Sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm hóa sinh của các chủng nấm nội sinh trên cây trầm đó aquilaria crassna

Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi xin chân thành cảm ơn tiến sĩ Trần Thị Như Hằng, thạc sĩ Hoàng Kim Chi hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Cảm ơn tồn thể cán phịng Sinh học thực nghiệm-Viện hóa học hợp chất thiên nhiên tạo điều kiện giúp đỡ Formatted: Vietnamese (Vietnam) thời gian thực tập phòng Xin cảm ơn dạy bảo, giúp đỡ thầy, cô khoa Công nghệ sinh học Viện đại học Mở Hà Nội trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè bên động viên hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2015 Formatted: Vietnamese (Vietnam) Sinh viên Chu Thanh Hà Chu Thanh Hà K18 - 1104 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ MỞ ĐẦU PHẦN I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm nội sinh 1.1.1 Sơ lược nấm nội sinh 1.1.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh 1.1.3 Các nghiên cứu nấm nội sinh Việt Nam 1.2 Cây Trầm dó Aquilaria crassna nấm nội sinh Trầm dó 1.2.1 Sơ lược Trầm dó 1.2.2 Nghiên cứu thể nội sinh thực vật Trầm dó 14 PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Mẫu phân lập 17 2.1.2 Bộ chủng vi sinh vật kiểm định 17 2.1.3 Các dòng tế bào ung thư người 17 2.1.4 Dụng cụ, hóa chất thiết bị nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp 18 2.2.1 Chuẩn bị môi trường 18 2.2.2 Phương pháp 19 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Phân lập xác định số chủng nấm nội sinh Trầm dó 25 3.1.1 Phân lập chủng nấm nội sinh 25 3.1.2 Xác định chủng nấm phân lập 26 3.2 Kết sàng lọc chủng nấm lựa chọn theo định hướng hoạt tính sinh học 29 Chu Thanh Hà K18 - 1104 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 3.2.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật 29 3.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào 29 3.2.3 Hoạt tính chống oxy hoá 30 3.2.4 Khả sinh tổng hợp enzym ngoại bào: xellulaza amilaza 30 3.3 Các điều kiện lên men thích hợp chủng nấm lựa chọn theo hướng hoạt tính sinh học 31 3.3.1 Lên men chủng nấm môi trường với thành phần vi lượng khác 31 3.3.2 Lên men chủng môi trường tốt với pH khác 32 3.3.3 Lên men chủng môi trường với thành phần vi lượng pH tốt khoảng thời gian khác 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC Formatted: Font: Cambria, 16 pt, Font color: Auto, Kern at 16 pt Chu Thanh Hà K18 - 1104 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC Cacboxyl metyl cellulose CS% Cell survival % (% tế bào sống sót) CTNS Cơ thể nội sinh thực vật DMEM Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium (Mơi trường khống Dullbecco cải tiến) DMSO Dimethyl sulfoxid (Dimetyl sulfoxit) DPPH 1,1 – diphenyl - – picrylhydrazyl EC 50 Efective concentration 50% (nồng độ cần thiết để tác động 50%) EtOAc Ethylacetat ( etyl axetat) EtOH Ethanol (Etanol) IC50 Inhibitory concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) MEME Minineal essential medium with Eagle’s salts (Mơi trường khống có muối Eagle) MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) NNS Nấm nội sinh OD Optical Density (Mật độ quang) SC% Scavenging capacity (% khả bẫy gốc tự do) SC50 Scavenging capacity 50% (khả bẫy 50% gốc tự do) SRB Sunforhodamine B ( Sunforodamin B) TCA Trichloacetat acid (Axit tricloaxetic) VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định VSVNS Vi sinh vật nội sinh v.v vân vân & cs (và cs.) Và cộng sv v.v Vân vân Chu Thanh Hà K18 - 1104 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Bảng 1: Các phương pháp tạo trầm Trầm dó 13 Bảng 2: Một số chủng nấm nội sinh phân lập từ trầm hương (Waynie 2013) 15 Bảng 3: Đặc điểm chủng nấm phân lập từ mẫu Trầm dó 25 Bảng 4: Hình thái chủng nuôi loại môi trường khác 26 Bảng 5: Kết so sánh độ tương đồng với trình tự Ngân hàng gen 28 Bảng 6: Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 29 Bảng 7: Kết thử hoạt tính chống oxy hoá 30 Bảng 8: Hoạt tính sinh enzym ngoại bào dịch lên men 30 Hình 1: Một số hình ảnh Trầm dó A crassna Hình : Thân Trầm dó trầm tạo thân (màu sẫm) Hình 3: Quy trình thu nhận cặn chiết EtOAc từ dịch lên men chủng NNS 17 Biểu đồ 1: Ảnh hưởng môi trường lên men tới hoạt tính sinh khối chủng SHTr-Hc8 32 Biểu đồ 2: Ảnh hưởng giá trị pH tới hoạt tính sinh khối chủng SHTr-Hc8 33 Biểu đồ 3: Ảnh hưởng thời gian lên men tới hoạt tính sinh khối chủng SHTr-Hc8 34 Chu Thanh Hà K18 - 1104 Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt, Not Bold, Font color: Auto MỞ ĐẦU Formatted: Font: Times New Roman, (none) Vi sinh vật nội sinh thực vật (VSVNS) thể vi sinh vật sống bên Formatted: Heading 1, Line spacing: single Formatted: Font: (Default) Times New Roman mô thực vật khỏe mạnh mà không gây triệu chứng bệnh thấy cho chủ Nghiên cứu VSVNS đem đến lợi ích thực tiễn, chúng nguồn cung cấp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học như: chất kháng vi sinh vật, kháng côn trùng hại cây, chống ung thư, chống ơxy hóa, enzym v.v Việc chủ động khai thác chất có hoạt tính từ VSVNS giảm bớt lệ thuộc vào chủ, từ giúp sức cho cơng bảo tồn đa dạng sinh học hệ sinh thái Trong số loài thực vật thuộc chi Trầm Aquilaria Trầm dó (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) đánh giá loài phổ biến tương đối đặc hữu Việt Nam Tuy nhiên, khả tạo trầm thương phẩm có giá trị kinh tế cao mà loài thực vật bị khai thác mức có nguy suy giảm số lượng mạnh Giá trị Trầm dó khơng tinh dầu thơm đặc trưng trầm, mà tác dụng dược học chúng lưu truyền qua ngàn đời Trong Đông y, trầm biết đến vị thuốc có tính ấm, có tác dụng trợ tim, lợi tiêu hóa, chống nơn, v.v Tác dụng chữa bệnh gỗ, lá, rễ Trầm khoa học đại phát chứng minh Formatted: Vietnamese (Vietnam) Xuất phát từ tình hình thực tiễn xu hướng nghiên cứu kể trên, giới ngày có nhiều cơng trình khoa học tìm hiểu hệ sinh thái VSVNS lồi thuộc chi Aquilaria Tuy nhiên, chưa có cơng trình số nghiên cứu VSVNS Trầm dó A crassna Chính vậy, triển khai thực luận văn với đề tài: “Sàng lọc nghiên cứu số đặc điểm hóa sinh chủng nấm nội sinh Trầm dó Aquilaria crassna.” Trong khn khổ luận văn hướng tớihướng tới mục tiêu sau đây: Formatted: Vietnamese (Vietnam) • Phân lập xác định số chủng nấm nội sinh Trầm dó; Formatted: Vietnamese (Vietnam) • Sàng lọc chủng nấm theo định hướng hoạt tính sinh học; Formatted: Vietnamese (Vietnam) • Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng theo định hướng hoạt tính sinh học Chu Thanh Hà K18 - 1104 PHẦN I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nVi sinhấm vật nội sinh Formatted: Vietnamese (Vietnam) Theo định nghĩa thừa nhận rộng rãi Bacon White (2000) Formatted: Vietnamese (Vietnam) “các thể nội sinh (endophytes) vi sinh vật (thường vi khuẩn nấm) sinh trưởng mô sống bên thực vật, mà không gây hiệu ứng xấu rõ ràng trực tiếp cho cây” Chúng thiết lập mối quan hệ hai bên có lợi, VSVNS thúc đẩy trình sinh trưởng chủ tạo hàng rào kiểm soát sinh học việc tiêu diệt trực tiếp mầm bệnh xâm nhiễm vào chủ 1.1.1 Sơ lược nBacon, C W., & White, J (Eds.) (2000) Microbial endophytes • Formatted: (none) CRC Press Formatted: Heading 3, Line spacing: single Nấm nội sinh1.1.1 Sơ lược nấm nội sinh Formatted: Heading 3, Line spacing: single, No bullets or numbering Các NNS tìm thấy hầu hết thực vật, từ lớn, thân thảo (thân cỏ), Formatted: Vietnamese (Vietnam) đến cỏ tảo [(Huang & cs., 2001)] Theo Dreyfuss & Chapela (1994), Formatted: Vietnamese (Vietnam) Huang, Y., Wang, J., Li, G., Zheng, Z., & Su, W (2001) Antitumor and Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: English (United States) antifungal activities in endophytic fungi isolated from pharmaceutical plants Taxus mairei, Cephalataxus fortunei and Torreya grandis FEMS Immunology & Medical Formatted: Font: 13 pt Microbiology, 31(2), 163-167 Formatted: Font: 13 pt Ước tính 1,5 x 106 lồi nấm giới (Hawksworth 2001) có khoảng 1,3 x106 lồi sống nội sinh thực vật (Dreyfuss & Chapela 1994) Formatted: Vietnamese (Vietnam) L HAWKSWORTH, D (2001) The magnitude of fungal diversity: the 1· million species estimate revisited Mycological research, 105(12), 1422-1432 Formatted: Font: 13 pt Dreyfuss, M M., & Chapela, I H (1994) Potential of fungi in the discovery of novel, low-molecular weight pharmaceuticals Biotechnology (Reading, Mass.),26, 49 Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt Nấm nội sinh giúp chủ tăng trưởng nhanh hơn, tăng cường độc tính để chống lại lồi động vật ăn cỏ, côn trùng, tuyến trùng gây hại mầm bệnh, tăng khả chịu hạn (Hill cs 1991, Read & Camp 1986, Clay 1988, West & cs 1993) Mặt khác chúng lại nhận nhiều dinh dưỡng hơn, chủ bảo vệ chống lại khơ hạn, trùng nấm kí sinh cạnh tranh từ VSV Chu Thanh Hà K18 - 1104 Formatted: Vietnamese (Vietnam) khác (Bacon & White & cs 2000) Trong q trình tiến hóa, VSVNS cải thiện Formatted: Vietnamese (Vietnam) sức đề kháng chủ với điều kiện bất lợi cách tiết hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Ge & cs 2008) West, C P., Izekor, E., Turner, K E., & Elmi, A A (1993) Endophyte effects on growth and persistence of tall fescue along a water-supply gradient.Agronomy Journal, 85(2), 264-270 Formatted: Font: 13 pt Bacon, C W., & White, J (Eds.) (2000) Microbial endophytes CRC Press Formatted: Font: 13 pt Ge, H M., Shen, Y., Zhu, C H., Tan, S H., Ding, H., Song, Y C., & Tan, R X (2008) Penicidones A–C, three cytotoxic alkaloidal metabolites of an endophytic Penicillium sp Phytochemistry, 69(2), 571-576 Formatted: Font: 13 pt Mặc dù loài NNS Freeman phát từ năm 1902, Formatted: Font: 13 pt suốt thời gian dài chúng không ý tới Chỉ người ta nhận vai trò sinh thái tiềm chúng nguồn hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học đối tượng nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Gunatilaka & cs 2006) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Gunatilaka, A L (2006) Natural Products from Plant-Associated Microorganisms: Distribution, Structural Diversity, Bioactivity, and Implications of Their Occurrence⊥ Journal of Natural Products, 69(3), 509-526 Formatted: Font: 13 pt 1.1.12 Các chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh Formatted: Font: 13 pt Formatted: Vietnamese (Vietnam) Trong số nhiều chất hữu tham gia trao đổi chất thể sống, thực vật, có chất có hoạt tính như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut, chống viêm, kháng tế bào ung thư v.v Những chất có ích cho người nói chung có hoạt tính dược học gọi chất có hoạt tính sinh học, hoạt chất Thơng qua đồng tiến hố với chủ truyền gen từ chủ chúng Formatted: Vietnamese (Vietnam), Not Highlight ([Strobel & cs., 20031996)], NNS có khả tổng hợp hóc mơn thực vật Formatted: Vietnamese (Vietnam) có khả tổng hợp chất quan trọng khác người, Formatted: Vietnamese (Vietnam), Not Highlight Formatted: Vietnamese (Vietnam), Not Highlight Formatted: Highlight Chu Thanh Hà K18 - 1104 chất kháng sinh, chất kháng nấm v.v Sau số ví dụ hợp chất có Formatted: Vietnamese (Vietnam) hoạt tính sinh học sinh NNS Formatted: Vietnamese (Vietnam) 1.1.2 1.1.2.1 Các chất kháng vi sinh vật Formatted: Font: Italic, Swedish (Sweden) Formatted: Heading Từ năm 2000, hoạt tính kháng vi sinh vật NNS đề cập Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Italic, Swedish (Sweden) số nghiên cứu Sau số ví dụ cụ thể: - Từ NNS Ampelomyces sp thuốc Urospermum picroides, Aly & cs (2008) phân lập 14 hợp chất, số có hợp chất có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương gây bệnh Staphylococcus aureus, S epidermis, Enterococcus feacalis với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 12,5 12,5-25 µg/mL (Aly & cs 2008) - Từ NNS Penicillium sp Hopea hainanensis (Dipterocarpaceae) –Wang & cs (2008), tách chất monometylsulocrin (1), axit rhizoctonic (2), asperfumoit (3), physcion (4), 7,8-iso-aloxazin (5), axit 3,5-dicloro-p-anisic (6) Tất chất nghiên cứu in vitro tác dụng chống nấm gây bệnh cho người (Candida albicans, Trichophyton rubrum, Aspergillus niger) - Trong số 31 chủng NNS dạng nấm sợi phân lập từ thuốc khu Dự trữ sinh Formatted: Indent: First line: 0.25", Space After: pt Similipal, Ấn Độ, có 13 chủng (41,9%) thể hoạt tính kháng vi sinh vật, ức chế VSV gây bệnh kiểm định; số chủng kháng mạnh, có 19,3% thể hai hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm, 6,4% kháng tất VSV gây bệnh kiểm định ([Mohanta & cs., 2008)] Tác giả nghiên cứu tái khẳng định quan điểm cho NNS thuốc dân tộc nguồn