Ảnh hưởng 2,4-D TDZ đến q trình nhân nhanh mơ sẹo loài lan Vân hài 55 2.3.5.3 Thí nghiệm 12 Ảnh hưởng kết hợp NAA với BA TDZ đến q trình tái sinh chồi từ mơ sẹo loài lan Vân hài 56 2.3.6 Phương pháp nhân giống thông qua PLB có nguồn gốc từ hạt 57 2.3.6.1 Thí nghiệm 13 Ảnh hưởng 2,4-D đến q trình cảm ứng tạo PLB loài lan hài 57 2.3.6.2 Thí nghiệm 14 Ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với TDZ, BA KIN lên trình nhân nhanh PLB lồi lan hài 57 2.3.6.3 Thí nghiệm 15 Ảnh hưởng nguồn gốc PLB khác lên khả hình thành chồi lồi lan hài 57 2.3.7 Phương pháp hủy đỉnh 59 Thí nghiệm 16 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh lên khả tạo chồi bên loài lan hài 59 2.3.8 Phương pháp gây vết thương 60 Thí nghiệm 17 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương đến khả kích thích tạo chồi bên loài lan hài 60 2.3.9 Ảnh hưởng hợp chất bổ sung lên trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 60 2.3.9.1 Thí nghiệm 18 Ảnh hưởng nước dừa non đến trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 60 2.3.9.2 Thí nghiệm 19 Ảnh hưởng bột khoai tây lên trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 61 viii 2.3.9.3 Thí nghiệm 20 Ảnh hưởng peptone lên trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 61 2.3.9.4 Thí nghiệm 21 Ảnh hưởng bột chuối lên trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 62 2.3.10 Trồng loài lan hài điều kiện vườn ươm 62 Thí nghiệm 22 Ảnh hưởng giá thể đến trình sinh trưởng loài lan hài 62 2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý số liệu 63 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 3.1 Phương pháp gieo hạt 64 3.1.1 Khả nảy mầm loài lan hài mơi trường khống khác 64 3.1.2 Ảnh hưởng mơi trường khống khác đến sinh trưởng phát triển chồi lồi lan hài ni cấy in vitro 67 3.2 Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh 70 Thời gian khử trùng chồi non loài lan hài vườn ươm 70 3.3 Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt th n 73 3.3.1 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác lên kéo dài lóng thân loài lan hài vườn ươm 73 3.3.2 Ảnh hưởng mẫu cấy có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng khác đến khả tái sinh chồi in vitro loài lan hài 78 3.3.3 Ảnh hưởng giá thể lên khả tái sinh mẫu cấy đốt thân vườn ươn loài lan hài 81 3.4 Nhân giống phương pháp cắt đốt 85 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến khả kéo dài chồi loài lan hài in vitro 85 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi lan loài lan hài in vitro 88 12 Hình 3.16 Ảnh hưởng giá thể đến khả tái sinh mẫu cấy đốt thân ex vitro lan hài Tam Đảo sau 45 ngày ni cấy Hình 3.17 Chồi lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tái sinh in vitro giá thể khác sau 45 ngày nuôi cấy a b Chồi bên lan hài Tam Đảo tái sinh giá thể gòn; c Chồi tái sinh giá thể khác nhau: BG bơng gịn, CGL cầu giấy lọc, Gelrite, Agar; d e Chồi bên lan Vân hài tái sinh giá thể bơng gịn; f g Chồi bên lan hài Hồng tái sinh giá thể bơng gịn Kết Luận: Tỷ lệ mẫu cấy tái sinh (48,45%; 44,90%; 25,3%) giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh thu môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn, có bổ sung mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 3.4 Nhân giống phương pháp cắt đốt 