Nghiên cứu các điều kiện chiết rễ mật nhân eurycoma longifolia jack trong dung môi nước bằng phương pháp chưng ninh ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾT RỄ MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) TRONG DUNG MÔI NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG NINH ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Song Mơ Số thẻ sinh viên: 107150094 Lớp: 15H2A Đà Nẵng – Năm 2019 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma Longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Song Mơ MSSV: 107150094 Lớp: 15H2A GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm chương: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Kết luận kiến nghị Mật nhân (Eurycoma Longifolia Jack) biết đến thảo dược quý tất phận thân, rễ, sử dụng để chữa bệnh.Trong đó, rễ mật nhân phận sử dụng nhiều chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có giá trị Nước dung mơi rẻ tiền, dễ kiếm, an tồn bổ sung vào thực phẩm, lại không gây mùi vị khó chịu thực phẩm nên rễ mật nhân nước chọn đối tượng để thực cho nghiên cứu Mục đích nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, thời gian tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến trình chiết rễ mật nhân huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai dung môi nước phương pháp chưng ninh Kết cho thấy điều kiện 100 oC với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 20/1 (ml/g) thời gian 120 phút cho hàm lượng hợp chất 9,10dimethoxycanthin-6-one (EL4) cao Hợp chất có hoạt tính kháng viêm [1] gây độc tế bào mạnh dòng tế bào Fibrosarcoma HT-1080 người [2][3] Từ kết tiến hành sản xuất cao chiết mật nhân xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm Cao chiết mật nhân thể hoạt tính kháng khuẩn tương đối tốt đánh giá đảm bảo tiêu chuẩn sản phẩm bảo vệ sức khỏe Từ đó, ứng dụng cao chiết mật nhân phát triển sản phẩm trà thảo mộc mật nhân Với hàm lượng cao chiết bổ sung 0,1% (w/w), sản phẩm đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu dùng với tham gia 60 sinh viên trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng Kết cho thấy sản phẩm yêu thích Đồng thời, chất lượng đảm bảo u cầu thực phẩm bảo vệ sức khỏe ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Song Mơ Lớp: 15H2A Khoa: Hóa Số thẻ sinh viên: 107150094 Ngành: Công nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma Longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe Đề tài thuộc diện: □ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục Các vẽ, đồ thị (ghi rõ loại kích thước vẽ): Không Họ tên người hướng dẫn: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 15/08/2019 Ngày hoàn thành đồ án: 15/12/2019 Trưởng môn Công nghệ thực phẩm PGS.TS Đặng Minh Nhật Đà Nẵng, ngày 15 tháng 08 năm 2019 Người hướng dẫn PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh LỜI CẢM ƠN Sau tháng thực đề tài: “Nghiên cứu trình chiết rễ mật nhân (Eurycoma Longifolia Jack) nước phương pháp chưng ninh ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe”, hướng dẫn Trương Thị Minh Hạnh, em hồn thành xong đồ án tốt nghiệp Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Hóa - Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng nói chung, mơn Cơng nghệ thực phẩm nói riêng, phịng thí nghiệm nói riêng, tận tâm truyền đạt kiến thức tảng, nhiệt tình giúp đỡ, bảo trình học tập, nghiên cứu để em hồn thành chương trình học tập với tiến độ Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến cô PGS TS Trương Thị Minh Hạnh Trong trình thực nghiên cứu, cô dành nhiều thời gian hướng dẫn, bảo tận tình bước, từ việc chọn đề tài, thực báo cáo đề tài Với góp ý, sửa chữa cô, giúp em nắm bắt xác nội dung liên quan đến đồ án từ hồn thành đồ án cách