đầy triển vọng chất kháng VSV WHERE THE HELL EXAMPLES OF ENDOPHYTIC FUNGI WITH ANTIMICROBIAL ABILITY? Formatted: Highlight Formatted: Highlight Formatted: Highlight Formatted: English (United States) Chu Thanh Hà K18 - 1104 1.1.32.2 Các chất gây độc tế bào ung thư Formatted: Font: Italic, Swedish (Sweden) Hàng loạt chất gây độc tế bào ung thư NNS tổng hợp điều kiện lên men phát Dưới điểm qua số chất nấm nội sinh Formatted: Heading Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Italic, Swedish (Sweden) tổng hợp nên chúng • Taxol Một ví dụ điển hình chất gây độc tế bào ung thư nấm nội sinh tổng hợp, mà trước cho thuộc chi thông đỏ (Taxus) sinh (Strobel & Formatted: Vietnamese (Vietnam) cs., 1996) Những NNS tổng hợp taxol biết đến có nguồn gốc từ lồi thơng đỏ, chúng “bắt chước” chủ mặt hóa sinh học để tổng hợp nên taxol Một số Taxomyces andreanae, sau nhiều NNS khác khơng có quan hệ họ hàng với biết có khả Đó chi: Pestalotia, Pestalotiopsis, Fusarium, Alternaria, Pithomyces, Monochaetia, v.v (Strobel & cs., 1996) Với quan sát có mặt taxol chi nấm khác xa vậy, tác giả nhằm đưa chứng cần thiết phải nghiên cứu NNS bảo tồn chủ chúng Yuan, J I., Jian-Nan, B I., Bing, Y A N., & Xu-Dong, Z (2006) Taxol-producing fungi: a new approach to industrial production of taxol Chinese Journal of Formatted: Font: 13 pt Biotechnology, 22(1), 1-6 Comment [K1]: TLTK đoạn nào? Về mặt di truyền tiến hóa, tổng hợp taxol VSV phân lập từ Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt thông đỏ Taxus spp đáng ý: có lẽ xảy truyền gen theo Formatted: Vietnamese (Vietnam) chiều ngang (horizontal gene transfer) từ Taxus spp sang NNS chúng • Các xanton Comment [K2]: Đã có số tài liệu Đề nghị update Formatted: Font: 13 pt Trên thuốc có tên Croton oblongifolius Thái Lan, (Pornpakakul cs (2006) phân lập NNS Emericella variecolor có khả tổng hợp bốn xanton có hoạt tính kháng tế bào ung thư Bốn xanton là: samixanton (1), 14metoxytajixanton-25-axetat (2), tajixanton metanoat (3), tajixanton hydrat (4) Tất chất có hoạt tính kháng vừa phải chọn lọc khối u dày, khối u ruột kết, khối u vú Riêng chất số biểu thị hoạt tính gây độc trung bình tất Chu Thanh Hà Formatted: Vietnamese (Vietnam) K18 - 1104 Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Font: Not Italic Formatted: Vietnamese (Vietnam) 18 Kiet, Le Cong, Paul, Ja Kessler, and Marcel Eurlings "A new species of Aquilaria (Thymelaeaceae) from Vietnam." Blumea-Biodiversity, Evolution and Biogeography of Plants 50.1 (2005): 135-141 19 L Hawksworth Awksworth, D (2001) The magnitude of fungal diversity: the 1·5 million species estimate revisited Mycological research, 105(12), 1422-1432 8.20 Likhitayawuid K., Angerhofer C.K (1993) Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Sephania evecta, Jounal of Natural Products 56 (1) pp 30-38 9.21 Mohamed R., Jong P L., & Zali M S (2010) Fungal diversity in wounded stems of Aquilaria malaccensis Fungal Diversity 43(1): 67-74 Doi: 10.1007/s13225-010-0039-z 10.22.Mohanta J., Tayung K., and Mphapatral U.B (2008), “Antimicrobial potentials of endophytic fungi inhabiting three Ethno-medicinal plants of Similipal Biosphere Reserve, India”, The Internet Journal of Microbiology 5(2) Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Normal, Indent: Left: 0.05", Numbered + Level: + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: + Alignment: Left + Aligned at: 0" + Indent at: 0.25" Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, French (France), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, English (United States), Pattern: Clear 11.23.Nimnoi, P., Pongsilp, N., & Lumyong, S (2010) Genetic diversity and community of endophytic actinomycetes within the roots of Aquilaria crassna Pierre ex Lec assessed by Actinomycetes-specific PCR and PCR-DGGE of 16S rRNA gene Biochemical Systematics and Ecology 38(4): 595-601 24 Pornpakakul, S., Liangsakul, J., Ngamrojanavanich, N., Roengsumran, S., Sihanonth, P., Piapukiew, J., & Petsom, A (2006) Cytotoxic activity of four xanthones fromEmericella variecolor, an endophytic fungus isolated from Croton oblongifolius Archives of pharmacal research, 29(2), 140-144 12.25.Sheila A., Wiseman, Douglas A Balentine, and Balz Frei "Antioxidants in tea."Critical Reviews in Food Science & Nutrition 37.8 (1997): 705-718 13.26.Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D., Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R., (1991), “New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer agents”, Eur.J.Cance 27, pp 1162-1168 40 Chu Thanh Hà K18 - 1104 Formatted: Font color: Auto, English (United States), Pattern: Clear Formatted: Normal, Indent: Left: 0.05", Numbered + Level: + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: + Alignment: Left + Aligned at: 0" + Indent at: 0.25" Formatted: Font color: Auto, English (United States), Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto, English (United States) 27 Strobel, G A., E Ford, J Worapong, J K Harper, A M Arif, D M Grant, P C W Fung, and K Chan 2002 Ispoestacin, an isobenzofuranone from Pestalotiopsis microspora, possessing antifungal and antioxidant activities Phytochemistry 60:179-183 28 Strobel, Gary, and Bryn Daisy (2003) Bioprospecting for microbial endophytes Formatted: Font: 13 pt, Not Bold, Font color: Auto, Pattern: Clear Formatted: Normal, Indent: Left: 0.05", Numbered + Level: + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: + Alignment: Left + Aligned at: 0" + Indent at: 0.25" Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto, Pattern: Clear and their natural products Microbiology and Molecular Biology Reviews 67.4: 491-502 Formatted: Font color: Auto, English (United States) 29 Strobel, Gary, et al "Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallachiana." Microbiology 142.2 (1996): 435-440 Formatted: Font color: Auto, Pattern: Clear 14.30.Wang, F W., Hou, Z M., Wang, C R., Li, P., & Shi, D H (2008) Bioactive metabolites from Penicillium sp., an endophytic fungus residing in Hopea hainanensis World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(10), 21432147 31 West, C P., Izekor, E., Turner, K E., & Elmi, A A (1993) Endophyte effects on growth and persistence of tall fescue along a water-supply gradient.Agronomy Journal, 85(2), 264-270 Formatted: Font color: Auto, English (United States), Pattern: Clear Formatted: Indent: Left: 0.05", Numbered + Level: + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: + Alignment: Left + Aligned at: 0" + Indent at: 0.25" 32 Wu, Chunwu, Caesar E Ordonez, and Chin-Tu Chen "FIPI: Fast 3-D PET reconstruction by Fourier inversion of rebinned plane integrals." ThreeDimensional Image Reconstruction in Radiology and Nuclear Medicine Springer Netherlands, 1996 277-296 15.33.Zich, F.A and Compton J., 2001, The Final Frontier: Towards Sustainable Management of Papua New Guinea's Agarwood Resource TRAFFIC Oceania,WWF South Pacific Programme Trang báo mạng http://thsngocphuong.blogspot.com/2012/05/tram-huong.html http://www.tramhuong.info Field Code Changed 41 Chu Thanh Hà K18 - 1104 http://www.tramhuonghanoi.com.vn www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST http://www.zmt-bremen.de http://vietbao.vn/Suc-khoe/Tram-ky-nam-co-cong-dung-gi/45207693/248/ 42 Chu Thanh Hà K18 - 1104 PHỤ LỤC Hình ảnh chủng SHTr-Hc8 nuôi cấy điều kiện pH khác Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh enzym ngoại bào dịch lên men A: Enzym xenlulaza Chu Thanh Hà B: Enzym amilaza K18 - 1104 Formatted: Font: 13 pt, English (United States) Chu Thanh Hà K18 - 1104 Page 8: [1] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM KIMCHI 5/14/2015 3:39:00 PM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM English (United States) Page 8: [2] Formatted List Paragraph Page 8: [3] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [4] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [5] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [6] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [7] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [8] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [9] Formatted Vietnamese (Vietnam), Highlight Page 8: [10] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [11] Formatted