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác đến khả kéo dài chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo in vitro Bảng 3.7 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả kéo dài chồi lan Vân hài in vitro Chiều Chiề Khối Khối Giá Điều kiện chiếu Số Chiều cao u dài lượng lượng trị sáng rộng chồi tươi khô SPAD ĐC (Neon) 1,92h 4,00b 5,06cd 1,39abc 4,25cd 0,41bc 46,62a g b bc de def c 50% R + 50% B 2,97 4,00 5,37 1,14 4,02 0,39 41,77b 30% R + 70% B 4,32f 4,00b 6,10a 1,25cde 4,57b 0,44b 39,47c c b ab a a a 70% R + 30% B 6,85 4,00 5,70 1,45 5,20 0,51 38,55c 100% B 5,85d 4,00b 5,15cd 1,36abc 3,75fg 0,36d 36,07d 100% R 5,15e 4,00b 5,15cd 1,42ab 4,37bc 0,42bc 34,52e 100% Gr 6,82c 4,00b 5,82a 1,30abcd 3,90efg 0,32d 32,07f bc b ab bcde g d 100% Y 7,15 4,00 5,75 1,27 3,72 0,33 30,12g 100% Wh 7,37b 4,00b 5,48d 1,23cde 3,27h 0,26f 28,37h a a e e g d Trong tối 8,55 4,75 3,42 1,11 3,45 0,32 4,67i 5,19 3,88 5,43 8,03 4,38 5,22 2,77 CV% * * * * * * F-test * 13 Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.8 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả kéo dài chồi lan hài Hồng in vitro Chiều Chiều Chiều Khối Khối Điều kiện chiếu Số cao dài rộng lượng lượng Giá trị sáng chồi tươi khô SPAD ĐC (Đèn huỳnh f b a a a a 1,72 4,00 4,80 2,19 4,22 0,40 45,47a quang) 50% R + 50% B 2,72f 4,00b 4,65a 1,72abc 3,37b 0,32b 41,82b 30% R + 70% B 2,62f 4,00b 4,02bc 1,86ab 3,29bc 0,30bc 39,42c f b c bc bcd bc 70% R + 30% B 2,55 4,00 3,85 1,56 3,15 0,30 40,00c 100% B 7,85a 4,75a 4,15b 1,43bc 4,22a 0,40a 39,72c e b bc abc bcd bc 100% R 3,72 4,00 4,00 1,61 3,15 0,30 38,85c 100% Gr 7,10c 4,00b 3,15e 1,35bc 2,97cd 0,28cd 30,07f c ab d c e e 100% Y 6,92 4,50 3,52 1,22 2,30 0,22 34,37d 100% Wh 5,52d 4,00b 3,17e 1,29bc 1,70f 0,15f 32,42e b ab f bc d d Trong tối 7,45 4,50 2,92 1,27 2,85 0,26 6,97g 3,92 7,25 4,14 8,91 6,98 7,49 2,98 CV% * * * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.9 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả kéo dài chồi lan hài Tam Đảo in vitro Chiều Số Chiều Chiều Khối Khối Điều kiện chiếu sáng cao dài rộng lượng lượng Giá trị 1 chồi (cm) tươi khô SPAD ĐC (Đèn huỳnh quang) 0,72fg 3,00 4,32b 1,26a 1,50a 0,142a 42,00a 50% R + 50% B 1,12d 3,00 4,37b 0,92b 1,32b 0,130ab 37,40b 30% R + 70% B 0,85ef 3,00 4,10c 0,70c 1,12c 0,112bc 36,57bc 70% R + 30% B 0,67fg 2,50 3,60de 0,67c 0,92de 0,087d 35,57c g de de de de 100% B 0,60 2,50 3,60 0,55 0,85 0,082 34,35d de d b d cd 100% R 1,02 3,00 3,70 0,90 0,95 0,095 29,22e b bc cd d de 100% Gr 1,75 2,50 4,22 0,62 0,95 0,082 26,70f a a ef e ef 100% Y 2,02 2,75 4,57 0,50 0,77 0,065 24,70g c de ef f fg 100% Wh 1,35 2,50 3,60 0,50 0,60 0,052 19,17h a e f g g Trong tối 2,10 2,50 3,42 0,40 0,40 0,035 3,55i 4,35 7,08 2,98 3,64 10,63 1,11 2,70 CV% * NS * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo in vitro Bảng 3.10 Ảnh hưởng GA3 lên khả kéo dài chồi lan Vân hài in vitro 14 Chiều Khối Khối Giá trị Số Chiều Chiều cao lượng lượng SPAD dài rộng chồi tươi khô d f a d d mg/L (ĐC) 0,50 3,02 3,55 1,20 1,27 0,130 30,45d c e ab d d mg/L 2,65 2,95 6,15 1,05 1,35 0,132 32,85c mg/L 3,95b 2,87 8,65c 1,12ab 1,75c 0,160c 36,67b mg/L 4,65a 2,85 9,65a 1,12ab 2,50a 0,235a 40,82a mg/L 3,85b 3,05 9,20b 1,07ab 2,00b 0,195b 40,30a mg/L 3,97b 3,00 7,45d 0,97b 1,70c 0,160c 38,05b 3,59 