tốt Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô phịng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Viện Công nghệ Sinh học Huế, ThS NCS Võ Khánh Hà, Trưởng phòng Vi sinh - Thực phẩm cùng anh chị Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình cùng tất bạn bè ln giúp đỡ, động viên, khích lệ chỗ dựa vững cho em suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp năm học trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Hội đồng bảo vệ đồ án tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc đưa ý kiến đóng góp cho đồ án tốt nghiệp em Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình hồn thiện đồ án khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ thầy để đồ án tốt nghiệp em hồn thiện Đà Nẵng, ngày 18 tháng 12 năm 2019 Sinh viên thực Nguyễn Thị Song Mơ i CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả Nguyễn Thị Song Mơ ii MỤC LỤC TÓM TẮT NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN i CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan mật nhân 1.1.1 Giới thiệu chung mật nhân 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Thành phần hóa học mật nhân 1.1.4 Tác dụng dược lý mật nhân 1.2 Tổng quan phương pháp trích ly 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 u cầu dung mơi sử dụng để trích ly công nghệ thực phẩm 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly 10 1.2.4 Các phương pháp chiết mật nhân 11 1.3 Tổng quan thực phẩm bảo vệ sức khỏe 12 1.3.1 Khái niệm 12 iii 1.3.2 Lợi ích 12 1.3.3 Yêu cầu 13 1.3.4 Một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe mật nhân thị trường 14 1.4 Tổng quan phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 16 1.4.1 Giới thiệu 16 1.4.2 Nguyên tắc trình tách sắc ký 16 1.4.3.Các phận hệ thống HPLC 17 1.4.4 Phân tích định tính định lượng HPLC 19 1.5 Tổng quan nghiên cứu nước 20 1.5.1 Các nghiên cứu nước 20 1.5.2 Các nghiên cứu nước 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.1 Rễ mật nhân 24 2.1.2 Nguyên liệu sản xuất trà thảo mộc 25 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 25 2.2.1 Hóa chất 25 2.2.2 Dụng cụ 25 2.2.3 Thiết bị 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng nhiệt độ chiết, thời gian chiết tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến trình chiết rễ mật nhân 26 2.3.2 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết mật nhân 29 2.3.3 Phương pháp sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 32 2.3.4 Phương pháp khảo sát thời gian bảo quản 34 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết rễ mật nhân 36 3.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết rễ mật nhân 36 iv 3.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến trình chiết rễ mật nhân 37 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian đến trình chiết rễ mật nhân 38 3.2 Sản xuất cao mật nhân xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm 39 3.2.1 Đề xuất quy trình sản xuất 40 3.2.2 Kết xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm cao mật nhân 41 3.2.3 Kết kiểm tra chất lượng sản phẩm cao mật nhân 44 3.2.4 Bao bì nhãn dán 44 3.2.5 Theo dõi thời gian bảo quản sản phẩm cao mật nhân 45 3.3 Ứng dụng sản xuất trà thảo mộc mật nhân làm sản phẩm bảo vệ sức khỏe 46 3.3.1 Đề xuất quy trình sản xuất trà thảo mộc mật nhân 47 3.3.2 Xác định hàm lượng cao chiết bổ sung 49 3.3.3 Kết đánh giá cảm quan mức độ chấp nhận sản phẩm Trà thảo mộc mật nhân 50 3.3.4 Kết kiểm tra chất lượng sản phẩm trà thảo mộc mật nhân 51 3.3.5 Theo dõi thời gian bảo quản 51 3.3.6 Bao bì nhãn dán 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học mật nhân Bảng 2.1 Thành phần hóa học rễ mật nhân huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai 24 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố nhiệt độ 27 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 28 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố thời gian chiết 28 Bảng 3.1 Tiêu chuẩn sở sản phẩm cao mật nhân 42 Bảng 3.2 Kết định tính số hợp chất thiên nhiên cao mật nhân 42 Bảng 3.3 Kết kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật cao mật nhân 43 Bảng 3.4 Kết kiểm tra chất lượng mẫu trà thảo mộc mật nhân 44 Bảng 3.5 Kết theo dõi tiêu vi sinh sản phẩm cao mật nhân 45 Bảng 3.6 Bảng kết đánh giá cảm quan 50 Bảng 3.7 Kết kiểm tra chất lượng mẫu trà thảo mộc mật nhân 51 Bảng 3.8 Kết theo dõi tiêu vi sinh mẫu trà thảo mộc mật nhân 52 vi Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe [49] Trang web: https://nhathuocsuckhoe.com/testoboss-thao-duoc-tang-cuong-sinhly-nam-60-vien (truy cập ngày 04/09/2019) [50] Trang web: https://hadariki.com/san-pham/hadariki-tongkat-ali/ (truy cập ngày 04/09/2019) [51] Nguyễn Đình Lâm, Chuyên đề sắc ký (Cở sở lý thuyết ứng dụng) Đại học Bách Khoa Đà Nẵng [52] Phạm Luận, Phương pháp tách sắc ký chiết tách Nhà xuất Bách khoa Hà Nội, 2014 [53] Angelika, Gratzfeld-Hüsgen, and Rainer Schuster, HPLC for Food Analysis Germany: Agilent Technologies Company, 2001 [54] Đặng Minh Nhật, Hóa phân tích thực phẩm Đà Nẵng: Bách khoa Đà Nẵng, 2018 [55] Morita Hiroshi, Kishi Etsuko, Takeya Koichi, Itokawa Hideji, and Tanaka Osamu, “Quassinoids từ Rễ Eurycoma longifolia,” Chem Lett., vol 19, no 5, pp 749–752, 1990 [56] Kit L Chan, Melanie J O’Neill, J David Phillipson, and David C Warhurst, “Plants as Sources of Antimalarial Drugs Part 31 Eurycoma longifolia,” Planta Med, vol 52, no 2, pp 105–107, 1986 [57] Lee Suan Chua et al., “LC-MS/MS-based metabolites of Eurycoma longifolia (Tongkat Ali) in Malaysia (Perak and Pahang),” J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci., vol 879, no 32, pp 3909–3919, 2011 [58] SeonJu Park, Van Minh Bui, Nguyen Xuan Nhiem, and Phan Van Kiem, “Five new quassinoids and cytotoxic constituents from the roots of Eurycoma longifolia,” Bioorg Med Chem Lett., vol 24, no 16, pp 3835–3840, 2014 [59] D D Kitts and C Hu, “Efficacy and safety of Eurycoma longifolia water extract plus multivitamins on quality of life, mood and stress: a randomized placebocontrolled and parallel study,” Food Nutr Res., vol 62, 2018 [60] D Balan, Kit‐Lam Chan, and D Murugan, “Antiadipogenic effects of a standardized quassinoids‐enriched fraction and eurycomanone from Eurycoma longifolia,” Phyther Res., vol 32, no 7, 2018 SVTH: Nguyễn Thị Song Mơ GVHD: Trương Thị Minh Hạnh Võ Khánh Hà 61 Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe [61] Shawn M.Talbott, “Human Performance and Sports Applications of Tongkat Ali (Eurycoma longifolia),” Nutr Enhanc Sport Perform., vol 63, pp 729–734, 2019 [62] A George, K Zandi, J Biggins, S Chinnappan, P Hassandarvish, and A Yusof, “Antiviral activity of a standardized root water extract of eurycoma longifolia (Physta®) against dengue virus,” Trop Biomed., vol 36, no 2, pp 412–421, 2019 [63] Lê Văn Thới and Nguyễn Ngọc Sương, “The structure of Eurycomalatone,” J Chem Commun., pp 821–822, 1969 [64] Lê Trần Đức, Cây thuốc Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, 1997 [65] Trần Anh Tuấn, Trần Thị Thu Hương, Trần Hồng Quang, and Phan Văn Kiệm, “Nghiên cứu thành phần hóa học mật nhân Eurycoma Longifloria,” Tạp chí dược học số 378 năm 47, 2007 [66] Trang web: https://thuvienphapluat.vn/van-ban/Linh-vuc-khac/Luat-Tieuchuan-va-quy-chuan-ky-thuat-2006-68-2006-QH11-12979.aspx(truy cập ngày 20/09/2019) [67] Trang web: https://duocdienvietnam.com/ (truy cập ngày 20/09/2019) [68] Võ Thị Kiều Ngân, Nguyễn Đức Độ, Trần Hồng Đức, Nguyễn Thanh Hoàng and Nguyễn Thị Ngọc Mai, “Khảo sát hàm lượng phenolic tổng, flavonoid