Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng việt nam schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ THỊ THƠM NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA - TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021 Công trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … …., ngày … tháng … năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ Sinh học DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ (05 bài) Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Dang Diem Hong Optimization of cultural conditions for omega - fatty acids and carotenoids production by Schizochytrium mangrovei TB17 Academia Journal of Biology (được chấp nhận đăng ngày 21/09/2021) Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng (2021) Cultivation and extraction of omega 3-6 fatty acids from the heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei TB17 to make a functional food Research Journal of Biotechnology 16 (8): 22 - 32 (eSCIE) Lê Thị Thơm, Nguyễn Hoàng Ngân, Đặng Diễm Hồng (2018) Nghiên cứu tính an tồn tác dụng dược lý viên nang algal oil omega - giàu DHA, EPA, DPA từ dầu vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei TB17 động vật thực nghiệm Tạp chí Sinh học 40(2): 194 - 203 Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Dang Diem Hong (2017) Extraction of bio - oil rich in omega - fatty acid using different methods from heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei Academia Journal of Biology 39 (3): 459 - 466 Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng (2017) Nghiên cứu ảnh hưởng chất chống oxy hóa đến q trình bảo quản dầu sinh học giàu acid béo không bão hịa đa nối đơi omega - omega - Tạp chí Cơng nghệ sinh học 15 (4A): 159 - 164 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Hiện nay, nhu cầu sống đòi hỏi cao giá trị dinh dưỡng người khơng sử dụng loại dầu ăn thơng dụng mà cịn loại dầu đặc sản có giá trị cao (dầu salad, dầu chức năng) để phục vụ cho ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người, dược phẩm Các loại dầu từ thực vật chứa axít béo khơng bão hịa có mạch cacbon ≤ 18 Trong đó, loại dầu thực vật dầu lanh, canola đậu tương chứa axit béo khơng bão hịa đa nối đơi dạng omega-3 (polyunsaturated fatty acid omega 3; PUFAs ω-3) chủ yếu axít α-linolenic (ALA) loại dầu khác dầu bắp, dầu hạt vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu PUFAs ω-6 Đối với loại axít béo ω-3 có số cácbon lớn 20 22 chủ yếu lại có nguồn gốc từ cá biển Nguồn cung cấp cho axít béo docosahexaenoic (DHA; C22:6) axít eicosapentaenoic (EPA; C20:5) loài cá nhiều mỡ cá trích, cá thu cá hồi Tuy nhiên, chất lượng dầu cá biển tự nhiên lại phụ thuộc vào lồi cá, mùa vụ vị trí đánh bắt; đánh bắt cá mức gây suy giảm đa dạng cân sinh thái Sử dụng dầu PUFAs có nguồn gốc từ cá phần thức ăn, kể cho trẻ nhỏ dược phẩm gặp số bất lợi có tạp nhiễm polychlorinated biphenyls (PCBs) dioxin, kim loại nặng… mùi vị đặc trưng cá gây Hơn nữa, dầu cá biển thực tế hỗn hợp phức tạp axít béo có chiều dài mạch cácbon mức độ khơng bão hồ đa nối đơi khác Do vậy, việc tinh chúng khó khăn địi hỏi chi phí tốn trước sử dụng chúng vào mục đích khác nâng cao giá trị sử dụng sản phẩm tạo so với giá trị ban đầu Dầu sinh học giàu PUFAs ω - sản xuất từ số loài vi tảo thu hút quan tâm nghiên cứu dần có vị trí đáng kể, khơng ngừng mở rộng phát triển mạnh mẽ thị trường thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người, dược phẩm giới nói chung Việt Nam nói riêng Vi tảo biển (VTB) sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai thác chất có hoạt tính sinh học, để xử lý mơi trường, làm phân bón, nhiên liệu