5,54 1,81 9,16 6,91 8,23 3,82 CV% * NS * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.11 Ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi lan hài Hồng in vitro Chiều cao Chiều Chiều Khối Khối Giá trị Số Nồng độ GA3 chồi dài rộng lượng lượng SPAD (cm) mới tươi khô mg/L (ĐC) 1,65e 4,00b 3,55c 2,00a 3,60ab 0,342ab 36,53b mg/L 3,00d 4,25ab 3,67c 1,40b 3,10c 0,297b 36,92ab mg/L 7,00c 4,17b 4,00b 1,25c 3,37b 0,235ab 37,00ab mg/L 7,50c 4,25ab 4,25a 1,22c 3,42b 0,297ab 37,27ab b ab a c ab ab mg/L 10,00 4,32 4,42 1,22 3,55 0,312 37,35ab mg/L 13,25a 4,75a 4,45a 1,05c 3,72a 0,352a 37,55a 7,69 9,85 4,88 5,88 4,37 8,94 1,58 CV% * * * * * * F-test * Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.12 Ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi lan hài Tam Đảo in vitro Số Khối Khối Chiều Chiều Giá trị Nồng độ GA3 Chiều lượng lượng cao chồi dài rộng SPAD tươi khô e d a a mg/L (ĐC) 0,45 2,37 1,95 1,17 0,61 0,057 34,30 mg/L 0,55d 2,50 2,90c 0,85b 0,58 0,050ab 33,85 mg/L 0,75d 2,47 3,15b 0,87b 0,58 0,056ab 33,72 mg/L 1,02c 2,32 3,07bc 0,87b 0,60 0,045b 33,40 mg/L 1,37b 2,37 3,47a 0,97b 0,61 0,056ab 33,25 mg/L 1,55a 2,57 3,57a 1,00b 0,62 0,052ab 33,12 9,76 6,68 3,99 9,99 8,72 12,57 2,11 CV% * NS * * NS * NS F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Nồng độ GA3 Kết Luận: Phương pháp cắt đốt in vitro thực đối tượng lan Vân hài, lan hài Hồng Để dễ dàng thực giảm chi phí cho q trình nhân giống, thực kéo dài chồi lan Vân hài lan hài Hồng điều kiện che tối sau 120 ngày nuôi cấy với số đốt trung bình (4,75 đốt/chồi) 3.4.3 Sự kéo dài chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo điều kiện che tối hồn tồn khả sống sót vị trí đốt thân ngồi vườn ươm 15 Bảng 3.13 Ảnh hưởng điều kiện tối lên kéo dài chồi in vitro lan Vân hài Thời gian che tối Chiều cao Số Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) chồi dài rộng thành ĐC (Đèn huỳnh quang) 2,05e 4,02b 4,93a 1,40a 0,00 d d b b 30 2,55 1,18 4,02 1,16 0,00 60 4,50c 2,47c 3,25c 1,10b 0,00 90 7,00b 3,71b 2,60d 0,87c 0,00 a a d c 120 8,58 5,06 2,40 0,75 0,00 3,38 7,21 5,97 8,00 CV% * * * * NS F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.14 Ảnh hưởng điều kiện tối lên kéo dài chồi in vitro lan hài Hồng Thời gian che tối Chiều Số Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) cao chồi dài rộng thành1 d c a a ĐC (Đèn huỳnh quang) 4,25 3,00 4,95 3,37 0,01c d e b b 30 4,37 1,00 3,80 1,65 0,01c 60 5,65c 2,42d 3,00c 1,45bc 0,01c 90 7,12b 3,75b 2,22d 1,15c 1,82b 120 10,50a 5,00a 2,00d 1,12c 3,36a 5,54 7,18 8,15 11,84 5,73 CV% * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.15 Ảnh hưởng điều kiện tối lên kéo dài chồi lan hài Tam Đảo Thời gian che tối Chiều cao Số Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) chồi dài rộng thành ĐC (Đèn huỳnh quang) 0,80d 3,05a 4,32a 1,36a 0,00 30 2,55c 1,00d 3,82b 0,95b 0,00 b c b c 60 2,75 1,77 3,77 0,70 0,00 90 2,90ab 2,62b 3,72b 0,55d 0,00 120 3,05a 3,07a 3,65b 0,43e 0,00 4,66 8,21 3,78 7,48 CV% * * * * NS F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Bảng 3.16 Ảnh hưởng vị trí đốt thân lên khả sống sót phát triển vườn ươm sau 12 tháng giống lan hài Hồng Vị trí Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Số chồi hình Chiều rộng Số đốt thân sống mẫu chết thành 100,00a 0,00d 