tổng, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính kháng kh̉n cao chiết ethanol methanol thân rễ Cỏ Tranh (Imperata cylindrica),” Can Tho Univ J Sci., vol 52, p 16, 2017 [69] Huỳnh Anh Duy and Nguyễn Thị Tuyết, “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng kháng viêm in vitro khế (Averrhoa carambola L.),” Can Tho Univ J Sci., vol 54(7), p 72, 2018 [70] Đặng Xuân Cường, Vũ Ngọc Bội, and Trần Khắc Trí Nhân, “Thành phần lồi hoạt chất sinh học hải miên vùng biển nam trung bộ, Việt Nam,” pp 17– 25, 2018 [71] Phan Kim Định and Đái Thị Xuân Trang, “Khảo sát khả kháng oxy hóa kháng tế bào ung thư gan HepG2 Trang To (Ixora duffii),” TạP Chí SVTH: Nguyễn Thị Song Mơ GVHD: Trương Thị Minh Hạnh Võ Khánh Hà 62 Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe PháT TriểN Khoa HọC Công Nghê, vol 1, no 6, pp 13–22, 2017 [72] Phan Van Cu and Nguyen Thi Thu Huong, “Nghiên cứu chiết tách định lượng sterols từ diếp cá (Houttuynia cordata thunb) tỉnh thừa thiên huế phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao,” Tap Chi Khoa Hoc, Dai Hoc Hue, vol 47A, no 5, pp 17–24, 2012 [73] S B Ismail, W M Z Wan Mohammad, A George, N H Nik Hussain, Z M Musthapa Kamal, and E Liske, “Randomized clinical trial on the use of PHYSTA freeze-dried water extract of Eurycoma longifolia for the improvement of quality of life and sexual well-being in men,” Evidence-based Complement Altern Med., vol 2012, 2012 [74] S M Talbott, J A Talbott, A George, and M Pugh, “Effect of Tongkat Ali on stress hormones and psychological mood state in moderately stressed,” J Int Soc Sport Nutr, vol 19, 2013 [75] Farouk AE and Benafri A, “Antibacterial activity of Eurycoma Longifolia Jack,” Saudi Med J, vol 28, no 9, pp 1422–1424, 2007 [76] R Łos, K Skalicka-Wozniak, J Widelski, A Malm, and K Głowniak, “Antimicrobial activity of Eurycoma longifolia and Momordica charantia,” Planta Med, vol 74, 2008 [77] Mardawani Mohamad, Mohamad Wijayanuddin Ali, Adnan Ripin, and Arshad Ahmad, “Effect of extraction process parameters on the yield of bioactive compounds from the roots of eurycoma longifolia,” J Teknol (Sciences Eng., vol 60, pp 51–57, 2013 [78] C P Varghese, C Ambrose, S C Jin, Y J Lim, and T Keisaban, “Antioxidant and Anti-inflammatory Activity of Eurycoma Longifolia Jack, A Traditional Medicinal Plant in Malaysia,” Int J Pharm Sci Nanotech, vol 5, no 4, pp 1875– 1878, 2013 [79] Yuthana Phimolsiripol and Panuwat Suppakul, “Techniques in Shelf Life Evaluation of Food Product,” Ref Modul Food Sci First Ed Elsevier, pp 1–8, 2016 [80] Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa thức uống pha SVTH: Nguyễn Thị Song Mơ GVHD: Trương Thị Minh Hạnh Võ Khánh Hà 63 Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe chế tập TP Hồ Chí Minh: Nhà xuất Đại học Quốc gia, 2010 [81] Phan Quốc Kinh, Giáo trình hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Hà Nội: Giáo dục Việt Nam, 2011 [82] M Alothman, R Bhat, and A A Karim, “Effects of radiation processing on phytochemicals and antioxidants in plant produce,” Trends Food Sci Technol, vol 5, pp 201–212, 2009 [83] A B Aliyu, A M Musa, M S Sallau, and A O Oyewale, “, Proximate composition, mineral elements and anti-nutritional factors of Anisopus mannii N.E Br (Asclepiadaceae),” Trends Appl Sci Res, vol 4, pp 68–71, 2009 [84] Ping-Chung Kuo, “Cytotoxic and Antimalarial β-Carboline Alkaloids from the Roots of Eurycoma longifolia,” J Nat Prod, vol 66, no 10, pp 1324–1327, 2003 [85] Pham Bich Ngoc, Pham Thanh Binh, Nguyen Hai Dang, Tran Thu Trang, Hoang Ha Chu, and Chau Van Minh, “A new anti-inflammatory β-carboline alkaloid from the hairy-root cultures of Eurycoma longifolia,” Nat Prod Res., vol 30, no 12, pp 1360–1365, 2016 [86] A Oei–Koch