Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng việt nam schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA - TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA - TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI” Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội – 2021 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS TS Đặng Diễm Hồng, ngun Trưởng Phịng Cơng nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - người thầy định hướng, bảo tận tình kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ tinh thần, vật chất, động viên tơi vượt qua nhiều trở ngại khó khăn để hoàn thành luận án suốt năm qua Tôi trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, phịng đào tạo học Viện Khoa học Công nghệ thầy cô giáo tham gia giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn đồng nghiệp cơng tác phịng Cơng nghệ Tảo: TS Hồng Thị Minh Hiền, TS Ngơ Thị Hồi Thu, TS Hoàng Thị Lan Anh, TS Lưu Thị Tâm, TS Nguyễn Cẩm Hà, ThS Đinh Thị Ngọc Mai … cho tơi lời khun chân thành, đóng góp ý kiến giúp đỡ tơi hồn chỉnh số liệu luận án Tôi xin cảm ơn Khoa Dược lý – Học viện Quân Y giúp đỡ số thử nghiệm động vật thực nghiệm, TS Đồn Lan Phương – Viện Hóa học Các hợp chất Thiên nhiên - phân tích hàm lượng axít béo, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng - kiểm tra chất lượng dầu, Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco - bao viên, đóng gói hoàn thiện sản phẩm Luận án thực khuôn khổ đề tài cấp Bộ Công Thương “Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng” năm 2013 - 2015 thuộc Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 PGS TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2021 iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU…… ………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU………… …………………… 1.1 Giới thiệu chung axit béo, vai trò, nguồn gốc đường sinh tổng hợp axít béo…………………… ………………………………… 1.1.1 Giới thiệu chung axit béo …… ……… ……… …………………… 1.1.2 Vai trò ứng dụng PUFAs………………….………………………… 1.1.3 Nguồn cung cấp PUFAs 1.1.4 Con đường sinh tổng hợp PUFAs vi tảo ………………………………… 14 1.2 Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối điều kiện ảnh hưởng đến q trình nhân ni sinh khối ………………………… 1.2.1 Vị trí phân loại đặc điểm chi Schizochytrium …………… 18 1.2.2 Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng giới………… 1.2.3 Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium quy mô khác 18 20 sản xuất thương mại DHA……… 22 1.2.4 Một số điều kiện ảnh hưởng đến trình sinh trưởng sản xuất DHA thraustochytrid, đặc biệt chi Schizochytrium 24 1.3 Các phương pháp tách chiết, tinh PUFAs, bảo quản dầu………… 26 1.3.1 Các phương pháp tách chiết dầu thơ có chứa PUFAs……………….……… 26 1.3.2 Các phương pháp thủy phân dầu từ dầu thô ……….…………… 29 1.3.3 Các phương pháp tinh PUFAs, DHA, EPA, DPA ………………… 30 1.3.4 Bảo quản axit béo…………………… …………….