1,00a 3,87a 3,07a 23,75d 76,25a 0,00d 0,00d 0,00d 33,75c 66,25b 0,75b 2,50c 1,42c c b b b 32,50 67,50 0,72 3,12 1,45c 56,25b 43,75c 0,53c 4,12a 2,12b 8,79 8,53 6,69 13,60 8,64 CV% * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test 16 Kết luận: Chồi đỉnh cho tỷ lệ sống sót 100%, từ chồi non ban đầu sau kéo dài lóng thân tạo (1 + 0,75 + 0,72 + 0,53 chồi/mẫu) hoàn chỉnh từ đốt thân giống lan hài Hồng 3.5 Phương pháp nhân giống thông qua callus 3.5.1 Khả cảm ứng tạo callus từ mẫu chồi non ex vitro kéo dài điều kiện tối ngắt quãng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Bảng 3.17 Ảnh hưởng cảm ứng tạo callus từ mẫu chồi non ex vitro kéo dài điều kiện tối ngắt quãng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Chất điều hòa sinh trưởng Lan Vân hài Lan hài Lan hài Tam Hồng Đảo 2,4-D TDZ (mg/L) Tỷ lệ tạo callus Tỷ lệ tạo Tỷ lệ tạo (mg/L) (%)1 callus (%) callus (%) 0,00f 0,00 0,00 0,0 (ĐC) 0,00f 0,00 0,00 0,3 f 0,00 0,00 0,00 0,6 6,03de 0,00 0,00 1,0 0,00f 0,00 0,00 0,0 0,5 0,00f 0,00 0,00 0,3 0,5 e 5,00 0,00 0,00 0,6 0,5 14,68c 0,00 0,00 1,0 0,5 0,00f 0,00 0,00 0,0 1,0 d 7,19 0,00 0,00 0,3 1,0 19,76b 0,00 0,00 0,6 1,0 31,03a 0,00 0,00 1,0 1,0 6,01 CV% * NS NS F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc 3.5.2 Ảnh hưởng TDZ 2,4-D đến trình nhân nhanh callus giống lan Vân hài Hình 3.22 Ảnh hưởng TDZ 2,4-D đến trình trình nhân nhanh callus sau 75 ngày nuôi cấy giống lan Vân hài 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên trình tái sinh chồi từ callus lan Vân hài 17 Bảng 3.18 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên trình tái sinh chồi từ callus giống lan Vân hài Chất điều hòa sinh trưởng Tỷ lệ callus tái sinh Số chồi trung chồi (%) bình/mẫu1 NAA BA TDZ 0,00f 0,00d 0,5 (ĐC) 0,0 0,0 11,25e 3,23c 0,5 0,5 0,0 43,75c 3,23c 0,5 1,0 0,0 51,25b 4,74b 0,5 2,0 0,0 0,5 0,0 0,3 60,00a 7,98a 43,75c 4,74b 0,5 0,0 0,6 30,00d 3,20c 0,5 0,0 1,0 10,55 7,13 CV% * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc Kết Luận: Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo từ lát cắt ngang lóng thân giống lan Vân hài cao (31,25%) thu mơi trường SH lỏng có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D, 1,0 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose với giá thể bơng gịn sau 75 ngày ni cấy Trên mơi trường có bổ sung 0,3 mg/L TDZ, 0,5 mg/L NAA cho tỷ lệ tái sinh cụm chồi từ callus thu cao 60% số chồi hình thành trung bình cụm cao 7,98 chồi/mẫu 3.6 Phương pháp nhân giống thông qua PLB 3.6.1 Ảnh hưởng 2,4-D đến trình cảm ứng PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Hình 3.24 Ảnh hưởng 2,4-D đến trình cảm ứng PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 3.6.2 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D với TDZ, BA, KIN đến trình nhân nhanh PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 18 Bảng 3.19 Ảnh hưởng kết hợp mg/L 2,4-D với TDZ, BA, KIN lên trình nhân nhanh PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Lan hài Lan hài Lan Vân hài Chất điều hòa sinh trưởng Hồng Tam Đảo (mg/L) Số PLB/mẫu PLB/mẫu PLB/mẫu1 2,4-D TDZ BA KIN 4,35f 3,65f 3,47f 1,0 (ĐC) 0,0 4,12fg 5,57de 4,21ef 1,0 0,5 3,75g 5,06e 3,23fg 1,0 1,0 3,12h 3,62f 2,47gh 1,0 2,0 2,25i 3,06f 1,94hi 1,0 3,0 1,70j 2,17g 1,46i 1,0 4,0 3,75g 3,06f 3,73f 1,0 0,5 