Gây đột biến nấm men Rhodosporidium toruloides tăng cường sinh astaxanthin bằng tác nhân ethyl methanesulfonate và đánh giá khả năng bắt gốc 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl của astaxanthin

Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(4):1670-1678 Bài nghiên cứu Open Access Full Text Article Gây đột biến nấm men Rhodosporidium toruloides tăng cường sinh astaxanthin tác nhân ethyl methanesulfonate đánh giá khả bắt gốc 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl astaxanthin Trần Thị Tuyết Nhung, Ngơ Đại Nghiệp* TĨM TẮT Use your smartphone to scan this QR code and download this article Astaxanthin carotenoid có giá trị mặt kinh tế, Tổ chức Quản lý Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận để dùng làm chất tạo màu thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu thu nhận chủng nấm men Rhodosporidium toruloides đột biến tăng cường sinh astaxanthin tác nhân hoá học gây đột biến ngẫu nhiên ethyl methanesulfonate (EMS) EMS hiệu gây đột biến nồng độ khảo sát 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 6,0% việc tác động lên nấm men tăng cường sinh astaxanthin Trong số chủng đột biến sàng lọc, chủng nấm men đột biến EMS nồng độ 3,5% cho khả tích luỹ astaxanthin cao nhiều so với chủng bố mẹ (tăng gấp 4,7 lần) Chủng nấm men đột biến E4 có thời gian sinh trưởng pha lag ngắn khoảng giờ, pha log khoảng 32 nuôi cấy, pha ổn định kéo dài 35 bắt đầu vào pha suy vong sau 70 nuôi cấy Thời điểm thu nhận astaxanthin tốt sau 96 nuôi cấy môi trường Hansen, hàm lượng astaxanthin tích lũy 1719 µ g/L Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết thô astaxanthin thu nhận từ chủng đột biến E4 có khả bắt gốc tự 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (IC50 = 9,106 µ g/mL) cao gấp 10,6 lần so với vitamin E mở hướng ứng dụng rộng rãi công nghiệp dược phẩm, dinh dưỡng thực phẩm chức năng, chế phẩm sử dụng công nghiệp nuôi trồng thủy hải sản Từ khoá: astaxanthin, Rhodosporidium toruloides, ethyl methanesulfonate, DPPH MỞ ĐẦU Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Liên hệ Ngô Đại Nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Email: ndnghiep@hcmus.edu.vn Lịch sử • Ngày nhận: 11-06-2021 • Ngày chấp nhận: 29-10-2021 • Ngày đăng: 20-11-2021 DOI : 10.32508/stdjns.v5i4.1086 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license Astaxanthin (3,3´-dihydroxy- β -carotene-4,4´dione) sắc tố thuộc nhóm ketocarotenoid, Tổ chức Quản lý Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration-FDA) chấp thuận để dùng làm hợp chất tạo màu thực phẩm, thức ăn nuôi trồng thuỷ sản Ngồi ra, astaxanthin có hoạt tính kháng oxy hố mạnh, chống lại tế bào ung thư, bảo vệ nơron thần kinh, giúp phòng bệnh lý tim mạch, bảo vệ võng mạc, chống lại thoái hoá điểm vàng tuổi tác, bảo vệ da khỏi tác hại tia cực tím, giúp làm tăng sức chịu đựng phòng tổn thương xương 2,3 Do vậy, astaxanthin ứng dụng rộng rãi