……… ………… 33 1.4 Nghiên cứu tính an tồn tác dụng tăng cường trí nhớ, khả học tập dầu tách chiết từ Schizochutrium người động vật … 35 Tình hình sản xuất tách chiết PUFAs từ VTBDD Việt Nam …… 36 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 38 2.1 2.1.1 Vật liệu…………………………………………………………………… 38 Chủng tảo điều kiện nhân nuôi sinh khối …………………………………… 38 2.1.2 Động vật thí nghiệm 38 2.1.3 Sinh khối tảo cặp mồi đặc hiệu 38 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 39 2.2 Hóa chất thiết bị sử dụng…………………………………… 39 2.2.1 Hóa chất…………………………………………………………………………… 39 2.2.2 Các dụng cụ thiết bị sử dụng………………………………………………… 39 2.3 Môi trường……………………………………………………………… 40 1.5 iv 2.4 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………… 41 Sàng lọc nhân nuôi sinh khối chủng tiềm hệ thống lên men khác cho tích lũy axit béo ω - cao ……………… 41 2.4.2 Phương pháp tách chiết lipit làm giàu hỗn hợp axít béo giàu ω - 2.4.3 Xác định tiêu chất lượng dầu……………………………………… 47 2.4.4 Tính an tồn tác dụng tăng cường trí nhớ, khả học tập viên 44 Algal oil omega (AOO-3-6) 50 2.5 Bố trí thí nghiệm 51 2.5.1 Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm cho sản xuất sinh khối giàu axit béo ω - 6……………………………………………………………………………… 2.5.2 2.5.3 Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng tiềm năng… 51 52 Nhân nuôi sinh khối chủng S mangrovei TB17 hệ thống lên men khác (1, 5, 10, 30 150 Lít)……………………………………………… 52 2.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện đến q trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo ω - 54 2.5.5 Nghiên cứu khả bảo quản chất chống oxy hóa lên chất lượng dầu sinh học omega-3 omega-6 57 2.5.6 Nghiên cứu tính an tồn tác dụng tăng cường trí nhớ, khả học tập viên AOO-3-6 57 2.6 3.1 Xử lý số liệu 58 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………… 59 Sàng lọc chủng/loài tiềm lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp quy mơ khác ………………………………… 3.1.1 Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm cho sản xuất sinh khối giàu axit béo omega - 6………………………………………………………………………… 3.1.2 59 59 Lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp chủng TB17 quy mơ bình tam giác lên sinh trưởng tích lũy axit béo…………………………… 3.1.3 3.1.4 Nhân nuôi sinh khối hệ thống lên men 10 Lít ……………… 62 68 Nhân ni sinh khối hệ thống lên men 30 Lít ……………………………… 70 3.1.5 Nhân nuôi sinh khối hệ thống lên men 150 Lít ………………………… 72 3.1.6 Các phương pháp nhân nuôi khác để cung cấp sinh khối giàu axít béo ω – 6………………………………………………………………………… 74 3.1.7 Thu hoạch sinh khối chủng S mangrovei TB17 ……………… 80 3.2 Tách chiết dầu sinh học giàu axit béo ω - từ SKK chủng TB17 …… 82 3.2.1 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω - dạng FFA …… 82 3.2.2 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω - dạng methyl este … 94 3.2.3 So sánh phương pháp tách chiết dầu (dạng FFA dạng methyl ester) từ v sinh khối tươi SKK…………………… 100 3.2.4 Sản xuất đánh giá chất lượng dầu sinh học giàu axit béo ω - quy mô 100g SKK/mẻ …………………………………………… 103 3.3 Các điều kiện bảo quản dầu, sản xuất viên nang mềm đánh giá tính an tồn, tác dụng tăng cường trí nhớ, khả học tập viên nang mềm AOO-3-6…………………………………………………………… 108 3.3.1 Ảnh hưởng chất chống oxy hóa đến q trình bảo quản dầu giàu axit béo ω - 6………………………………………………… 3.3.2 Nghiên cứu sản xuất viên nang mềm algal oil omega - từ dầu sinh học giàu axit béo ω – …… 3.3.3 108 113 Nghiên cứu tính an tồn tác dụng tăng cường trí nhớ, khả học tập viên dầu tảo AOO-3-6……………………………………………………… 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………… 124 CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ………… TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………… 