sinh học ứng dụng rộng rãi ni trồng thủy sản (NTTS) với số lồi VTB quang tự dưỡng truyền thống Tuy nhiên, việc nuôi trồng VTB quang tự dưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất sản phẩm từ sinh khối tảo có giá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa quy mơ lớn Để khắc phục nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác ứng dụng loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) có chi Schizochytrium thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu nhà khoa học nước thực mẻ Việt Nam hứa hẹn mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống người Lồi VTBDD Schizochytrium mangrovei có khả tích lũy hàm lượng lipit cao, lên tới 70% sinh khối khô (SKK) hàm lượng 3 PUFAs EPA, DHA chiếm 30-50% so với axít béo tổng số (Total fatty acid - TFA) Vai trò -3 PUFAs nêu chứng minh có ích lợi cho phát triển trí não trẻ nhỏ, sức khỏe hệ tim mạch, hệ thần kinh hỗ trợ nhiều liệu pháp điều trị bệnh ung thư, trí nhớ, trầm cảm Hiện nay, chi VTBDD S mangrovei coi ứng cử viên tiềm thay nguồn sản xuất -3 PUFAs truyền thống từ dầu cá Ở Việt Nam, nghiên cứu nhân nuôi sinh khối (NNSK), tách chiết ứng dụng axít béo từ VTBDD cịn mẻ có tiềm ứng dụng lớn Chính vậy, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3-6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người” Mục tiêu nghiên cứu luận án - Sàng lọc chủng/loài VTBDD tối ưu điều kiện nhân nuôi sinh khối để thu sinh khối giàu axít béo ω - 6; - Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh bảo quản dầu sinh học giàu axit béo ω - từ loài vi tảo biển lựa chọn được; - Sản xuất viên nang dầu sinh học giàu axít béo ω - có độ an tồn cao đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả học tập viên nang động vật thực nghiệm Các nội dung nghiên cứu luận án - Sàng lọc chủng tiềm giàu axít béo ω - từ loài VTBDD Việt Nam; tối ưu điều kiện nhân nuôi thu sinh khối chủng tiềm quy mơ bình tam giác, hệ thống lên men 5, 10, 30 150 Lít - Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh bảo quản dầu sinh học giàu axít béo ω - nhằm cung cấp nguyên liệu đảm bảo chất lượng ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người; - Sản xuất viên nang Algae oil omega - (AOO-3-6) từ dầu sinh học giàu axít béo ω - đảm bảo chất lượng, có tính an tồn cao đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả học tập viên AOO-3-6 mơ hình động vật thực nghiệm Chương Tổng quan Axít béo có cơng thức tổng qt: CH3-(CH2)n-COOH PUFAs axít béo mạch dài (18 - 22 nguyên tử cacbon) có chứa hai nhiều liên kết đơi Mạch hydrocarbon có đầu: đầu nhóm methyl đầu nhóm cacboxyl Chúng phân loại theo vị trí liên kết đơi tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl Để vị trí nối đơi mạch cacbon tính từ đầu methyl người ta sử dụng ký hiệu “n” “ω” Các liên kết đơi PUFAs tính từ gốc carboxyl ký hiệu “Δ” Những nhóm ω-3, ω6 hay ω-9 PUFAs có liên kết đơi tương ứng vị trí cacbon số 3, hay tính từ gốc methyl (Singh cs, 2014) Có hai nhóm axít béo khơng thay quan trọng ω - ω - Các axít béo ω - quan trọng là: ALA (C18:3), EPA, DHA, DPA (C22:5 ω-3) Các axít béo ω - là: Linoleic acid (LA; C18:2 ω-6), gama linoleic (GLA - C18:3), eicosadienoic, dihomo-gamma-linoleic (DGLA), ARA (C20:4), DPA (C22:5 ω-6) (Mu cs., 2016) Các axit béo ω - có vai trị quan trọng tham gia vào điều hịa q trình trao đổi lipit, vận chuyển hướng tới mơ Điều góp phần quan trọng việc điều chỉnh hoạt động protein màng Chúng thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào não, thị giác, hệ thần kinh góp phần cải thiện hiệu bệnh tim mạch: giảm nguy loạn nhịp tim; có hiệu rõ rệt điều trị suy nhược; giảm nguy hình thành khối u