5,31e 5,01e 5,24de 1,0 1,0 8,55b 8,06b 7,98b 1,0 2,0 d c 6,62 6,75 5,98cd 1,0 3,0 5,62e 5,68d 4,97de 1,0 4,0 6,20d 6,40c 6,24cd 1,0 0,5 c c 7,47 6,95 7,22bc 1,0 1,0 11,00a 9,62a 10,98a 1,0 2,0 8,25b 8,20b 7,98b 1,0 3,0 d de cd 6,37 5,37 6,22 1,0 4,0 6,22 7,29 7,10 CV% * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test (1): giá trị biến đổi dạng (x+0,5)0,25 để xử lý thống kê, giá trị bảng giá trị trung bình gốc 3.6.3 Ảnh hưởng nguồn gốc PLB khác đến khả hình thành chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Hình 3.25 Ảnh hưởng nguồn mẫu cảm ứng từ phức hợp chất điều hịa sinh trưởng đến khả hình thành chồi từ cụm PLB giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Kết Luận: Quá trình cảm ứng PLB tốt thu mơi trường SH có bổ sung mg/L 2,4-D sau 60 ngày ni cấy, q trình nhân nhanh PLB thu mơi trường SH có bổ sung mg/L 2,4-D kết hợp với mg/L KIN, trình tái sinh chồi thu tốt PLB nuôi cấy có nguồn gốc từ mơi trường SH có bổ sung mg/L 2,4-D kết hợp với mg/L KIN 19 3.7 Nhân giống phương pháp hủy đỉnh Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Hình 3.27 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan Vân hài sau 90 ngày ni cấy Hình 3.28 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan hài Hồng sau 90 ngày ni cấy Hình 3.29 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả tạo chồi bên giống lan hài Tam Đảo sau 90 ngày ni cấy Hình 3.30 Nhân giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo phương pháp hủy đỉnh sau 90 ngày nuôi cấy 20 a Lan Vân hài cấy mơi trường SH có bổ sung 0,4 mg/L TDZ; b Lan hài Hồng cấy môi trường SH có bổ sung 0,4 mg/L TDZ; c Lan hài Tam Đảo cấy mơi trường SH có bổ sung 0,6 mg/L TDZ Kết Luận: Phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (5,61; 5,48; 6,00 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose 3.8 Phương pháp gây vết thương Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương lên khả kích thích tạo chồi bên giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Bảng 3.20 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên lan Vân hài môi trường lỏng với giá thể bơng gịn Chất điều hịa sinh trưởng Số chồi/mẫu Hình thái chồi TDZ (mg/L) BA (mg/L) d 1,22 Chồi nhỏ, xanh nhạt (ĐC) 2,47c Chồi to, xanh nhạt 0,2 4,48a Chồi to, xanh nhạt 0,4 4,48a Chồi to, xanh nhạt 0,6 ab 4,24 Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 0,8 3,97ab Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 1,0 2,47c Chồi to, xanh nhạt 0,5 bc 3,23 Chồi to, xanh nhạt 1,0 3,71ab Chồi to, xanh nhạt 1,5 3,71ab Chồi to, xanh nhạt 2,0 3,48ab Chồi to, xanh nhạt 2,5 8,59 CV% * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.21 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên lan hài Hồng môi trường lỏng với giá thể gịn Chất điều hịa sinh trưởng Số chồi/mẫu Hình thái chồi TDZ (mg/L) BA (mg/L) e 1,75 Chồi nhỏ, xanh nhạt (ĐC) 3,00d Chồi to, xanh nhạt 0,2 ab 5,00 Chồi to, xanh nhạt 0,4 5,37a Chồi to, xanh nhạt 0,6 4,81ab Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 0,8 b 4,62 Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 1,0 3,25d Chồi to, xanh nhạt 0,5 3,87c Chồi to, xanh nhạt 1,0 4,37bc Chồi to, xanh nhạt 1,5 4,43bc Chồi to, xanh nhạt 2,0 4,50b Chồi to, xanh nhạt 2,5 9,48 CV% * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test 