127 PHỤ LỤC………………………………………………………………… 126 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt ALA AOO-3-6 ARA BHA BHT CCT CNT CNMTK CNMCN DHA DPA DGLA EE EPA FFA FDA Tên tiếng Anh α-linolenic acid GRAS GLA LA MĐTB MUFA MP NTTS PL PUFA PKS PG SFA SKT SKK TEM Generally Recognized as Safe Gama linoleic acid Linoleic acid TFA TAG TG TLCT TBHQ VTB VTBDD VKTQH ω -3 ω -6 ω -6 Arachidonic acid Butylated Hydroxyanisole Butylated Hydroxytoluene Docosahexaenoic acid Docosapentaenoic acid dihomo-gamma-linoleic acid Ethyl este Eicosapentaenoic acid Free Fatty acid Food and Drug Administration Monounsaturated fatty acid Melting point Phospholipid Polyunsaturated fatty acid Polyketide synthase Propyl Gallate Saturated fatty acid Transmission electron microscopy Total fatty acid Triacylglycerol Triglyceride Tertiary Butyl Hydroquinone Omega Omega Omega - Tên tiếng Việt Axit α-linolenic Algal oil omega-3-6 Axit Arachidonic Butylated Hydroxyanisole Butylated Hydroxytoluene Chuột cống trắng Chuột nhắt trắng Cao nấm men tinh khiết Cao nấm men công nghiệp Axit Docosahexaenoic Axit Docosapentaenoic Axit dihomo-gamma-linoleic Ethyl este Axit Eicosapentaenoic Axit béo tự Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa kỳ Chứng nhận an toàn Axit Gama linoleic Axit Linoleic Mật độ tế bào Axit béo khơng bão hịa nối đơi Điểm nóng chảy Ni trồng thủy sản Phospholipid Axit béo khơng bão hịa đa nối đơi Sinh tổng hợp kỵ khí Propyl Gallate Axit béo bão hịa Sinh khối tươi Sinh khối khơ Kính hiển vi điện tử truyền qua Axit béo tổng số Triacylglycerol Triglyceride Trọng lượng thể Tertiary Butyl Hydroquinone Vi tảo biển Vi tảo biển dị dưỡng Vi khuẩn tía quang hợp Omega Omega Omega - vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng axít béo ω - có số loại dầu thực vật Bảng 1.2 Hàm lượng DHA EPA số loại cá động vật 10 Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA DHA có nguồn gốc từ vi tảo… 24 Bảng 1.4 Một số phương pháp tách chiết dầu khả thu hồi chúng……… 29 Bảng 2.1 Danh sách chủng VTBDD Schizochytrium spp.……………………… 38 Bảng 3.1 Sự thay đổi MĐTB, SKK hàm lượng lipit chủng nhân ni sinh khối bình tam giác 250 mL sau 144 ………………… Bảng 3.2 Thành phần axit béo chủng TG11(6), TB17 PQ6 Bảng 3.3 Thành phần axit béo sinh khối tươi chủng TB17 nhân nuôi sinh 60 61 khối bình tam giác Lit……………………………………………… 67 Bảng 3.4 Thành phần axít béo sinh khối tươi chủng TB17 nhân nuôi sinh khối hệ thống lên men 10 Lít 69 Bảng 3.5 Thay đổi MĐTB, SKK, hàm lượng lipit chủng TB17 nhân nuôi sinh khối hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK CNMCN Bảng 3.6 Thành phần hàm lượng axít béo chủng TB17 nhân ni sinh khối hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK CNMCN Bảng 3.7 71 Thay đổi mật độ tế bào, sinh khối khô lipit chủng TB17 nhân nuôi sinh khối hệ thống lên men 150 Lít…………………………… Bảng 3.8 70 72 Thành phần hàm lượng axít béo sinh khối tảo S mangrovei TB17 sau 120 nhân nuôi sinh khối hệ thống lên men 150 Lít………… 73 Bảng 3.9 Sinh trưởng, hàm lượng lipit glucose dư môi trường chủng TB17 điều kiện nhân nuôi sinh khối theo mẻ………………………… 75 Bảng 3.10 Sinh trưởng, hàm lượng lipit glucose dư môi trường chủng TB17 điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch…………… 75 Bảng 3.11 Thành phần axit béo sinh