Phân lập một số chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi schizochytrium tiềm năng để sản xuất axit docosahexaenoic dha và squalene

Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Đặng Diễm Hồng, Trưởng phịng cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp tơi thực tập phịng thí nghiệm phịng Tơi vơ biết ơn TS Hoàng Thị Lan Anh, dạy bảo giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Trong suốt thời gian thực đề tài chị dẫn cho cách làm, cung cấp cho nhiều kiến thức đề tài, bảo cho tơi lỗi sai, giúp tơi hồn thành tốt luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị phịng cơng nghệ Tảo giúp đỡ tơi nhiệt tình chia sẻ khó khăn với tơi suốt q trình tơi thực tập phịng Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội giúp đỡ dạy cho nhiều kiến thức thời gian học tập trường Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ bờ bến đến bố mẹ, anh chị em bạn bè bên cạnh ủng hộ động viên suốt trình tơi học tập nghiên cứu, để tơi có thêm động lực hoàn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Mạc Thị Thùy Trang Mạc Thị Thùy Trang i K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Tình hình nghiên cức vi tảo biển giới 1.1 Sử dụng vi tảo dinh dưỡng người động vật 1.2 Khai thác hoạt chất từ vi tảo 1.2.1 Giới thiệu chung 6 1.2.2 Vai trò DHA người 1.3 Giới thiệu chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium 13 1.3.1 Các sản phẩm có giá trị cao sản xuất từ Schizochytrium II 15 Tình hình nghiên cứu nước vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu hóa chất 21 2.1.1 Vật liệu 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 21 2.1.4 Môi trường 2.2 22 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phân lập chi Schizochytrium 22 2.2.2 Chụp ảnh hình thái tế bào số chủng Schizochytrium spp 23 2.2.3 Xác định sinh trưởng tảo 23 2.2.4 Tách chiết lipit tổng số 24 2.3.5 Xác định thành phần hàm lượng axit béo khơng bão hịa đa nối Mạc Thị Thùy Trang ii K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học đôi 25 2.3.6 Tách chiết lipit khơng xà phịng hóa 26 2.3.7 Xác định squalene phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 26 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết phân lập chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium 3.2 Sàng lọc nhanh chủng phân lập dựa sinh trưởng hàm lượng lipit tổng số 3.3 27 28 Động học q trình sinh trưởng tích lũy lipit squalene chủng TG11(6) bình tam giác lít 35 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Mạc Thị Thùy Trang iii 38 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT LCPUFA Long Chain Polyunsaturated Fatty Axit béo không bão hịa mạch Acids dài, đa nối đơi SKK Sinh khối khô Sinh khối khô NTTS Nuôi trồng thủy sản Nuôi trồng thủy sản EPA Eicosapentaenoic acid Axit eicosapentaenoic DHA Docosahexaenoic acid Axit docosahexaenoic AA Arachidonic acid Axit arachidonic ALA Alpha-linolenic acid Axít α- linolenic PG Prostaglandins Prostaglandins TX Thromboxanes Thromboxanes LT Leukotrienes Leukotrienes EN Ectoplasmic Net Hệ thống mạng lưới ngoại chất TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng cao áp Chromatography Mạc Thị Thùy Trang iv K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng số loại thực phẩm vi tảo Bảng 1.2 Một số axít béo khơng bão hịa thuộc nhóm omega-3 thường gặp Bảng 1.3 Một số axít béo khơng bão hịa thuộc nhóm omega-6 thường gặp Bảng 1.4 Các loại PUFA đặc trưng vi tảo 13 Bảng 3.1 Các chủng Schizochytrium spp phân lập từ Thanh Hóa 27 Quảng Ninh Bảng 3.2 Sự thay đổi mật độ tế bào chủng Schizochytrium spp 28 phân lập Thanh Hóa Quảng Ninh Bảng 3.3 Sự thay đổi sinh khối khô chủng Schizochytrium spp 29 phân lập Thanh Hóa Quảng Ninh