and L Kraus, “lnhaltsstoffe von Eurycoma longifolia,” Planta Med., vol 5, 1978 [87] Trang web: http://viendinhduong.vn/vi/tin-tuc/nu-voi-voi-suc-khoe-con-nguoinghien-cuu-va-ung-dung.html (truy cập ngày 12/10/2019) [88] Nguyen Thi Dung, Vivek K.Bajpai, Jung In Yoon, and Sun Chul Kang, “Antiinflammatory effects of essential oil isolated from the buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry,” Food Chem Toxicol., vol 47, no 2, pp 449–453, 2009 [89] Vivek K.Bajpai, Nguyen Thi Dung, Hwa-Jin Suh, and Sun Chul Kang, “Antibacterial Activity of Essential Oil and Extracts of Cleistocalyx operculatus Buds Against the Bacteria of Xanthomonas spp,” J Am Oil Chem Soc., vol 87, no 11, pp 1341–1349, 2010 [90] Truong Tuyet Mai, Keiko Yamaguchi, Mizuho Yamanaka, Nguyen Thi Lam, Yuzuru Otsuka, and Nguyen Van Chuyen, “Protective and Anticataract Effects SVTH: Nguyễn Thị Song Mơ GVHD: Trương Thị Minh Hạnh Võ Khánh Hà 64 Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe of the Aqueous Extract of Cleistocalyx operculatus Flower Buds on β-Cells of Streptozotocin-Diabetic Rats,” J Agric Food Chem., vol 58, no 7, pp 4162– 4168, 2010 [91] Huynh Nhu Tuan, Bui Hoang Minh, Tran Phuong Thao, and J H Lee, “The Effects of 2’,4’-Dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’- dimethylchalcone from Cleistocalyx operculatus Buds on Human Pancreatic Cancer Cell Lines,” Mol Artic., vol 24, no 2538, pp 1–11, 2019 [92] G R Smitha and K Umesha, “Vegetative propagation of stevia [Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl.] through stem cuttings,” J Trop Agric., vol 50, pp 72–75, 2011 [93] Trang web: https://www.dkn.tv/suc-khoe/8-cong-dung-ky-dieu-cua-qua-la- han.html (truy cập ngày 12/10/2019) [94] Phạm Thị Minh Hải et al., “Xây dựng quy trình định lượng coixol cam thảo nam (Scopararia dulcis L.) sắc ký lỏng hiệu cao,” Tạp chí Dược học, vol 59, no 6, 2019 [95] Truong Tuyet Mai, Keiko Yamaguchi, Mizuho Yamanaka, Nguyen Thi Lam, Yuzuru Otsuka, and Nguyen Van Chuyen, “Protective and anticataract effects of the aqueous extract of cleistocalyx operculatus flower buds on β-Cells of streptozotocin-diabetic rats,” J Agric Food Chem., vol 58, no 7, pp 4162– 4168, 2010 [96] Truong Tuyet Mai and Nguyen Van Chuyen, “Anti-hyperglycemic activity of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry,” Biosci Biotechnol Biochem., vol 71, no 1, pp 69–76, 2007 [97] Nguyen Kim Dong and Lâm Thị Kim Ngân, “Nghiên cứu chiết xuất tinh chế stevioside rebaudioside a từ cỏ (Stevia rebaudiana) làm chất tạo thực phẩm dược phẩm,” Hue Univ J Sci., vol 117, no 3, 2016 [98] Hoàng Văn Tuấn, Nguyễn Thị Hiền, and Lê Kiều Oanh, “Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến hàm lượng mogroside thu từ la hán,” Tạp chí sinh học, vol 34, no 4, pp 500–504, 2012 [99] M Latha and L Pari, “Effect of an aqueous extract of Scoparia dulcis on blood SVTH: Nguyễn Thị Song Mơ GVHD: Trương Thị Minh Hạnh Võ Khánh Hà 65 Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe glucose, plasma insulin and some polyol pathway enzymes in experimental rat diabetes,” Brazilian J Med Biol Res., vol 37, no 4, pp 577–586, 2004 [100] Phan Thị Kim Trương, Nghiên cứu sản xuất nước uống đóng chai từ hoa Atiso – Lạc tiên tây 2012 [101] Trương Thị Minh Hạnh, Bài giảng thiết bị thực phẩm Đại học Bách Khoa Đà Nẵng [102] Hitoshi Kinugasa and Tadakazu Takeo, “Agricultural and Biological Chemistry Deterioration Mechanism for Tea Infusion Aroma by Retort Pasteurization Deterioration Mechanism for Tea Infusion Aroma by Retort Pasteurization,” Agric Biol Chem Agric Bioi Chem, vol 5410, no 5410, pp 2537–2542, 1990 SVTH: Nguyễn Thị Song Mơ GVHD: Trương Thị Minh Hạnh Võ Khánh Hà 66 PHỤ LỤC 1 Xác định hàm lượng 9,10-dimethoxycanthin-6-one ❖ Nguyên tắc Hoạt chất EL4 chiết dung môi nước lọc bơm vào hệ thống HPLC, phát detector DAD ❖ Tiến hành Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L: Cân xác khoảng 10 mg chất ch̉n EL4 cân phân tích có độ xác 0,1 mg vào bình định mức loại 10 mL Hòa tan định mức đến vạch Methanol - Các dung dịch chuẩn làm việc: Từ dung dịch chuẩn gốc EL4-1000 mg/L pha dãy chuẩn làm việc nồng độ 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 mg/mL Methanol Chuẩn bị mẫu Cân khoảng 0,2 g cao lỏng rễ mật nhân vào bình định mức 100 ml, định mức tới vạch nước cất Tiến hành phân tích thiết bị sắc ký lỏng cao (HPLC) Điều kiện sắc ký: Điều kiện thiết bị HPLC-DAD - Cột sắc ký: C8 (150 mm, 250 mm x 4,6 mm x μm) tiền cột C8 (20 mm x 3,9 mm x µm) - Nhiệt độ buồng cột: 40oC - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút - Thể tích tiêm 10 µl - Pha động: Nước cất : Methanol theo chương trình rửa giải Isocratic Thời gian (phút) Kênh A (Nước cất) Kênh B (MeOH) 30 70 15 30 70 - Detector DAD cài đặt bước sóng Tên chất Bước sóng (nm) 232 9,10-dimethoxycanthin-6-one 300 365 (λmax) 375 Quy trình đo mẫu HPLC - DAD Phụ lục Chuẩn bị dãy chuẩn làm việc mẫu cần đo (Mẫu phải lọc qua màng lọc 0,45 µm trước tiêm vào máy) Tiến hành đo dãy chuẩn làm việc từ nồng độ thấp đến cao Ghi nhận tín hiệu kiểm tra độ tuyến tính đường chuẩn Tiến hành đo mẫu (Nếu tín hiệu đo mẫu nằm ngồi khoảng tuyến tính đường ch̉n phải tiến hành pha lỗng làm giàu mẫu để tín hiệu đo mẫu nằm lọt khoảng tuyến tính) Xây dựng đường tương quan tuyến tính (đường chuẩn) diện tích peak nồng độ chất, kiểm tra hệ số tuyến tính R2 ≥ 0,99 Sử dụng đường ch̉n để tính tốn nồng độ đo dung dịch chiết mẫu Xử lý số liệu, tính tốn nồng độ dịch chiết Phương pháp xác định hàm lượng cắn không tan nước (DĐVN IV) ❖ Nguyên tắc Mẫu hòa tan nước cất, lọc, ly tâm lấy phần rắn Sau sấy nhiệt độ 100 105 C đến khối lượng khơng đổi cân ❖ Tiến hành Hịa tan 1g cao mật nhân 150 mL nước cất, để lắng vòng 24 Tiến hành hút phần dịch lọc bên đến gần cạn Cho tiếp vào 150 mL nước cất để lắng vòng – giờ, tiếp tục hút phần dịch lọc bên trên, lặp lại tương tự thí nghiệm dịch lọc Tiến hành ly tâm để thu phần cắn, sấy khô cắn 100 – 105 oC đến khối lượng không đổi Phương pháp xác định hàm lượng ẩm (DĐVN IV) ❖ Nguyên tắc Mất khối lượng làm khô giảm khối lượng mẫu thử biểu thị phần trăm (khối lượng/ khối lượng) làm khô điều kiện xác định ❖ Tiến hành Dùng dụng cụ sấy thủy tinh rộng miệng, đáy có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khơ bì tủ sấy nhiệt độ 103 oC đến 105 oC thời gian 30 phút cân để xác định khối lượng bì Cân vào bì 5g mẫu thử xác đến 0,0001g Tiến hành Phụ lục làm khô trong tủ sấy nhiệt độ 103 - 105oC đến khối lượng không đổi Sau sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phịng, bình hút ẩm có silicagel cân Sự chênh lệch khối lượng sau lần sấy không 0,5 mg Phương pháp xác định tro toàn phần (DĐVN IV) ❖ Nguyên tắc Nung phần mẫu thử 550 °C ± 25 °C đạt khối lượng gần không đổi ❖ Tiến hành Dùng chén sứ chén platin nung tới đỏ 30 phút, để nguội bình hút ẩm sau cân xác định khối lượng cốc Cân khoảng 1g mẫu cao mật nhân cho vào chén nung, sấy 100oC đến 105oC đem nung lò nung 450 đến 550 oC ± 25 oC Sau lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội bình hút ẩm cân Trong q trình thao tác khơng để tạo thành lửa Nếu sau nung lâu mà chưa loại hết carbon tro dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro lại nung cắn giấy lọc chén nung Thu dịch lọc vào tro chén, làm bốc cẩn thận tới khô nung đến khối lượng không đổi Phương pháp đo pH (DĐVN IV) ❖ Nguyên tắc pH mẫu đo máy đo pH để bàn ❖ Tiến hành Tiến hành: Lấy 1g cao mật nhân hòa tan vào 100 mL nước cất tiến hành đo pH máy đo pH Thao tác máy đo pH sau: Đầu tiên, hiệu chuẩn