Phân lập một số chủng vi tảo dị dưỡng thuộc chi thraustochytrium giàu axit béo không bão hòa đa nói đôi pufa và astaxanthin cho nuôi trồng thủy sản

Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, vi tảo biển coi đối tượng tiềm thu hút quan tâm đặc biệt nhà nghiên cứu nhiều lĩnh vực ứng dụng sống Ứng dụng vi tảo biển đa dạng bao gồm khai thác chất có hoạt tính sinh học, làm thức ăn cho động vật, thực phẩm chức cho người, xử lý mơi trường, phân bón sinh học Tuy nhiên, ứng dụng phổ biến vi tảo biển tách chiết chất có giá trị thương mại Trong năm gần đây, việc sử dụng loài vi tảo biển dị dưỡng thuộc nhóm thraustochytrids để sản xuất axít béo khơng bão hịa đa nối đơi (PUFA) carotenoit ngày quan tâm có chi Thraustochytrium Thraustochytrium chi vi tảo biển dị dưỡng phân bố rộng rãi hệ sinh thái biển rừng ngập mặn Chúng đóng vai trị sinh vật phân huỷ, mắt xích chuỗi thức ăn hệ sinh thái nói Loại vi tảo có khả tích lũy hàm lượng cao lipit PUFA thuộc nhóm omega-3 axít docosahexaenoic (DHA, C22:6ω-3), axít docosapentaenoic (DPA, C22:5ω-3) axít eicosapentaenoic (EPA, C20:5ω-3)- axít béo có vai trị quan trọng sức khỏe người động vật ni trồng thủy sản Bên cạnh đó, chi vi tảo nguồn tiềm cho việc sản xuất sắc tố nhóm carotenoit đặc biệt astaxanthin Sự có mặt đồng thời hàm lượng PUFAs carotenoit cao thraustochytrid nâng cao giá trị ứng dụng chúng lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Khác với nhiều loài tảo quang tự dưỡng, Việt Nam, nghiên cứu chi Thraustochytrium mẻ song bước đầu cho thấy nhiều triển vọng đặc biệt việc sử dụng sinh khối chúng cho nuôi trồng thủy sản bối cảnh mà nguồn thức ăn có chất lượng cao, phù hợp với đối tượng nuôi vấn đề cấp thiết cần giải hầu hết nguồn thức ăn nhập ngoại, giá đắt mà chất lượng khơng bảo đảm gây khó khăn cho người chăn ni Với mục đích bổ sung vào sưu tập giống vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam tìm kiếm chủng tiềm để sản xuất chất có hoạt tính sinh học nói trên, ni thu sinh khối để sử dụng nuôi trồng thủy sản, tiến hành đề tài "Phân lập số chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Thraustochytrium giàu axít béo khơng bão hịa đa nối đơi (PUFA) astaxanthin cho nuôi trồng thủy sản" Vũ Thị Huệ K18.CNSH.11-04 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I VI TẢO VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI TẢO TRÊN THẾ GIỚI Vi tảo sử dụng hàng kỷ nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng cho người vùng khác giới Tuy nhiên, việc nuôi cấy vi tảo diễn hàng vài thập kỷ trở lại Trong khoảng 30 năm trở lại đây, công nghiệp công nghệ sinh học vi tảo phát triển trở nên đa dạng nhiều lĩnh vực Ngày nay, thị trường sinh khối vi tảo sản xuất khoảng 5000 khô/năm tạo doanh thu xấp xỉ 1, 25 x109 USD/năm [53] Tảo (algae) thực vật bậc thấp có khả quang hợp