Bảng 3.4 Hàm lượng lipit chủng Schizochytrium spp phân lập 31 Thanh Hóa Quảng Ninh Bảng 3.5 Hàm lượng lipit, thành phần hàm lượng axít béo 34 sinh khối chủng TG11(6) sau ngày nuôi cấy môi trường M1 Bảng 3.6 Sự thay đổi mật độ tế bào, hàm lượng lipit lipit khơng xà 35 phịng hóa chủng Schizochytrium sp TG11(6) nuôi môi trường M1 bình tam giác lít Mạc Thị Thùy Trang v K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học DHA Hình 1.2 Ảnh minh họa hình thái tế bảo vi tảo Schizochytrium sp 14 Hình 2.1 Vùng biển ngập mặn Tĩnh Gia –Thanh Hóa 21 Hình 2.2 Vùng biển ngập mặn Tiên Yên – Quảng Ninh 21 Hình 2.3 Một số hình ảnh quy trình phân lập 23 Hình 3.1 Đĩa khuẩn lạc chủng Schizochytrium phân lập Thanh 27 Hóa (A) Quảng Ninh (B) Hình 3.2 Hình dạng tế bào chủng Schizochytrium sp TG 11(1) 28 QN15 ni mơi trường lỏng M1 (độ phóng đại 400 lần) Hình 3.3 Biểu đồ mật độ tế bào chủng Schizochytrium spp phân 29 lập Thanh Hóa Quảng Ninh Hình 3.4 Biểu đồ khối lượng khô chủng Schizochytrium spp 30 phân lập Thanh Hóa Quảng Ninh Hình 3.5 Đồ thị hàm lượng lipit chủng Schizochytrium spp phân 31 lập Thanh Hóa Quảng Ninh Hình 3.6 Ảnh chụp hình thái tế bào chủng nghiên cứu sau 32 ngày nuôi mơi trường M1 Hình 3.7 Lipit khơng xà phịng hóa chủng Schizochytrium spp 33 nghiên cứu Hình 3.8 Sàng lọc chủng tiềm cho sản xuất squalene 33 phương pháp TLC Hình 3.9 Sắc ký đồ thành phần axít béo chủng TG11(6) sau ngày 34 ni cấy mơi trường M1 Hình 3.10 Biểu đồ thay đổi mật độ tế bào, hàm lượng lipit lipit 36 khơng xà phịng hóa chủng Schizochytrium sp TG11(6) ni bình tam giác lít Hình 3.11 Sự thay đổi hàm lượng squalene chủng Schizochytrium sp 36 TG11(6) ni bình tam giác lít Mạc Thị Thùy Trang vi K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học LỜI MỞ ĐẦU Schizochytrium chi vi tảo biển dị dưỡng sống hệ sinh thái biển rừng ngập mặn Đây nhóm vi tảo có khả sản xuất hợp chất thứ cấp có giá trị cao axit béo khơng bão hịa, carotenoit, enzym, polysaccharide ngoại bào steroit có squalene Axít béo omega-3 (ω-3 PUFA) đặc biệt axít docosahexaenoic (DHA, C22: 6ω-3) giúp tăng số trí tuệ trẻ làm chậm lão hóa trí não người trưởng thành Ngồi ra, tác động tích cực tầm quan trọng ω-3 PUFA chứng minh nhiều khía cạnh liên quan đến bệnh tim mạch, bệnh thấp khớp, bệnh huyết áp, liệu pháp điều trị bệnh ung thư, trí nhớ Vì vậy, việc bổ sung DHA điều cần thiết Squalene tiền chất steroit động thực vật Trong công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khơ da làm mềm da Squalene ức chế hiệu ung thư ruột, phổi, da…do tác nhân hóa học, giảm lượng cholesterol tổng số, cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp làm tăng chức miễn dịch tế bào miễn dịch không đặc hiệu tùy vào liều lượng Việc hấp thụ lượng squalene cao giúp giảm đáng kể bệnh tim mạch ung thư Do vậy, chúng sử dụng phổ biến dược phẩm Hiện nhu cầu ω-3 PUFA squalene ngày tăng giới nói chung Việt Nam nói riêng Trong đó, nguồn nguyên liệu tự nhiên để sản xuất ω-3 PUFA (dầu cá) squalene (dầu gan cá mập) ngày bị thu hẹp Do vậy, việc tìm kiếm, phát triển ứng dụng nguồn nguyên liệu để thay cần thiết Đã có nhiều lồi vi tảo biển tự dưỡng dị dưỡng nghiên cứu để sản xuất DHA, số chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sử dụng để sản xuất thương mại sản phẩm giàu ω-3 PUFA Chi Schizochytrium phân bố rộng rãi hệ sinh biển rừng ngập mặn Chi vi tảo có khả tích lũy hàm lượng lớn lipit, axít béo ω-3 PUFA squalene Việt Nam quốc gia biển có khoảng 209.740 rừng ngập mặn với hệ vi sinh vật nói chung vi tảo biển dị dưỡng nói riêng đa dạng, có nhiều lồi đặc hữu hứa hẹn nguồn tiềm sản xuất chất có hoạt tính sinh học có ω-3 PUFA squalene Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập số chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium tiềm Mạc Thị Thùy Trang K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học để sản xuất axít docosahexaenoic (DHA) squalene” nhằm bổ sung vào tập đoàn giống vi tảo biển Việt Nam tìm kiếm chủng tiềm để sản xuất chất có hoạt tính sinh học nói Mạc Thị Thùy Trang K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI TẢO TRÊN THẾ GIỚI Tảo (algae) thực vật bậc thấp có khả quang hợp Chúng có khả hấp thụ lượng ánh sáng, biến đổi lượng ánh sáng, nước CO2 thành sinh khối tảo thải khí O2 Trải qua hàng triệu năm tiến hóa, chúng coi sinh vật đa dạng với kiểu cấu trúc đơn bào, đa bào, tập đoàn [15] với nhiều phương thức sống khác quang tự dưỡng, dị dưỡng tạp dưỡng Vi tảo sử dụng hàng kỷ nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng cho người vùng khác giới Tuy nhiên, việc nuôi cấy vi tảo diễn từ vài thập kỷ trở lại Trong khoảng 30 năm trở lại đây, ngành công nghiệp công nghệ sinh học vi tảo phát triển trở nên đa dạng nhiều lĩnh vực Ngày nay, thị trường sinh khối vi tảo sản xuất khoảng 5000 khô/năm tạo doanh thu xấp xỉ 1, 25 x109 USD/năm [46] Có thể kể đến nhiều ứng dụng thương mại vi tảo sử dụng chúng làm thực phẩm cho người thức ăn cho động vật, nuôi trồng thủy sản, mỹ phẩm, xử lý môi trường Hơn nữa, chúng ni cấy nguồn chất có giá trị cao sắc tố, vitamin, chất đồng vị sinh hóa bền vững giúp cho việc nghiên cứu xác định cấu trúc trao đổi chất…Trong đó, axit béo khơng bão hịa mạch dài, đa nối đôi (Long Chain Polyunsaturated Fatty Acids - LCPUFA) sản phẩm có giá trị, thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu [46] 1.1 Sử dụng vi tảo dinh dưỡng người động vật Sử dụng vi tảo dinh dưỡng người Vi tảo có khả tăng cường hàm lượng dinh dưỡng thực phẩm thơng thường Do vậy, chúng có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe người động vật nuôi Thành phần số thực phẩm thường ngày người sử dụng số loài vi tảo khác trình bày bảng 1.1 Mạc Thị Thùy Trang K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng số loại thực phẩm vi tảo[46] Sản phẩm Protein Carbohydrate Lipit Nấm men bánh mì 39 38 Thịt 43 34 Sữa 26 38 28 Gạo 77 Đậu tương 37 30 20 43-56 25-30 4-7 48 17 21 Chlorella vulgaris 51-58 12-17 14-22 Dunaliella salina 57 32 Porphyridium cruentum 28-39 40-57 9-14 Scenedesmus obliquus 50-56 10-17 12-14 Spirulina maxima 60-71 13-16 6-7 Synechococcus sp 63 15 11 Anabaena cylindrica Chlamydomonas rheinhardii Từ bảng 1.1, thấy rằng, số lồi vi tảo kể có hàm lượng protein cao số nguồn protein thơng thường [44] Ngồi ra, carbonhydrate vi tảo tìm thấy dạng đường, tinh bột polyxacarit khác, dễ tiêu hóa [16] Hàm lượng lipit tế bào tảo thay đổi từ 1%70% đạt tới 90% sinh khối khô (SKK) điều kiện nuôi cấy định [35] Các axit béo không bão hịa bão hịa thuộc nhóm ω-3 ω-6 tảo có vai trị đặc biệt quan trọng sức khỏe người động vật Vi tảo nguồn cung cấp có giá trị hầu hết vitamin quan trọng A, B1, B2, B6, B12, C, E, nicotinate, biotin, axit folic pantothenic Vì lý kể trên, nay, sản phẩm từ vi tảo sử dụng cho người bán rộng rãi nhiều dạng khác dạng viên, nhộng dịch lỏng Chúng bổ sung vào mì sợi, đồ ăn nhanh, kẹo đồ uống chủ yếu tập trung vào chủng Arthrospira (cịn có tên khoa học Spirulina platensis), Chlorella, Dunaliella salina Aphanizomenon flos-aquae Mạc Thị Thùy Trang K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Hình 3.3 Biểu đồ mật độ tế bào chủng Schizochytrium spp phân lập Thanh Hóa Quảng Ninh Bảng 3.3 Sự thay đổi sinh khối khô chủng Schizochytrium spp phân lập Thanh Hóa Quảng Ninh Chủng Khối lượng khô(g/L) nghiên cứu ngày TG11(1) - 10,98 ± 0,12 11,98 ± 0,28 11,84 ± 0,38 11,81 ± 0,63 TG11(3) - 9,22 ± 0,11 10,66 ± 0,16 10,15 ± 0,75 10,05 ± 0,47 TG11(6) - 