21 Bảng 3.22 Ảnh hưởng TDZ BA kết hợp với phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên lan hài Tam Đảo môi trường lỏng với giá thể gịn Chất điều hịa sinh trưởng Số chồi/mẫu Hình thái chồi TDZ (mg/L) BA (mg/L) f 1,86 Chồi nhỏ, xanh đậm (ĐC) 2,50e Chồi to, xanh đậm 0,2 a 5,31 Chồi to, xanh đậm 0,4 5,25ab Chồi to, xanh nhạt 0,6 4,62bc Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 0,8 c 4,37 Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 1,0 3,63d Chồi to, xanh đậm 0,5 4,12cd Chồi to, xanh đậm 1,0 abc 4,68 Chồi to, xanh đậm 1,5 4,43c Chồi to, xanh đậm 2,0 4,37c Chồi to, xanh đậm 2,5 10,07 CV% * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Kết Luận: Sử dụng phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (4,48; 5,37; 5,31 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose 3.10 Trồng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo điều kiện vườn ươm 3.10.1 Ảnh hưởng giá thể lên trình sinh trưởng giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo vườn ươm Bảng 3.27 Ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót, sinh trưởng phát triển lan Vân hài vườn ươm sau 24 tháng Tỷ lệ Chiều Khối Số Chiều Chiều Giá trị sống rộng Số rễ lượng Giá thể dài dài rễ SPAD sót tươi (cm) (cm) (%) (cm) (g) Xơ dừa 100 4,75 2,40d 7,00d 4,12b 7,25e 10,75d 40,85b (ĐC) cd c b d d Tro trấu 100 4,75 2,50 8,62 4,25 8,75 12,00 41,45b c bc ab c c Dớn xay 100 4,87 2,60 9,25 4,50 10,50 14,00 41,35b Dớn mút 100 5,00 2,80b 10,12b 5,00a 12,25b 16,00b 41,70b Dớn Đài 100 5,00 3,05a 12,00a 5,00a 15,00a 19,50a 44,67a Loan 3,97 3,48 7,58 8,81 7,30 6,62 1,59 CV% NS NS * * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; **:: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test 22 Bảng 3.28 Ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót, sinh trưởng phát triển lan hài Hồng vườn ươm sau 24 tháng Tỷ lệ Chiều Khối Giá trị Số Chiều Chiều Giá thể sống rộng Số rễ lượng SPAD dài dài rễ sót tươi Xơ dừa 100 5,00b 2,25e 6,00b 4,00c 6,00c 8,75c 38,82c (ĐC) Tro trấu 100 5,00b 2,40d 7,25b 4,25c 7,00c 10,25c 40,37b Dớn xay 100 5,12b 2,50c 7,62b 4,37bc 8,50b 12,75b 39,50bc Dớn mút 100 6,00a 2,60b 8,00ab 5,00ab 8,87b 13,12ab 40,32b Dớn Đài 100 6,00a 2,82a 9,00a 5,25a 10,25a 14,75a 41,47a Loan 9,29 3,20 9,29 10,07 9,76 9,19 1,60 CV% NS * * * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test Bảng 3.29 Ảnh hưởng giá thể lên khả sống sót, sinh trưởng phát triển lan hài Tam Đảo vườn ươm sau 24 tháng Tỷ lệ Số Chiều Khối Giá trị Chiều Chiều Giá thể sống rộng Số rễ lượng SPAD dài dài rễ sót tươi Xơ dừa 100 4,56 2,00c 7,50d 4,75b 6,75c 9,00d 38,67d (ĐC) Tro trấu 100 4,68 2,12c 8,62c 4,75b 7,00bc 11,00c 40,50bc Dớn xay 100 4,87 2,27b 8,75c 5,00b 8,0abc 12.37b 39,25cd a b b ab ab Dớn mút 100 4,93 2,42 10,75 5,50 8,25 13,25 40,92ab Dớn Đài 100 5,00 2,55a 12,50a 6,75a 9,00a 14,00a 42,00a Loan 6,73 3,80 6,67 11,05 10,20 6,65 1,81 CV% NS NS * * * * * * F-test Chú thích: NS: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Duncan’s test 3.11.4 Quy trình tái sinh nhân giống tối ưu giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo 1,0 - 2,0 cm Quy trình 4: a1 Cây trưởng thành ngồi vườn ươm; a2 Chồi non ex vitro có chiều cao 1,0 - 2,0 cm vườn ươm; b c Kéo dài chồi điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh sau tháng; d Chồi cắt thành đốt khử trùng mẫu cấy; e1 e2 Tái sinh chồi từ đốt thân môi trường đặc môi trường lỏng với giá thể bơng gịn; f Chồi sinh trưởng in vitro; g Hủy đỉnh cách dùng panh cấy giữ chặt phần gốc, dùng panh thứ kẹp vào non 23 kéo chúng khỏi đỉnh chồi; h Kích thích tạo cụm chồi in vitro mơi trường lỏng với giá thể bơng gịn; i Tạo in vitro hoàn chỉnh từ cụm chồi; j Trồng lên vỉ xốp với dớn Đài Loan điều kiện vườn ươm Hệ số nhân giống: Số chồi trung bình thu giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo sau tháng: 5,61 + 5,48 + 6,00 = 17,09 : = 5,69 chồi Tách chồi cấy lên môi trường tạo chồi khỏe mạnh thêm tháng tiếp Hủy đỉnh tạo chồi khỏe mạnh tháng tiếp theo: 5,69 x 5,69 = 32,37 chồi Hủy đỉnh tạo chồi khỏe mạnh tháng tiếp theo: 32,37 x 5,69 = 184,22 chồi Như vậy, hệ số nhân giống theo phương pháp hủy đỉnh sau 12 tháng từ chồi ban đầu tạo 184,22 chồi KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non ex vitro Tỷ lệ tái sinh chồi giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo thu cao (22,4%; 24,85%; 17,15%) mơi trường SH có bổ sung 1,0 mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, g/L agar, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 Phương pháp tái sinh tối ưu (tạo mẫu ban đầu từ đốt thân ex vitro) Tỷ lệ mẫu cấy tái sinh (48,45%; 44,90%; 25,3%) giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh thu môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn, có bổ sung mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 Nhân giống phương pháp cắt đốt Phương pháp cắt đốt in vitro thực đối tượng lan Vân hài, lan hài Hồng Để dễ dàng thực giảm chi phí cho trình nhân giống, thực kéo dài chồi lan Vân hài lan hài Hồng điều kiện che tối sau 120 ngày nuôi cấy với số đốt trung bình (4,75 đốt/chồi) Cảm ứng tạo callus từ lát cắt ngang lóng thân nhân giống thơng qua callus Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo từ lát cắt ngang lóng thân giống lan Vân hài cao (31,25%) thu mơi trường SH lỏng có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D, 1,0 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose với giá thể bơng gịn sau 75 ngày ni cấy Trên mơi trường có bổ sung 0,3 mg/L TDZ, 0,5 mg/L NAA cho tỷ lệ tái sinh cụm chồi từ callus thu cao 60% số chồi hình thành trung bình cụm cao 7,98 chồi/mẫu Nhân giống thông qua phương pháp gây vết thương Sử dụng phương pháp gây vết thương kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (4,48; 5,37; 5,31 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose 24 Phương pháp nhân giống tối ưu (phương pháp hủy đỉnh) Phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (5,61; 5,48; 6,00 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose Trồng vườn ươm Cây in vitro giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tạo phương pháp gieo hạt, phương pháp cắt đốt, phương pháp hủy đỉnh, phương pháp gây vết thương, phương pháp cảm ứng tạo callus PLB sinh trưởng tốt thu giá thể dớn Đài Loan với tỷ lệ sống sót 100% sau 24 tháng Đã hồn thiện quy trình tái sinh nhân giống tối ứu giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Phương pháp tái sinh tối ưu phương pháp tạo mẫu ban đầu từ đốt thân thu với tỷ lệ mẫu cấy tái sinh (48,45%; 44,90%; 25,3%) giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn, có