Chúng có khả hấp thụ lượng ánh sáng, biến đổi lượng ánh sáng, nước CO2 thành sinh khối tảo thải khí O2 Trải qua hàng triệu năm tiến hóa, chúng coi sinh vật đa dạng với kiểu cấu trúc đơn bào, đa bào tập đoàn [13] với nhiều phương thức sống khác quang tự dưỡng, dị dưỡng tạp dưỡng Tảo nói chung vi tảo nói riêng có vai trị quan trọng tự nhiên đời sống người Trong thủy vực, tảo cung cấp ơxy mắt xích chuỗi thức ăn thủy vực Hàng năm, số 200 tỉ chất hữu tạo thành trái đất vi tảo tạo khoảng 170-180 tỉ Vai trò quan trọng vi tảo thể qua trình quang hợp hấp thụ CO2, cung cấp O2 cho sinh vật khác trái đất, khép kín vịng tuần hồn vật chất làm tăng tốc độ quay vòng chu trình [6] Việc sử dụng vi tảo đời sống người có lịch sử phát triển lâu dài Người Trung Quốc sử dụng Nostoc cách 2000 năm làm thức ăn để tồn có nạn đói diễn ra; hay Arthrospira cư dân sống ven hồ Chad Mexico sử dụng làm thức ăn hàng ngày [53] Tuy nhiên, công nghệ sinh học vi tảo thực bắt đầu phát triển vào kỷ 20 Ngày nay, vi tảo có nhiều ứng dụng thương mại, phải kể đến việc sử dụng vi tảo nhằm tăng cường giá trị dinh dưỡng thực phẩm thức ăn cho người động vật; khai thác chất có hoạt tính sinh học Sản lượng ứng dụng số lồi vi tảo có tiềm ứng dụng tóm tắt bảng 1.1 Vũ Thị Huệ K18.CNSH.11-04 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 1.1 : Sản lượng ứng dụng số lồi vi tảo [53] Tảo Hiệu suất (tấn khơ/năm) Nước sản xuất Trung Quốc, Arthrospira 3000 Dunaliella salina Aphanizomenon flos-aquae Haematococcus pluvialis Crypthecodium cohnii Schizochytrium 2000 1200 phẩm Dinh dưỡng cho người Mỹ, Myanma, động vật, mỹ phẩm, Nhật phycobiliprotein Đài Loan, Chlorella Ứng dụng sản Dinh dưỡng cho người, Trung Quốc, Nhật nuôi trồng thủy sản, mỹ Bản phẩm Úc, Israel, Mỹ, Dinh dưỡng cho người, Trung Quốc mỹ phẩm, β-caroten 500 300 Mỹ Dinh dưỡng cho người Mỹ, Ấn Độ, Nuôi trồng thủy sản, Israel astaxanthin 240 Mỹ Dầu DHA 10 Mỹ Dầu DHA Trong nhiều ứng dụng thương mại vi tảo sử dụng làm thực phẩm cho người thức ăn cho động vật, nuôi trồng thủy sản (NTTS), mỹ phẩm, xử lý môi trường Hơn nữa, chúng ni cấy nguồn chất có giá trị cao axít béo khơng bão hịa mạch dài, đa nối đôi (LCPUFA), sắc tố, vitamin… 1.1 Axít béo khơng bão hịa đa nối đơi - PUFA 1.1.1 Giới thiệu chung PUFAs Các axít béo mạch dài (18-22 ngun tử carbon) khơng bão hồ đa nối đơi – LCPUFAs, có chứa hai nhiều liên kết đôi carbon Chúng phân loại dựa theo vị trí liên kết đơi tính từ đầu metyl Những nhóm n-3, n-6 hay n-9 PUFA có liên kết đơi vị trí carbon thứ 3, hay tương Vũ Thị Huệ K18.CNSH.11-04 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp ứng, đếm từ đầu metyl Để vị trí nối đơi mạch carbon, người ta sử dụng ký hiệu ‘‘n” hay ‘‘ω” Các liên kết đơi PUFA đếm từ nhóm carboxyl ký hiệu ‘‘∆” Axít α- Linolenic (ALA, 18:3 ∆ 9,12,15), axít eicosapentaenoic (EPA, 