9,43 ± 0,13 9,55 ±0,36 12,86 ± 0,56 10,39 ± 0,42 QN2 - 8,12 ± 0,12 9,25 ± 0,07 10,58 ± 0,01 10,38 ± 0,03 QN7 - 8,06 ± 0,12 10,76 ± 0,12 10,17 ± 0,02 10,02 ± 0,01 QN15 - 7,96 ± 0,15 8,91 ± 0,13 9,39 ± 0,03 7,45 ± 0,41 Mạc Thị Thùy Trang 29 K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học Hình 3.4 Biểu đồ khối lượng khơ chủng Schizochytrium spp phân lập Thanh Hóa Quảng Ninh Kết thu cho thấy, sinh trưởng chủng phân lập chia thành nhóm chính: nhóm chủng có thời gian sinh trưởng đạt cực đại ngắn (4 ngày) bao gồm chủng TG11(1), TG11(3) QN7; nhóm chủng có thời gian sinh trưởng đạt cực đại dài (5 ngày) bao gồm chủng TG11(6); QN2 QN15 Trong số chủng phân lập được, chủng TG11(6) có mật độ tế bào - MĐTB đạt 75,94 ± 1,67 triệu tế bào/mL lượng sinh khối khô 12,86 ± 0,56 g/L sau ngày nuôi cấy Tiếp theo chủng TG11(3), TG11(1), QN15, QN7 thấp chủng QN2 (39,01 ± 0,97 triệu tế bào/mL; 10,58 ± 0,01 g/L) Hàm lượng lipit tổng số chủng nghiên cứu phân tích thời điểm sinh khối đạt cực đại Kết nghiên cứu trình bày Bảng 3.4 Hình 3.5 Mạc Thị Thùy Trang 30 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Bảng 3.4: Hàm lượng lipit chủng Schizochytrium spp phân lập Thanh Hóa Quảng Ninh Chủng nghiên cứu Hàm lượng lipit tổng số (% sinh khối khô) TG11(1) 23,88 ± 0,15 TG11(3) 24,58 ± 0,27 TG11(6) 36,64 ± 0,43 QN2 20,52 ± 0,13 QN7 19,34 ± 0,05 QN15 22,45 ± 0,15 Hình 3.5 Đồ thị hàm lượng lipit chủng Schizochytrium spp phân lập Thanh Hóa Quảng Ninh Từ kết Bảng 3.4 Hình 3.5, thấy rằng, chủng TG11(6) có hàm lượng lipit đạt cao 36,64 ± 0,43 % sinh khối khô- SKK, chủng TG11(3) (24,58 ± 0,27% SKK), TG11(1) (23,88 ± 0,15% SKK), QN15 (22,45 ± 0,15% SKK), QN2 (20,52 ± 0,13% SKK) QN7 (19,34 ± 0,05% SKK) Hình 3.6 ảnh chụp tế bào chủng phân lập nuôi môi trường M1 sau ngày nuôi cấy Mạc Thị Thùy Trang 31 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp ngày Khoa Cơng nghệ sinh học ngày TG 11 (1) TG 11 (3) TG 11 (6) Hình 3.6 Ảnh chụp hình thái tế bào chủng nghiên cứu sau ngày nuôi môi trường M1 Bên cạnh lipit tổng số, tiến hành sàng lọc nhanh chủng phân lập dựa hàm lượng squalene tích lũy sau ngày nuôi cấy Phần lipit không xà phịng hóa tách chiết mơ tả phần Vật liệu Phương pháp nghiên cứu Hàm lượng lipit khơng xà phịng hóa chủng nghiên cứu Hình 3.7 Sau tách chiết phần lipit khơng xà phịng hóa, squalene phân tách TLC Kết Hình 3.8 cho thấy dựa vào độ đậm nhạt băng squalene chủng cho thấy chủng TG11(6) QN7 chủng có hàm lượng squalene đạt cao chủng lại Mạc Thị Thùy Trang 32 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Hình 3.7 Lipit khơng xà phịng hóa chủng Schizochytrium spp nghiên cứu Ghi chú: Giếng 1: Squalene chuẩn (2 µL; µg/µL) Giếng 2-5: Mẫu lipit khơng xà phịng hóa tách từ sinh khối chủng QN2, QN7, QN15, TG11 (1), TG11 (6) TG11 (3) sau ngày nuôi cấy Hình 3.8: Sàng lọc chủng tiềm cho sản xuất squalene phương pháp TLC Tuy nhiên, dựa thông số sinh trưởng, hàm lượng lipit tổng số squalene, lựa chọn chủng TG11(6) cho nghiên cứu sâu Thành phần hàm lượng axít béo tổng số chủng TG11(6) sau ngày nuôi cấy Bảng 3.5 Hình 3.9 Kết thu hàm lượng lipit thành phần phổ axit béo chủng TG11(6) cho thấy, DHA palmitic thành phần axít béo tổng số Hàm lượng DHA chủng đạt Mạc Thị Thùy Trang 33 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học cao, chiếm đến 40% so với tổng số axít béo Hàm lượng axít palmitic đạt gần 41% so với tổng số axít béo Bảng 3.5: Hàm lượng lipit, thành phần hàm lượng axít béo sinh khối chủng TG11(6) sau ngày ni cấy mơi trường M1 TT Kí hiệu Tên khoa học C14:0 Tetradecanoic acid C15:1 (n-5) Dodecanoic acid C16:0 Tên thường gọi Hàm lượng (% tổng số axít béo) Myristic 2,50 Lauric 4,10 Hexadecenoic acid Palmitic 40,91 C17:0 Heptadecanoic acid Margric 0,86 C18:0 Octadecenoic acid Stearic 0,88 C22:5 (n-6) 7,10,13,16,19docosahexaenoic acid C22:6 (n-3) 10,74 DPA 4,7,10,13,16,19- DHA 40,01 Docosahexaenoic acid Tổng axít béo bão hồ 45,15 Tổng axít béo khơng bão hồ 54,85 Hình 3.9: Sắc ký đồ thành phần axít béo chủng TG11(6) sau ngày ni cấy môi trường M1 Mạc Thị Thùy Trang 34 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Bên cạnh DHA chiếm tỷ lệ phần trăm cao, cịn phát thấy có mặt DPA với 10,74% so với tổng số axít béo Axít béo nhà khoa học quan tâm nghiên cứu hoạt tính cao DHA nhiều lần [32] Do vậy, chủng hứa hẹn nhiều tiềm cho việc ứng dụng nuôi trồng thủy sản ngành công nghiệp dược phẩm thực phẩm chức 3.3 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG TÍCH LŨY LIPIT VÀ SQUALENE Ở CHỦNG TG11(6) TRONG BÌNH TAM GIÁC LÍT Dựa sinh trưởng, hàm lượng lipit tổng số squalene, lựa chọn chủng TG11(6) để tiếp tục nghiên cứu sâu Ở đây, động học trình sinh trưởng, tích lũy lipit, lipit khơng xà phịng hóa squalene chủng nghiên cứu thời điểm ni cấy khác bình tam giác lít Các kết thu được, trình bày Bảng 3.6 Hình 3.8, 3.9 Bảng 3.6: Sự thay đổi mật độ tế bào, hàm lượng lipit lipit khơng xà phịng hóa chủng Schizochytrium sp TG11(6) ni mơi trường M1 bình tam giác lít Mật độ Lipit tổng số Lipit khơng xà phịng hóa Ngày ni (x 106 tế bào/mL) (% sinh khối khô) (% sinh khối khô) 2,03 ±1,23 - - 78,83 ±1,56 31,43 ±0,45 4,00 ±0,78 79,13 ±1,78 31,91 ±0,56 4,47 ±0,45 70,83 ±1,37 27,74 ±0,74 3,87 ±0,69 60,05 ±1,42 27,64 ±0,28 3,39 ±0,63 Ghi chú: -: không xác định Kết từ Bảng 3.6 Hình 3.8 cho thấy, so với ni trồng bình tam giác 250 mL, thời gian đạt cực đại chủng TG11(6) ni cấy bình tam giác lít nhanh (3 ngày) mật độ tế bào cực đại đạt không khác biệt đáng kể Hàm lượng lipit tổng số đạt cực đại ngày nuôi thứ (31,91 ±0,56% SKK) không khác biệt nhiều so với ngày thứ (31,43 ±0,45% SKK) Sự tích lũy lipit giảm dần kéo dài thời gian nuôi cấy với giảm mật độ tế bào Theo chiều hướng tương tự, hàm lượng lipit khơng xà phịng hóa tăng đến ngày ni cấy thứ giảm dần sau Trái ngược với xu hướng trên, kết chạy TLC cho thấy, hàm lượng squalene đạt cực đại sau ngày nuôi cấy giảm rõ rệt Mạc Thị Thùy Trang 35 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học ngày ni cấy Như vậy, thấy rằng, tích lũy squalene khơng trùng với pha sinh trưởng tích lũy lipit Và squalene nằm phần lipit khơng xà phịng hóa tăng hàm lượng squalene lại không tỷ lệ thuận với tăng thành phần lipit Đây kết mặt định tính Vì thời gian thực khóa luận tốt nghiệp ngắn nên việc xác định xác hàm lượng squalene phương pháp sắc kí lỏng cao áp chủng TG11(6) chưa thực Vì vậy, thời gian tới có điều kiện cần tiếp tục nghiên cứu Hình 3.10: Biểu đồ thay đổi mật độ tế bào, hàm lượng lipit lipit khơng xà phịng hóa chủng Schizochytrium sp TG11 (6) ni bình tam giác lít Ghi chú: Giếng 1: Squalene chuẩn (2 µL; µg/µL) Giếng 2-5: Mẫu lipit khơng xà phịng hóa tách từ sinh khối chủng TG11 (6) 2-6 ngày nuôi cấy, tương ứng Hình 3.11: Sự thay đổi hàm lượng squalene chủng Schizochytrium sp TG11 (6) ni bình tam giác lít Mạc Thị Thùy Trang 36 K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu trình bày trên, chúng tơi xin rút số kết luận sau: 1.Từ 50 mẫu giai đoạn phân hủy vùng rừng ngập mặn Tĩnh GiaThanh Hóa Tiên Yên- Quảng Ninh, phân lập thành công chủng thuộc chi Schizochytrium kí hiệu TG11(1), TG11 (3), TG11(6); QN2, QN7 QN15 Trong số chủng phân lập lựa chọn chủng TG11(6) chủng có khả sản xuất sinh khối cao (12,86 ± 0,56 g khô/L), hàm lượng lipit lớn (36,64 ± 0,43% sinh khối khơ), giàu axít béo khơng bão hòa đặc biệt DHA, DPA (chiếm tới 40% 10% tổng số axít béo, tương ứng) sau ngày nuôi cấy Kết sàng lọc squalene phương pháp sắc kí