công nghiệp dược phẩm, dinh dưỡng thực phẩm chức mỹ phẩm Nguồn thu nhận astaxanthin cung cấp chủ yếu tự nhiên từ động vật giáp xác, vi khuẩn, tảo nấm men tổng hợp từ hợp chất có nguồn gốc từ cơng nghệ hố dầu Trong đó, q trình tổng hợp hố học cho sản lượng astaxanthin lớn nhược điểm gây ô nhiễm môi trường, đáng ý cần xem xét mức độ an toàn chức sinh học loại astaxanthin tổng hợp Để giải vần đề trở ngại này, việc thu nhận astaxanthin từ nguồn tự nhiên, đặc biệt vi sinh vật có khả sinh tổng hợp astaxanthin phát triển nhanh chóng Trong lồi vi sinh vật có khả tổng hợp astaxanthin, vi tảo Haematococcus pluvialis lồi nghiên cứu kỹ tích luỹ lượng lớn astaxanthin (1,5–5,0% tổng trọng lượng khơ) Tuy vi tảo H pluvialis có hàm lượng astaxanthin cao ứng dụng quy mô công nghiệp bị hạn chế kỹ thuật ni cấy địi hỏi chi phí cao tế bào tăng trưởng chậm Chính vậy, nỗ lực tìm kiếm đối tượng nghiên cứu nấm men xem giải pháp tổng hợp astaxanthin quy mô công nghiệp hiệu tảo lục Rhodosporidium toruloides lồi nấm men có khả sử dụng chất lignocellulose để lên men, đồng thời có khả tạo tích tụ hàm lượng lipid cao sinh khối, sinh tổng hợp carotenoid, enzyme có giá trị cho ngành cơng nghiệp hố dầu dược phẩm 6–8 Những năm gần đây, nấm men xem đối tượng thu nhận astaxanthin đầy tiềm hàm lượng astaxanthin tích luỹ khối lượng sinh Trích dẫn báo này: Nhung T T T, Nghiệp N D Gây đột biến nấm men Rhodosporidium toruloides tăng cường sinh astaxanthin tác nhân ethyl methanesulfonate đánh giá khả bắt gốc 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl astaxanthin Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 5(4):1670-1678 1670 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(4):1670-1678 khối lớn thời gian nuôi cấy ngắn so với vi tảo Nấm men R toruloides công bố nguồn hứa hẹn sinh tổng hợp carotenoid đầy tiềm có khả sử dụng nguồn carbon có giá thành thấp, nguồn cung dồi để sinh trưởng tốc độ phát triển nhanh 6,8 Tuy nhiên chủng R toruloides hoang dại cho hàm lượng tích luỹ astaxanthin thấp, dẫn đến việc bị hạn chế ứng dụng quy mô cơng nghiệp Do việc nghiên cứu tăng cường hiệu sinh astaxanthin chủng R toruloides thông qua tạo tuyển chọn chủng đột biến mang tính khoa học thực tiễn cao Đã có nhiều cơng bố chứng minh tác nhân đột biến hoá học có khả ảnh hưởng đến sinh tổng hợp astaxanthin nấm men 8,9 Trong nghiên cứu này, tác nhân ethyl methanesulfonate sử dụng để gây đột biến chủng nấm men R toruloides nhằm tăng cường sinh astaxanthin so với chủng gốc ban đầu Mặc dù có nhiều nghiên cứu theo hướng cải biến di truyền chủng R toruloides để tạo chủng đột biến dùng làm tảng sản xuất hợp chất khác tiến hành giới 8,9 Tuy nhiên Việt Nam giới chưa có công bố liên quan đến việc sử dụng tác nhân ethyl methanesulfonate để tạo chủng đột biến R toruloides có khả tăng cường sinh astaxanthin Ngồi việc tạo tuyển chọn chủng đột biến tăng cường sinh astaxanthin so với chủng gốc R toruloides phân lập từ tác giả Ngô Đại Nghiệp cộng 10 , hoạt tính kháng oxy hố astaxanthin thu nhận từ chủng nấm men đột biến tiến hành thử nghiệm kiểm chứng phương pháp DPPH VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu thí nghiệm Nấm men R toruloides chủnghoang dại phân lập tỉnh miền Đông Nam bộ, lưu giữ giống glycerol 20% nhiệt độ -80o C phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh hóa, Khoa Sinh học – Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Các chủng nấm men đột biến nghiên cứu sàng lọc tuyển chọn ngẫu nhiên dựa màu sắc khuẩn lạc so với màu sắc chủng nấm men hoang dại (mẫu đối chứng) Sau sàng lọc, 150 chủng nấm men, thu nhận 18 chủng (kí hiệu từ E1 đến E18) có hàm lượng astaxanthin cao so với chủng hoang dại Môi trường dùng để lên men R toruloides môi trường Hansen lỏng (pH 6) chứa thành phần gồm: 50 g/L glucose, 10 g/L peptone, g/L KH2 PO4 1671 g/L MgSO4 Mơi trường nhân giống tiến hành bình tam giác (dung tích 250 mL) chứa 100 mL mơi trường Hansen bổ sung 5% tỉ lệ giống nấm men R toruloides , ni cấy lắc 200 vịng/phút nhiệt độ phòng 96 Đột biến nấm men R toruloides ngẫu nhiên EMS Tế bào nấm men sau nuôi đạt mật độ tế bào khoảng 108 tế bào/mL xử lý với EMS 11 Dịch huyền phù tế bào (1 mL) ủ với EMS nồng độ khác gồm 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 6%, vortex nhẹ sau ủ lắc 30 phút, sau sinh khối tế bào rửa lại lần với nước cất để loại bỏ EMS Dịch tế bào sau xử lý (100 µ L) cấy trang đĩa chứa môi trường Hansen thạch ủ nhiệt độ phòng tối ngày Tỉ lệ sống tế bào sau xử lý với EMS đếm dựa số lượng khuẩn lạc mọc đĩa petri Tiến hành tuyển chọn khuẩn lạc nấm men có màu sắc thay đổi so với chủng hoang dại, nuôi môi trường Hansen lỏng ngày nhiệt độ phòng, lắc 200 vòng/ phút để xác định hàm lượng sinh khối astaxanthin Xây dựng đường cong tăng trưởng xác định thời điểm thu nhận astaxanthin thích hợp chủng nấm men đột biến Xây dựng tương quan tuyến tính giá trị OD610nm mật độ tế bào log N/mL 12 Dung dịch nuôi cấy nấm men pha lỗng thành huyền phù có độ đục đo OD610nm theo dãy giá trị 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0 Từ huyền phù có độ đục trên, pha lỗng đếm tế bào nấm men buồng đếm hồng cầu Tính mật độ tế bào (N/mL) dựng đường tương quan tuyến tính giá trị OD610nm mật độ tế bào log N/mL Cấy huyền phù tế bào nấm men vào 100 mL môi trường nuôi điều kiện nhiệt độ phòng, tốc độ lắc 200 vòng/phút Ly tâm thu sinh khối vào giai đoạn tăng trưởng khác (pha log, cuối pha log, đầu pha ổn định, pha ổn định pha suy tàn) Tách chiết sắc tố từ sinh khối khô thu xác định hàm lượng astaxanthin Xác định tỉ lệ tế bào sống sót Tỉ lệ tế bào nấm men R toruloides sống sót tính theo cơng thức (1): Tỉ lệ sống sót = (Cs/Cc) x100 (1) Trong Cs Cc tương ứng tổng số tế bào đếm sau xử lý với tác nhân gây đột biến mẫu đối chứng (mẫu không xử lý với tác nhân gây đột biến) 13 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(4):1670-1678 Xác định khối lượng sinh khối Các chủng nấm men đột biến nuôi cấy erlen chứa 100 mL mơi trường Hansen lỏng lắc 200 vịng/ phút, nhiệt độ phòng 96 Thu sinh khối sau 96 nuôi cấy cách ly tâm 4000 vòng/ phút, phút, bỏ dịch Rửa phần cặn tế bào với nước cất (lặp lại hai lần) ly tâm 4000 vòng/ phút (5 phút), thu sinh khối sấy khô 60 o C đến khối lượng không đổi Ghi nhận khối lượng sinh khối khơ tính theo g/L, sinh khối sử dụng để xác định hàm lượng astaxathin 13 Tách chiết xác định hàm lượng astaxanthin Hàm lượng astaxanthin xác định dựa phương pháp Fang Chang 14 An cộng 15 , có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm Nghiền 0,2g sinh khối khô mL DMSO 55o C, ủ 30 phút Vortex phút, ly tâm 4000 vòng/phút, vòng phút, thu dịch chứa DMSO Thêm vào phần cặn mL acetone, vortex kỹ ly tâm 4000 vòng/ phút, phút, thu dịch (chiết với aceton 2-3 lần phần cặn hết sắc tố) Gộp tất dịch chiết aceton dịch chứa DMSO, thêm vào ether dầu hỏa (tỷ lệ 1:2 so với tổng dịch chiết), 10 mL nước cất, khơng tách pha thêm mL NaCl bão hịa, thu pha ether dầu hỏa phía chứa sắc tố Thêm nước vào dịch chiết sắc tố (tỷ lệ 1:1), bỏ pha nước (chứa acetone DMSO), thu dịch chiết sắc tố pha ether dầu hỏa (lớp phía trên) Lặp lại bước 3–5 lần để loại bỏ hoàn toàn DMSO Định lượng astaxanthin phương pháp đo độ hấp thu dung dịch chiết sắc tố Cho dịch chiết sắc tố bay hoàn toàn nhiệt độ phòng, hòa tan sắc tố 10 mL ether dầu hỏa Đo độ hấp thu dung dịch chiết sắc tố bước sóng 468 nm, với mẫu đối chứng ether dầu hỏa Tính hàm lượng astaxanthin (µ g/g) có mẫu theo Kelly-Harmon (1972) 16 : X= A468 * V * 104 / (E1cm % * G) (2) A468: độ hấp thu dung dịch chiết sắc tố dung mơi PE bước sóng 468; V: thể tích dung dịch chiết sắc tố (mL); E1cm %: độ hấp thu dung dịch astaxanthin 1% dung môi PE (cuvette 1cm) (E = 2100); G: trọng lượng sinh khối nấm men (g) Khảo sát khả kháng oxy hóa astaxanthin phương pháp DPPH DPPH hồ tan dung mơi DMSO để đạt nồng độ 0,1 mM Trong vitamin E sử dụng làm chất đối chứng pha dãy nồng độ 20– 100 µ g/mL Mẫu cao astaxanthin pha lỗng theo dãy nồng độ 4–20 µ g/mL Tiến hành ủ mẫu với DPPH theo tỉ lệ 4:1 tối 30 phút, có lắc nhẹ, sau đo OD bước sóng 517 nm 17 Mẫu đối chứng, astaxanthin thay DMSO, thực nghiệm thêm mẫu astaxanthin đối chứng tương ứng nồng độ mẫu ủ để loại bỏ phần sai số màu astaxanthin dung môi chứa mẫu gây (mẫu không ủ với thuốc thử DPPH) Tính phần trăm ức chế theo công thức sau, xây dựng đồ thị nồng độ phần trăm ức chế, từ tìm giá trị IC50 %RSA = Abs control − Abs sample × 100 Abs sample (3) % RSA: Phần trăm ức chế Abs control: Giá trị OD mẫu đối chứng + giá trị OD mẫu astaxanthin tương ứng nồng độ ( không ủ với DPPH) Abs sample: Giá trị OD mẫu đo Xử lý thống kê phân tích liệu Các số liệu nghiên cứu lặp lại ba lần biểu thị độ lệch tiêu chuẩn (± SD - standard deviation) Phần mềm SAS phiên 8.2 ( SAS institute, Cary NC, USA) sử dụng để phân tích thống kê theo thuật toán ANOVA, Duncan test giá trị p