20: ∆ 5,8,11,14,17) axít docosahexaenoic (DHA, 22:6 ∆ 4,7,10,13,16,19) axít béo khơng bão hịa đa nối đơi nhóm này, quan tâm nghiên cứu nhiều chúng có ảnh hưởng tích cực sức khỏe người động vật Hình 1.1 cấu trúc hóa học DHA EPA Hình 1.1: Cấu trúc hóa học DHA EPA ( http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/omega-3-fatty-acids.html) Chúng ta biết rằng, bệnh liên quan đến động mạch vành bệnh suy nhược chức tim tăng mạnh lối sống phương Tây suy giảm tỷ lệ DHA phần ăn [39] Trên thực tế, vai trò DHA PUFA khác việc làm giảm bệnh tim mạch hàng trăm thí nghiệm in vivo in vitro [26] Cả EPA DHA có vai trị ngăn chặn nguy tăng huyết áp, bệnh tim mạch xơ vữa động mạch hay đột qụy Li cs (2003) việc thu nhận đầy đủ axít béo ω-3 bao gồm DHA giai đoạn trẻ nhỏ ngăn chặn nguy tăng huyết áp già Thêm vào đó, liệu từ thử nghiệm can thiệp cho thấy LCPUFAs có tác dụng làm giảm nguy bị bệnh tim mạch, điều chế làm giảm triacylglycerol huyết thanh, chống rối loạn nhịp tim tim, chống nghẽn Vũ Thị Huệ K18.CNSH.11-04 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp mạch [43] So với bệnh cao huyết áp, bệnh học ung thư phức tạp có nhiều dạng DHA EPA ức chế cyclocoxygenase, làm giảm hàm lượng prostaglandin làm tăng hoạt tính lipoxygenase Điều dẫn đến làm tăng sản xuất hydroxyeicosatrienoic acid (HETE) leukotrien B4 (LTB4) Sau đó, HETE LTB4 lại có tác dụng làm chậm trình ung thư tế bào phát triển thành ung thư mô Trong năm gần đây, số nghiên cứu bệnh học ω- PUFA mà chủ yếu EPA DHA giữ vai trị quan trọng hình thành hệ thần kinh Những LCPUFA có khả điều chỉnh cách hiệu hàm lượng cholesterol huyết thanh, góp phần ngăn chặn rối loạn tâm thần [50] Vai trò EPA DHA việc làm giảm nguy rối loạn tâm thần chúng có tác động đến thụ thể dẫn truyền thần kinh G-protein thông qua tác động lên tính chất sinh lý màng tế bào, tín hiệu thứ cấp protein kinase Một số yếu tố liên quan đến dinh dưỡng, mắt vỏ não cho có ảnh hưởng đến phát triển tính nhạy bén, phải kể đến thu nhận ω-3 LCPUFA thời kỳ sơ sinh Đặc biệt, DHA xem nhân tố thiết yếu phát triển thần kinh thị giác trẻ nhỏ [28] Trên thực tế, tổ chức y tế giới, Quỹ dinh dưỡng Anh Quốc, Hội tiêu hóa dinh dưỡng trẻ em Châu Âu Hội Quốc tế nghiên cứu axit béo lipit nhấn mạnh đến tầm quan trọng DHA AA đồng thời khuyến cáo PUFA nên có tất cơng thức ăn trẻ nhỏ Hiện nay, 50% công thức ăn cho trẻ nhỏ Mỹ chứa hỗn hợp DHA AA [59] Mức độ thu nhận DHA hàng ngày khuyến cáo 120 mg/ngày nam giới 100 mg/ngày phụ nữ người cao tuổi Tuy nhiên nước phương Tây, hàm lượng axít béo omega -3 phần ăn không đầy đủ Để ngăn ngừa loại bệnh khác mà chủ yếu bệnh tim mạch rối loạn tâm thần hàm lượng axít béo omega thích hợp phần ăn cần thiết Một phương pháp để đảm bảo hàm lượng axít béo omega phần ăn làm tăng hàm lượng axít béo sản phẩm thức ăn thịt, bơ, sữa, mát, trứng…[17] Vũ Thị Huệ K18.CNSH.11-04 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.1.2 Các nguồn sản xuất PUFAs Nguồn axit béo omega truyền thống dầu cá Vai trò nguồn omega ngày khẳng định từ công bố nhà khoa học Đan Mạch vấn đề nghiên cứu lý bệnh tim mạch dường không xuất hay trầm trọng người Greenland Eskimo so với quần thể người khác Người ta nhận thấy quần thể người thường xuyên ăn cá Nauy hay Nhật Bản có nguy bị bệnh tim thấp, điều khẳng định tầm quan trọng DHA EPA- hai PUFA dầu cá [49] Tuy nhiên, việc sử dụng dầu cá nguồn thức ăn bổ sung bị giới hạn vấn đề liên quan mùi vị không dễ chịu cá mức độ ổn định oxi hoá thấp chúng Tuy nhiên, việc cung cấp dầu cá ngày gặp nhiều khó khăn suy giảm quần thể cá nhiều đại dương Hơn nữa, thành phần EPA dầu cá khơng thích hợp trẻ nhỏ axit béo cho liên quan đến chậm phát triển thần kinh Thêm vào đó, dầu cá bị nhiễm kim loại nặng chất độc khác chất gây ô nhiêm môi trường công bố [21] Sản xuất DHA từ vi tảo biển quang tự dưỡng bể phản ứng quang sinh khó thu lượng sinh khối lớn Điều số vấn đề chưa giải giới hạn ánh sáng tích luỹ oxi chủng quang tự dưỡng Các axit béo từ tảo sản xuất theo quy mơ lớn việc sử dụng thay loài tảo dị dưỡng Các lồi tảo ni cấy hệ thống lên men truyền thống, lên men cung cấp lượng sinh khối ổn định điều kiện kiểm sốt, thu sản phẩm có chất lượng cao Việc sản xuất sinh khối nhờ lên men hồn tồn tăng lên hay giảm tuỳ theo nhu cầu thị trường Thêm vào đó, lên men khơng phụ thuộc vào thời gian hay mùa Tuy nhiên, có DHA tảo thương mại hóa Mặc dù loài tảo Porphyridium purpureum, Phaeodactylum tricornutum, Isochrysis galbana, Nannochloropsis sp Nitzschia laevis chứng minh nguồn tiềm để sản xuất EPA, loại dầu tảo chưa thương mại hóa phép cạnh tranh thành cơng với nguồn khác Vấn đề tương tự tồn axit γ-linolenic Vũ Thị Huệ K18.CNSH.11-04 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp AA [14,53] Vì việc sàng lọc lồi vi tảo dị dưỡng sản xất DHA quan trọng Bảng 1.2 suất tạo DHA EPA từ số vi tảo quang tự dưỡng dị dưỡng [52] Bảng 1.2 Tóm tắt số thơng số vài đối tượng sản xuất DHA Tên chủng Phương pháp nuôi Hệ Nguồn thống cacbon Năng suất mg/l/h DHA EPA thiết bị Monodus subtarraneus P B CO2 2,5 Nitzschia laevis H B Glucoe 2,1 Crypthecodinium cohnii H B Glucose 19 Crypthecodinium cohnii H B Acetic 48 acid Crypthecodinium cohnii H B Ethanol 53 Thraustochytrium G13 H B Glucose 20 Schizochytrium sp H S Glucose 53 Schizochytrium sp.SR21 H S Glucose 33 Schizochytrium sp.SR21 H B Glucose 138 Ghi chú: P Quang dưỡng; H Dị dưỡng; S Nuôi lắc bình; B Lên men Với thể dị dưỡng, quang hợp sử dụng bon sinh lượng thay việc cung cấp glucose nguồn cácbon sử dụng khác vào môi trường Kết là, hệ thống lên men sản xuất mật độ sinh khối lớn 200 g sinh khối khô/lit môi trường nuôi cấy, ước tính giá thành sản xuất tảo dị dưỡng