máy đo pH dung dịch chuẩn có giá trị pH Rửa điện cực nước cất, dùng giấy mềm thấm khô đầu điện cực Cho điện cực vào dung dịch cần đo, bấm nút ON/OFF để bắt đầu đo chờ cho hình hiển thị giá trị pH ổn định ghi nhận kết Sau nhấn nút ON/OFF lần để tắt máy Lấy điện cực khỏi dung dịch cần đo, rửa điện cực nƣớc cất, thấm khô giấy mềm Phương pháp đo tỷ trọng (DĐVN IV) ❖ Nguyên tắc Dùng picnomet để đo tỷ trọng tương đối mẫu nhiệt độ 200C ❖ Tiến hành Cân xác picnomet rỗng, khơ Đổ vào picnomet mẫu thử điều chỉnh nhiệt độ thấp 20oC, ý khơng để có bọt khí Giữ picnomet nhiệt độ 20oC khoảng 30 Dùng băng giấy lọc để thấm hết chất lỏng thừa vạch mức, làm khơ mặt ngồi picnomet, cân tính khối lượng chất lỏng chứa picnomet Tiếp đổ mẫu thử đi, rửa picnomet, làm khô cách tráng ethanol tráng aceton, thổi khơng khí nén khơng khí nóng đuổi hết aceton, sau xác đinh khối lượng nước cất chứa picnomet nhiệt độ 20°C làm với mẫu thử Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng Phụ lục ❖ Nguyên tắc Phương pháp ASS dựa nguyên tắc tất nguyên tố trạng thái nguyên tử hấp thụ bước sóng định, cường độ hấp thụ thể nồng độ nguyên tố mẫu Khi chiếu chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám nguyên tử nguyên tử tự hấp thụ xạ có bước sóng tương ứng với tia xạ mà phát trình phát xạ Phương pháp áp dụng với số nguyên tố có khả nguyên tử hóa Hg, As, Cd, Pb, ❖ Tiến hành Mẫu cao mật nhân sau tro hóa hòa tan dung dịch HNO3 10% định mức nước cất đến 25 mL Lấy dung dịch định mức tiến hành xác định hàm lượng kim loại nặng thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Phương pháp định tính alcaloid [68][69][70] ❖ Nguyên tắc Định tính alkaloid thuốc thử Wagner với dấu hiệu nhận biết có xuất kết tủa màu nâu đỏ ❖ Tiến hành Cân 5g cao mật nhân ngâm dung dịch hỗn hợp gồm (chloroform : ethanol 95o : NH4OH) đậm đặc theo tỉ lệ (8: 8: 1), mơi trường phải có tính base Ngâm nguội 24 giờ, để nhiệt độ phòng lắc trộn Sau ngâm, đem lọc đuổi dung môi đến cạn, thu cặn Hòa tan phần cặn dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc, lấy dịch lọc để thử với thuốc thử Wagner Quan sát có xuất kết tủa màu nâu đỏ có alcaloid Phương pháp định tính polyphenol [71][68] ❖ Nguyên tắc Polyphenol có hoạt tính khử sắt (III) nên sử dụng thuốc thử FeCl3 để định tính polyphenol với dấu hiệu nhận biết dung dịch chuyển sang màu xanh thẫm ❖ Tiến hành Ngâm 2g cao mật nhân 10mL methanol ethanol, lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 1% Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh thẫm có polyphenol 10 Phương pháp định tính steroid [69][70][72] ❖ Nguyên tắc Sử dụng phản ứng Libermann - Bourchard phản ứng Salkowski để định tính steroid ❖ Tiến hành - Phản ứng Libermann-Bourchard: Cho vào ống nghiệm 1mL anhydrit axetic, 1mL chloroform, làm lạnh ống nghiệm thêm vài giọt H2SO4 đậm đặc, sau cho dịch lọc ngâm chloroform, sung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam đỏ, màu bền khơng đổi có sterol Phụ lục - Phản ứng Salkowski: Ngâm 2g cao mật nhân chloroform Lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, phản ứng dương tính dung dịch xuất vòng đỏ màu nâu hai lớp 11 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật ❖ Nguyên tắc Cấy lượng mẫu thử xác định với lượng xác định huyền phù ban đầu lên đĩa kép chứa môi trường trypton-mật-glucuronid (TBX) chủng E coli Các đĩa ủ 44 oC ± oC 24 kiểm tra để phát có mặt khuẩn lạc đặc trưng coi E coli Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) E coli gam mililit mẫu Sau so sánh với số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc đĩa khơng có mẫu thử ❖ Tiến hành Từ chủng E coli working hút 0.1ml cấy vào 10 ml BHI ni 37 oC/ 24 - Q trình pha lỗng: dùng pipet, micro pipet vơ trùng lấy ml dung dịch từ ống BHI (d0) cho vào ống