tuyến tiền liệt; làm chậm tốc độ tăng trưởng mảng xơ vữa động mạch (Nagy, 2017); thành phần thức ăn quan trọng cần thiết cho việc tăng tỷ lệ sống, phát triển biến thái ấu trùng (Becker, 2004) VTBDD nguồn cung cấp ω-3 PUFAs với số ưu điểm sau: nuôi cấy VTBDD dễ dàng hệ thống lên men nên sản xuất dầu quanh năm, khơng phụ thuộc vào mùa vụ, nhiệt độ khơng sử dụng ánh sáng mặt trời, kiểm sốt tốt thơng số cần thiết suốt q trình NNSK, thành phần axít béo đơn giản tốc độ tăng trưởng cao so với nuôi trồng VTB quang tự dưỡng hệ thống bể hở hệ thống kín (Bumbak cs., 2011) Nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa q trình NNSK thraustochytrids chứng minh cải thiện đáng kể suất sinh khối hàm lượng DHA (Chen cs., 2016; Jiang cs., 2017) Sinh khối đạt tới 171,5 g/L (Bailey cs., 2003), hàm lượng TFA chiếm 83,84% sinh khối khơ (SKK) (Li cs., 2015), hàm lượng PUFAs cao đạt tới 76,5% (Marchan cs., 2017) Sản xuất dầu vi tảo xem giải pháp thay bền vững góp phần đáp ứng nhu cầu ngày tăng người sử dụng dầu sinh học giàu axit béo dạng ω 3-6 (Finco cs., 2017) Cùng với chi Labyrinthula, Schizochytrium chi VTBDD thuộc họ Thraustochytrids lần công bố Việt Nam từ 2008 (Đặng Diễm Hồng cs., 2008) Các chi phát phân lập số vùng rừng ngập mặn Việt Nam Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hố, Thái Bình, Bình Định huyện đảo Phú Quốc, Tỉnh Kiên Giang Các chi có hàm lượng DHA cao đến 5-7% SKK (gấp 510 lần so với tất vi sinh vật VTB biết Việt Nam), sinh khối khô đạt 30 g/L (Hoàng Thị Lan Anh cs., 2010) Tuy nhiên, trình NNSK chủng PQ6 cho thấy chủng chứa chủ yếu axít béo DHA EPA chiếm 43,58 0,75% so với TFA, tương ứng, hàm lượng DPA ω- thấp chí khơng có số cấp độ ni bình tam giác, hệ thống lên men 5, 10 150 lít (Dang et al., 2011; Hiền cs., 2013) Ví dụ NNSK bình lên men 10 lít, xuất DHA đạt 8,71 11,55 g/L, tương ứng Thành phần axit béo chủng PQ6 NNSK bình lên men 150 lit chứa DHA EPA (không chứa DPA -3) chiếm 32,98 0,67% so với TFA Do vậy, việc tìm kiếm chủng khơng chứa DHA, EPA mà cịn có chứa DPA -3 - axít béo quan trọng cần thiết cho sức khỏe người, có tác dụng sinh học cao DHA EPA - có hàm lượng cao ổn định qua cấp độ nuôi cần thiết Từ sinh khối nuôi trồng được, tiến hành tách chiết, tinh hỗn hợp axít béo bảo đảm an tồn có tác dụng sinh dược nhằm ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người vấn đề nghiên cứu cần thiết Việt Nam Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu 2.1.1 Chủng tảo điều kiện NNSK - Hai mươi hai chủng VTBDD Schizochytrium spp phân lập vùng rừng ngập mặn Việt Nam từ 2008 - 2015 thuộc Bộ sưu tập giống VTBDD phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ sinh học sử dụng cho nghiên cứu 2.1.2 Động vật thí nghiệm - Chuột nhắt trắng chuột cống trắng Ban chăn ni động vật thí nghiệm, Học viện Qn Y cung cấp 2.1.3 Sinh khối tảo cặp mồi đặc hiệu - Sinh khối tươi mẫu vi tảo Schizochytrium sp TB17 bảo quản 20ºC sử dụng Cặp mồi đặc hiệu 18S001: AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA (22 nu) 18S13: CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT (25 nu) để khuếch đại gen 18S rRNA loài vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium, Thraustochytrium với kích thước dự kiến khoảng 1,7 kb theo công bố Honda cs., (1999) 2.2 Hóa chất thiết bị - Các hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu hóa chất thơng dụng Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ… sản xuất thiết bị, máy móc thơng dụng, cần thiết phịng thí nghiệm 2.3 Mơi trường - Môi trường GPY (g/L): glucose (2), cao nấm men (0,5), polypeptone (1), muối biển nhân tạo (17,5), agar (1,5) để lưu giữ giống - Môi trường M1 (g/L): glucose (30), cao nấm men (10), muối biển nhân tạo (17,5) để sàng lọc chủng lựa chọn điều kiện NNSK chủng Schizochytrium spp - Môi trường NNSK Schizochytrium spp bình lên men 5, 10, 30 150 Lít, kí hiệu M12 gồm (g/L): glucose (90), cao nấm men công nghiệp (10), muối biển nhân tạo (17,5) - Môi trường NNSK fed - batch môi trường P1 theo Pora cộng (2014) có thành phần (g/L): glucose (75), urea (10), cao nấm men (12), NaCl (2,5), KH2PO4 (9,6), MgSO4 (12), CaCl2 (1,2), NaHCO3 (1,2), Na2SO4 (0,8), vi lượng (56 mL/L), 150 mL dầu thực vật Trong đó, stock vi lượng có thành phần (g/L): MnCl2.2 H2O (8,6), CoCl2.6H2O (0,2), NiSO4 6H2O (7,5), Na2MoO4 6H2O (0,15), ZnSO4.7H2O (5,7), CuSO4 5H2O (6,5), FeSO4 7H2O (32), ZnCl2 (1,5) 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Sàng lọc nhân nuôi sinh khối chủng tiềm hệ thống nhân ni khác cho tích lũy axit béo ω - cao - Xác định sinh trưởng thông qua thông số mật độ tế bào (MĐTB) đếm buồng đếm Burker - Turk (Đức) sinh khối tảo khô (SKK; sấy khối lượng không đổi 105oC) - Xác định hàm lượng glucose dư môi trường lên men theo phương pháp Miller (1959) - Phương pháp nhuộm lipit Nile red (Jara cs., 2003) - Chụp ảnh hình thái tế bào kính hiển kính hiển vi huỳnh quang kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy - TEM) - Phân tích thành phần hàm lượng axít béo sinh khối tảo (Đặng Diễm Hồng cs., 2007) 2.4.2 Phương pháp tách chiết làm giàu hỗn hợp axít béo giàu ω - - Hàm lượng lipít tổng số xác định phương pháp Bligh Dyer (1959) - Hàm lượng lipít tổng số xác định phương pháp soxhlet (Nguyễn Văn Mùi, 2001) - Tách chiết axít béo tự (free fatty axít - FFA) từ dầu thơ (lipit) (theo Johnson Wen, 2009) - Làm giàu hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo ω - từ hỗn hợp FFA phương pháp tạo phức với urê (Johnson Wen, 2009) - Tách chiết TFA làm giàu hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo ω - dạng methyl este (Johnson Wen, 2009) - Làm giàu hỗn hợp axít béo  - dạng methyl este phương pháp tạo phức với urea (Johnson Wen, 2009) - Các điều kiện tinh hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo ω - dạng methyl este (Johnson Wen, 2009) 2.4.3 Xác định tiêu chất lượng dầu - Xác định số axít hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo ω - (theo TCVN (tiêu chuẩn Việt Nam) 6127: 2007 Nguyễn Văn Mùi (2001) - Xác định số peroxyt hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo ω - (theo TCVN 6121:2007) - Xác định số iot hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo ω - 6 (Phạm Thị Trân Châu cs., 1998) - Định tính urea hỗn hợp sản phẩm ω 3-6 (theo TCVN 184: 2003) - Xác định trạng thái cảm quan theo TCVN 2627-1993 - Xác định tiêu kim loại nặng vi sinh vật theo phương pháp AOAC 999.10, Thủy ngân (Hg): AOAC 971.21, Asen (As): AOAC 986.15, Tổng số vi khuẩn hiếu khí: ISO 4833 - 1: 2013, E coli: ISO 7251:2005, Coliforms: ISO 4831:2006, Staphylococcus aureus: ISO 6888 - 1: 1999, Sreptococccus faecal: ISO 6889 - 1: 1999, Salmonella: ISO 6579: 2002, P aerugimosa: ISO 6580: 2002, Tổng số nấm men, mốc: ISO21527- 1:2008 2.4.4 Tính an tồn tác dụng cải thiện trí nhớ, khả học tập viên AOO-3-6 - Độc tính cấp độc tính bán trường diễn viên AOO-3-6 giá trị LD50 xác định theo phương pháp Litchfield-Wincoxon (Đỗ Trung Đàm, 2001; 2014), theo qui định Bộ Y tế Việt Nam (Bộ Y Tế, 2007), hướng dẫn Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD) (OECD, 2002) Tổ chức Y tế giới (WHO, 2000) - Tác dụng tăng cường cải thiện trí nhớ, khả học tập viên AOO3-6 theo Nguyễn Liêm cộng (2002) 2.5 Bố trí thí nghiệm 2.6 Xử lý số liệu Số liệu trình bày số trung bình ± sai số chuẩn Sự sai khác coi có ý nghĩa thống kê mức P