Highlight Page 8: [12] Formatted Font: 13 pt Page 8: [13] Formatted Font: 13 pt Vietnamese (Vietnam) Page 8: [15] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM KIMCHI 5/14/2015 3:46:00 PM Vietnamese (Vietnam) Page 8: [16] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [17] Formatted Font: Italic, Vietnamese (Vietnam) Page 8: [18] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [19] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [20] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [21] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [22] Formatted English (United States) Page 8: [23] Formatted Indent: First line: 0.4", Tab stops: 3.61", Left Page 8: [24] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Vietnamese (Vietnam) Page 8: [25] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [26] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [28] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Vietnamese (Vietnam) Page 8: [29] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [30] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [31] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [32] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [33] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [34] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [35] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [36] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [37] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [38] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [39] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [40] Formatted Page 8: [41] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/16/2015 1:13:00 PM Vietnamese (Vietnam) Page 8: [42] Formatted Heading 4, Indent: First line: 0", Line spacing: single Page 8: [43] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Font: Italic, Font color: Auto, Swedish (Sweden), Pattern: Clear Page 8: [44] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Vietnamese (Vietnam) Page 8: [45] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 8: [46] Formatted Vietnamese (Vietnam), Highlight Page 8: [47] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [48] Formatted Font color: Auto Page 10: [48] Formatted Font color: Auto Page 10: [48] Formatted Font color: Auto Page 10: [49] Formatted Font color: Auto Page 10: [49] Formatted Font color: Auto Page 10: [49] Formatted Font color: Auto Font color: Auto Page 10: [49] Formatted Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Font color: Auto Page 10: [50] Formatted Default Paragraph Font, Font: 13 pt, English (United States) Page 10: [50] Formatted Killer 5/16/2015 11:28:00 AM Default Paragraph Font, Font: 13 pt, English (United States) Page 10: [51] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Vietnamese (Vietnam) Page 10: [51] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [51] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [51] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [52] Formatted Page 10: [52] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Vietnamese (Vietnam) Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/16/2015 1:42:00 PM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [53] Formatted Font: 14 pt Page 10: [54] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [54] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [54] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 10: [54] Formatted Vietnamese (Vietnam) Page 11: [55] Formatted Font: Italic Page 11: [55] Formatted Font: Italic Page 11: [55] Formatted Font: Italic Page 11: [55] Formatted Font: Italic Page 11: [55] Formatted Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/15/2015 1:04:00 AM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Font: Italic Page 11: [55] Formatted Font: Italic Page 11: [55] Formatted Font: Italic Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Page 11: [56] Formatted Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Killer 5/17/2015 12:42:00 PM Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt Page 11: [56] Formatted Font: 13 pt