mỏng cho thấy chủng chủng tiềm cho sản xuất squalene tương lai KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thu được trình bày luận văn, chúng tơi xin kiến nghị số công việc sau: - Cần xác định xác hàm lượng squalene chủng TG11(6) phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC - Nuôi trồng chủng TG11(6) cấp độ khác nhằm đánh giá khả tạo sinh khối, sản xuất DHA, DPA sản xuất squalene Mạc Thị Thùy Trang 37 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Hoàng Lan Anh, Nguyễn Huy Nam, Vũ Mạnh Hùng Đặng Diễm Hồng (2008) Nghiên cứu tính an tồn tác dụng dược lý chế phẩm Algal Omega- từ sinh khối vi tảo biển Schizochytrium giàu DHA động vật thực nghiệm Tạp chí Hóa Học, 46(5A): 91-97 Hồng Lan Anh, Hồng Sỹ Nam, Nguyễn Ðình Hưng, Ðặng Diễm Hồng (2005) Phân lập Labyrinthula- vi tảo biển giàu acid béo khơng bão hịa n-6 DPA DHA, vùng biển Ðồ Son- Hải Phòng Hải Hậu- Nam Ðịnh Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 3(3): 381-387 Đinh Thị Thu Hằng (2011) Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất vi tảo biển làm nguyên liệu sản xuất diesel sinh học” thuộc đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 tầm nhìn 2025 Bộ Cơng thương quản lý (2009-2011) Đặng Diễm Hồng, Hồng Lan Anh, Ngơ Thị Hoài Thu (2008) Phân lập vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium giàu DHA vùng biển huyện đảo Phú Quốc Tạp chí Sinh học 30(2): 50-55 Đặng Diễm Hồng, Hồng Minh Hiền, Hồng Sỹ Nam, Nguyễn Đình Hưng, Hồng Lan Anh, Ngơ Hồi Thu, Đinh Khánh Chi (2007) Đa dạng sinh học loài tảo biển dị dưỡng Labyrinthula sp Schizochytrium sp Việt Nam Báo cáo khoa học Sinh thái tài nguyên sinh vật Hội thảo toàn quốc lần thứ hai Hà Nội, 26/10/2007, trang 332-338 Nguyễn Ðình Hưng, Hồng Sỹ Nam, Hoàng Lan Anh & Ðặng Diễm Hồng (2007) Một số đặc điểm sinh học Labyrinthula vùng biến phía bắc Việt Nam Tạp chí Sinh học, 29 (2): 67-77 Đinh Thị Ngọc Mai, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng (2013) Bước đầu nghiên cứu squalene số chủng vi tảo biển phân lập Việt Nam Tạp chí Sinh học 35(3): 333-341 Trần Thế Mưu & Vũ Văn Sáng (2013) Ảnh hưởng thức ăn dến tỷ lệ thành thục tu hài mẹ tỷ lệ sống ấu trùng (Lutraria philippinarum) Tạp chí Khoa học Phát triển 11(1): 24-29 Mạc Thị Thùy Trang 38 K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học Ngơ Thị Hồi Thu, Hoàng Thị Lan Anh, Đặng Diễm Hồng (2009) Tối ưu hố điều kiện ni cấy mơi trường lỏng chủng Schizochytrium sp PQ6 phân lập huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang Tạp chí sinh học 31(4): 82-88 Tài liệu tham khảo tiếng Anh 10 Aki, T., Hachida, K., Yoshinaga, M., Katai, Y., Yamasaki, T., Kawamoto, S., Kakizono, T., Maoka, T., Shigeta, S., Suzuki, O., Ono, K.(2003) Thraustochytrids as a potential source of carotenoids J Am Oil Chem Soc 80: 789-794 11 Apt, E.K., Behrens, W.P.(1999).Commercial development in microalgal biotechnology J Phycol, 35: 215- 226 12 Armenta, R.E., Burja, A., Radianingtyas, H., Barrow, C.J.(2006) Critical assessment of various techniques for the extraction of carotenoids and Coenzyme Q10 from the thraustochytrid strain ONC-T18 J Agric Food Chem, 54: 9752–9758 13 Bailey, R B., DiMasi, D., Hansen, J M., Mirasoul, P J., Ruecker, C M., Veeder, III., George, T., Kaneko, T., Barclay, W R.(2003) Enhanced production of lipids containing poloyunsaturated fatty acids by very high density cultures of eukaryotic microbes in fermentors United States Patent 6,607,900 14 Barclay, W.R., Weaver, C., Metz, J.(2005) Development of a docosahexaenoic acid production technology using Schizochytrium: a historical perspective In: Cohen Z, Ratledge C (eds) Single cell oil AOCS, Champaign, Illinois 15 Becker, E.W.