bổ sung mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, pH = 5,8 Phương pháp nhân giống tối ưu thu từ phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (5,61; 5,48; 6,00 chồi/mẫu) môi trường SH lỏng với giá thể bơng gịn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose Đề nghị Phương pháp gieo hạt, nhân giống thơng qua PLB có nguồn gốc từ hạt áp áp dụng cho công tác bảo tồn lai tạo giống Đề nghị triển khai quy trình tái sinh nhân giống tối ưu giống lan Vân hài lan hài Hồng lan hài Tam Đảo nêu Tiếp tục nghiên cứu trình hình thành callus từ lát cắt ngang lóng thân từ phận khác in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo ex vitro Tiếp tục nghiên cứu trình hình thành callus PLB từ phận khác in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng lan hài Tam Đảo Tiếp tục nghiên cứu chế tác động lên q trình kéo dài lóng thân đối tượng lan hài Cơng trình hồn thành tại: Phịng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Dương Tấn Nhựt TS Đỗ Khắc Thịnh Phản biện 1: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Du Sanh Phản biện 3: TS Nguyễn Hữu Hổ Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền nam ngày 17 tháng 01 năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư Viện Quốc gia Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư Viện (ghi tên thư Viện nộp luận án) CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Hoàng Xuân Chiến, Trịnh Thị Hương, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Bá Nam, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt 2012 Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Vân hài (Paphiopedilum callosum) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 10(3): 487-494 Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt 2013 Nhân nhanh giông lan hài Tam Đảo (Paphiopedilum graxtrixianum) thông qua phát sinh protocorm-like body Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 11(3): 521-528 Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Vũ Thị Hiền, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt 2013 Nhân giống lan Vân hài (Paphiopedilum callosum) phương pháp kéo dài đốt thân Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 11(4): 717-726 Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt 2013.Tái sinh lan Vân hài (Paphiopedilum callosum) thông qua mô sẹo từ lát cắt ngang lóng thân ex vitro Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc, 902906 Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt 2014 Ảnh hưởng chất bổ sung hữu lên trính sinh trưởng phát triển chồi lan Vân hài (Paphiopedilum callosum) nuôi cấy in vitro Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52(1): 51-64 Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt 2014 Nhân giống vơ tình lan hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) phương pháp hủy đỉnh Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52(2D): 277-285 Vu Quoc Luan, Nguyen Phuc Huy, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Vu Thi Hien, Nguyen Thi Thanh Hien, Nguyen Thanh Hai, Do Khac Thinh, Duong Tan Nhut 2015 Ex vitro and in vitro Paphiopedilum delenatii Guillaumin stem elongation under light-emitting diodes and shoot regeneration via stem node culture Acta Physiologiae Plantarum, 37:136