khối chủng TB17 phương pháp nhân nuôi sinh khối khác môi trường P1……………………… 77 Bảng 3.12 Tổng hợp thành phần hàm lượng axit béo chủ yếu q trình nhân ni sinh khối quy mô khác 79 Bảng 3.13 Thành phần axít béo lipit chủng TB17 nhân nuôi sinh khối theo mẻ hệ thống lên men 30 Lít………………………………………… Bảng 3.14 Một số tính chất dầu tảo sau phản ứng xà phịng hóa ……………… 86 88 Bảng 3.15 Thành phần axít béo hỗn hợp dầu sau phản ứng xà phịng hóa lipit 89 Bảng 3.16 Kết phân tích số tiêu hóa lý sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo ω - thu sau trình làm giàu…………………………… 92 viii Bảng 3.17 Thành phần axít béo pha rắn pha lỏng sau trình tạo phức với urea 93 Bảng 3.18 Thành phần axít béo TFA thu từ SKK chủng TB17 96 Bảng 3.19 Kết phân tích số tiêu hóa lý sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo ω - (dạng methyl ester) thu sau trình làm giàu……… 98 Bảng 3.20 Thành phần axít béo pha rắn pha lỏng sau trình tạo phức với urea 99 Bảng 3.21 Ảnh hưởng phương pháp tách chiết dầu khác nguồn sinh khối khác đến hiệu suất tách chiết dầu giàu axít béo ω - 100 Bảng 3.22 Thành phần axit béo hỗn hợp PUFAs thu dạng FFA methyl ester từ SKK SKT……………………………………………………… Bảng 3.23 Thành phần axít béo hỗn hợp axít béo ω - tách chiết lượng lớn…… 102 106 Bảng 3.24 Các tiêu chất lượng sản phầm dầu sinh học giàu axit béo ω - (dạng methyl ester) tách chiết từ sinh khối chủng TB17………………… 107 Bảng 3.25 Tổng hợp thành phần hàm lượngcác axit béo chủ yếu trình tách chiết dầu 108 Bảng 3.26 Ảnh hưởng nồng độ vitamin E lên số peroxide dầu sinh học ω 3- 6… 111 Bảng 3.27 Các tiêu chất lượng dầu giàu acid béo ω - 6…………………… 112 Bảng 3.28 Các tiêu cảm quan viên nang mềm AOO-3-6……………………… 113 Bảng 3.29 Các tiêu chất lượng lý hóa, vi sinh vật, kim loại nặng………………… 113 Bảng 3.30 Các tiêu chất lượng chủ yếu viên nang mềm thực phẩm chức giàu axít béo - 114 Bảng 3.31 Các tiêu vi sinh vật kim loại nặng của viên nang mềm thực phẩm chức giàu axít béo - Bảng 3.32 Kết nghiên cứu độc tính cấp viên nang dầu tảo AOO-3-6……… 115 116 Bảng 3.33 Ảnh hưởng viên nang AOO-3-6 trọng lượng thể chuột (n = 10, x ± SD)………………………………………………………………… Bảng 3.34 Ảnh hưởng viên nang AOO-3-6 lên số tiêu huyết học 117 chuột (n = 08, x ± SD)…………………………………………………………… Bảng 3.35 Ảnh hưởng viên nang AOO-3-6 lên nồng độ creatinin huyết 118 chuột (n = 08, x ± SD)……………………………………………………… 120 Bảng 3.36 Tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện, tốc độ dập tắt phản xạ có điều kiện tìm thức ăn mê lộ lô chuột nghiên cứu (n = 8)………… 123 PL - 34 PL - 35 PL - 36 PL - 37 PL - 38 PL - 39 PL - 40 PL - 41 PL - 42 PL - 43 PL - 44 PL - 45 PL - 46 PL - 47 PL - 48 ... ? ?Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega - từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Vi? ??t Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người? ?? với mục đích lựa chọn chủng tiềm... NGHỆ VI? ??T NAM HỌC VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA - TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VI? ??T NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC... học giàu axit béo omega - từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Vi? ??t Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người? ?? Mục tiêu nghiên cứu luận án Sàng lọc chủng/ lồi VTBDD tối