(1995) Biotechnology and Algae, Cambridge University Press 16 Becker, E.W.(2004) Microalgae for human and animal nutrition In Richmond A (ed) Handbook of microalgae culture Blackwell, Oxford: 312-351 17 Belarbi, E.H., Molina, E., and Chisti, Y.(2000) A process for high yield and scaleable recovery of high purity eicosapentaenoic acid esters from microalgae and fish oil Process Biochem, 35: 951-969 18 Benedetti, S., Benvenuti, F., Pagliaran, S., Francogli, S., Scoglio., and Canestrari, F.(2004) Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-green algae Aphanizomenon flos-aquae Life Sci, 75: 2353-2362 Mạc Thị Thùy Trang 39 K18.CNSH.11˗02
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 19 Bligh, E G and Dyer.(1959) A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol, 37: 911-917 20 Calder, P C.,(2003) Long chain n-3 fatty acids and inflammation: potential application in surgical and trauma patients Brazillian J Med Biol Res, 36: 433446 21 Carlson, S.E., Wilson, W.W.(1994) Docosahexaenoic Acid (DHA) supplementation of preterm (Pt) infants - effect on the 12-month bayley mental developmental index (MDI) Pediatr Res, 35:A20 22 Chamberlain, A H L.(1980) Cytochemical and ultrastructural studies the cell wall of Thraustochytrium spp Bot Mar 23: 669-677 23 Dufosse, L., Galaup, P., Yaron, A., Malis-Arad, S., Blanc, P., ChidrambaraMurthy, K., Ravishankar, G.(2005) Microorganisms and microalgae as sources of pigments for food use: a scientific oddity or an industrial reality Trends Food Sci Technol 16: 389–406 24 Fan, K W & Chen, F.(2007) Production of high-value products by marine microalgae thraustochytrids In: Shang-Tian Y (ed) Bioprocessing for valueadded products from renewable resources Elsevier, Amsterdam: 293–323 25 Fan, K W., Aki, T., Chen, F (2010) Enhanced production of squalene in the thraustochytrid Aurantiochytrium mangrovei by medium optimization and treatment with terbinafine World J Microbiol Biotechnol 26: 1303-1309 26 He, H P., Cai, Y H., Sun, M., Corke, H (2002) Extraction and purification of squalene from Amaranthus grain J Agric Food Chem 50: 368-372 27 Hernandez- Perez, M., Gallego, R.M.R., Alayon, P.J.P., Hernandez, A.B (1997) Squalene content in liver from deep-sea sharks caught in Canary Island waters Mar Fresh Res 48: 573-576 28 Jensen, S., Ginsberg, D.I., and Drapeau, M.S.(2001) Blue-green algae as an immuno-enhancer and biomodulator J Am Nutraceutical Assoc, 3: 24-30 29 Jiang, Y., Fan, K W., Wong, R T Y., Chen, F (2004) Fatty acid composition and squalene content of the marine microalga Schizochytrium mangrovei J Agric Food Chem 52:1196–1200 Mạc Thị Thùy Trang 40 K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học 30 Kamlangdee, N., and Fan, K W (2003) Polyunsaturated fatty acids production by Schizochytrium sp isolated from mangrove Songklanakarin J Sci Technol, 25(5): 643-650 31 Kohno, Y., Egawa, Y., Itoh, S., Nagaoka, S., Takahashi, M., Mukai, K.(1995) Kinetic study of quenching reaction of singlet oxygen and scavenging reaction of free radical by squalene in nbutanol Biochim Biophys Acta, 1256: 52-56 32 Kumon, Y., Yokoyama, R., Yokochi, T., Honda, D., Nakahara, T.(2003) A new labyrinthulid isolate, which solely produces n-6 docosapentaenoic acid Appl Microbiol Biotechnol 63:22–28 33 Lewis, T.E., Nichols, P., McMeekin, P.(2000) Production of polyunsaturated fatty acids by Australian Thraustochytrids: aquaculture applications In: Hatchery feeds for aquaculture Proceedings of a workshop held in Cairns 9– 10 March 2000: 43-49 34 Li, Q., Chen, G Q., Fan, K W., Lu, F P., Aki, T., Jiang, Y (2009) Screening and characterization of squalene –producing thraustochytrids from Hong Kong mangroves J Agric Food Chem 57: 4267-4272 35 Metting, F.B.(1996) Biodiversity and application of microalgae J Ind Microbiol, 17: 477-489 36 Muller-Feuga, A.(1996) Microalgues marines Les enjeux de la recherche Institut Fransais de Recherche pour l’exploitation de la mer, Plouzane 37 Porter, D (1990) Phylum Labyrinthulomycota In: Margulis, L., Corliss, J O., Melkonian, M & Chapman, D J (eds.): Handbook of Protoctista Jones and Bartlett Publishers, Boston, pp 388-398 38 Pugh, N., and Pasco, D.S.(2001) Characterization of human monocyte activation by a water soluble prepararition of Aphanizomenon flos-aquae Phytomedicine, 8: 445-453 39 Raghukumar, S (2002) Ecology of the marine protists, the labyrinthulomycetes (Thraustochytrids and Labyrinthulids) Eur J Protistol 38:127–45 40 Raghukumar, S (2008) Thraustochytrid marine protists: production of PUFAs and other emerging technologies Mar Biotechnol 10:631-640 Mạc Thị Thùy Trang 41 K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học 41 Ratledge, C.(2004) Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production Biochimie, 11: 807–815 42 Ratledge, C.(2005) Single Cell Oils for the 21st Century In: Cohen Z, Ratledge C (eds) Single cell oils AOCS Press, Illinois: 1–20 43 Renaud, S.M., Thinh, L.V., Lambrinidis, G., and Parry, D.L.(2002) Effect of temparature on growth, chemical composition and fatty acid composition of tropical Australian microalgae grown in batch cultures Aquaculture, 211: 195214 44 Soletto, D., Binaghi, L., Lodi, A., Carvalho, J.C.M., and Converti, A.(2005) Batch and fed-batch cultivations of Spirulina platensis using ammonium sulphate and urea as nitrogen sources Aquaculture, 243 : 217-224 45 Song, X., Zhang, X., Guo, N., Zhu, L., Kuang, C.(2007) Assessment of marine thraustochytrid Schizochytrium limacinum OUC88 for mariculture by enriched feeds Fish Sci 73:566–573 46 Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., and Isambert, A.(2006) Commercial applications of microalage J Biocien Bioeng, 101 (2): 87-96 47 Truska, M., Vrinten, P., Qiu, X (2009) Metabolic engineering of plants for polyunsaturated fatty acid production Mol Breeding, 23: 1-11 48 Van Beelen, V.A., Roeleveld, J., Mooibroek, H., Sijtsma, L., Bino, R.J., Bosch, D., et al.(2007) A comparative study on the effect of algal and fish oil on viability and cell proliferation of Caco-2 cells Food Chem Toxicol, 45:716– 724 49 Ward, O.P., Singh, A.(2005) Omega-3/6 fatty acids: alternative sources of production Process Biochem, 40:3627–3652 50 Yamasaki, T., Aki, T., Shinozaki, M., Taguchi, M., Kawamoto, S., Ono, K.(2006) Utilization of Shochu distillery wastewater for production of polyunsaturated fatty acids and xanthophylls using thraustochytrid J Biosci Bioeng, 102: 323–327 51 Yokochi, T., Nakahara, T., Higashihara, T., Yamaoka, M & Kurane, R (2001) A new method for labyrinthulids using a bacterium, Psychrobacter phenylpyruvicus Mar Biotechnol 3: 68-73 Mạc Thị Thùy Trang 42 K18.CNSH.11˗02 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học 52 Yue & Jiang (2009) Impact of methyl Jasmonate on squalene biosynthesis in microalga schyzochytrium mangrovei Process Biochemistry 44:923-927 Trang web tham khảo 53 http://www.baomoi.com/Doi-doi-tren-mot-vung-chan-song/148/14355516.epi 54 http://www.quangninh.gov.vn/vi%20VN/huyenthi/huyentienyen/Trang/Tin%20 chi%20ti%E1%BA%BFt.aspx?newsid=451&dt=2012-05-06&cid=1 55 http://en.wikipedia.org/wiki/Omega-3_fatty_acid 56 http://ungthubachmai.com.vn/dinh-dng/item/2213-omega-3-trongd%E1%BA%A7u-c%C3%A1-c%C3%B3-li%C3%AAn-quan%C4%91%E1%BA%BFn-t%C4%83ng-nguy-c%C6%A1-m%E1%BA%AFcung-th%C6%B0-ti%E1%BB%81n-li%E1%BB%87t-tuy%E1%BA%BFn.html Mạc Thị Thùy Trang 43 K18.CNSH.11˗02