nghiệm chứa ml dịch pha loãng Salt peptone water (SPW) chuẩn bị sẵn Trộn kỹ máy lắc ống nghiệm để có dịch pha lỗng mẫu có nồng độ pha lỗng 10-1 Q trình lặp lại liên tục để có dịch mẫu có nồng độ pha loãng Đĩa (D0): - Dùng pipet hay micropipet vơ trùng cho vào đĩa có thạch TBX agar 0,1 ml huyền phù pha loãng nồng độ 10-1 cấy trang lên đĩa môi trường - Sử dụng dụng cụ dàn mẫu dàn chất cấy cẩn thận nhanh tốt lên mặt đĩa thạch cố gắng không chạm vào mép đĩa Đĩa (D1): làm tương tự đĩa D0 hút 0,2 ml dung dịch E coli nồng độ 10-1, trang đến khơ hút 0,2 ml mật nhân trang lên Đĩa (D2): làm tương tự đĩa D0 hút 0,1 ml dung dịch E coli nồng độ 10-1, trang đến khô hút 0,9 ml mật nhân trang lên Đĩa (D3): Mẫu đối chứng dương: làm tương tự đĩa D0 hút 0,2 ml dung dịch E coli nồng độ 10-1, trang đến khơ hút 0,2 ml cồn 70o trang lên Tiến hành nuôi 44 oC 24 Phụ lục PHỤ LỤC Phiếu hướng dẫn đánh giá cảm quan sản phẩm trà thảo mộc mật nhân PHIẾU HƯỚNG DẪN Phép thử cho điểm thị hiếu Tên sản phẩm: Trà thảo mộc mật nhân Bạn nhận mẫu trà thảo mộc mật nhân Hãy thử nếm giá đánh giá mức độ ưa thích mẫu thông qua điểm số tương ứng thang điểm thị hiếu (thang điểm 9) □ - khơng thích □ - tương đối thích □ - khơng thích □ - thích □ - khơng thích □ - thích □ - tương đối khơng thích □ - thích □ - khơng thích khơng ghét Ghi nhận kết bạn vào phiếu trả lời Lưu ý: - Bạn vị nước lọc trước thử mẫu bạn cảm thấy cần thiết - Khơng trao đổi q trình đánh giá Nếu có khơng hiểu hỏi trực tiếp thực nghiệm viên PHIẾU TRẢ LỜI Phép thử cho điểm thị hiếu Tên sản phẩm: Trà thảo mộc mật nhân Họ tên: …………………………… Ngày thử: Mức độ ưa thích bạn mẫu: Chỉ tiêu Điểm Màu Mùi Vị Hậu vị Nhận xét: Cảm ơn bạn tham gia! Phụ lục 2 Số liệu xây dựng tiêu chuẩn sở Bảng Kết khảo sát cắn không tan nước cao mật nhân STT m1 (g) 1,0167 1,0275 1,0221 m2 (g) 0,0117 0,0159 0,0138 C (%) 1,15 1,22 1,19 Bảng Kết khảo sát hàm lượng cao mật nhân STT m1 (g) 2,0660 3,1010 2,5835 m2 (g) 0,8529 1,2783 1,0656 W (%) 58,72 58,78 58,77 Bảng Kết khảo sát tro toàn phần cao mật nhân STT m0 (g) 38,4289 37,5650 37,9970 m1 (g) 1,0605 1,1626 1,1116 m2 (g) 38,4739 37,6138 38,0439 T (%) 4,16 4,20 4,18 Bảng Kết khảo sát độ pH dung dịch cao mật nhân Lần đo pH 5,19 5,18 5,20 Bảng Kết đo tỷ trọng cao mật nhân STT m1 (g) 12,5530 12,5529 12,5530 𝑑 20 20 1,2138 1,2138 1,2138 m2 (g) 10,3416 10,3416 10,3416 Bảng Kết hàm lượng EL4 STT Cm (mg/l) 0,79 0,77 0,78 K 500 500 500 X (mg/kg) 395 385 390 Bảng điểm đánh giá cám quan Bảng Điểm đánh giá cảm quan STT Phụ lục Họ tên Lê Hữu Thắng Nguyễn Văn Tiến Đỗ Thị Kiều Duyên Đoàn Thị Quỳnh Lưu Thị Hậu Lương Màu 8 6 Mùi 6 Vị 7 Hậu vị 7 7 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 Phụ lục Lê Thị Lộc Đinh Thị Như Mai Phan Thị Diệu Thương Lê Quang Hoàng Kiệt Nguyễn Văn Long Trần Thị Phúc Anh Bùi Trần Thanh Nguyệt Nguyễn Phạm Thị Bích Trần Hồng Nhật Tiên Hồng Anh Nguyễn Thị Kim Loan Nguyễn Thị Giang Trần Hoàng Long Hồ Thị Minh Hương Đặng Thị Minh Nguyễn Thị Ái Như Nguyễn Thị Hường Vũ Thị Mỹ Linh Trần Thị My Dương Võ Hoàng Hà Võ Thùy Trinh Đặng Hồng Quân Nguyễn Thị Hồng Vân Trần Công Hiếu Lê Tuấn Vủ Trần Thị Thau Huỳnh Hùng Nguyễn Thị Huyền Nhi Tuyến Hà Kiều Anh Nguyễn Thị Diễm My Lê Nguyệt Ánh Lê Thị Hà Trang Đinh Thị Bích Phượng Trần Viết Mân Nguyễn Thị Liên Võ Trúc Huỳnh Trần Văn Trọng Lê Thị Thùy Trang Nguyễn Thị Hoài Phan Thế Toàn Nguyễn Xuân Toàn Lê Thị Hoài Trương Thị Phương Trang Hồ Thị Thủy Tiên Hồ Thị Diệu Oanh Nguyễn Thị Thanh Nguyễn Thị Xuyến 8 6 7 9 6 9 7 7 8 7 8 7 5 8 5 5 7 7 7 8 7 8 8 8 7 6 8 5 5 6 7 8 7 6 6 5 8 7 7 4 5 6 7 7 6 7 5 7 8 6 54 55 56 57 58 59 60 Lê Thị Thấm Nguyễn Đức Tiên Nguyễn Thị Vinh Nguyễn Viết Tài Nguyễn Đình Hồng Lê Thị Thảo Hồ Xuân Tuyến 6 7 7 8 6 7 Phương trình đường ch̉n sắc kí đồ để xác định hàm lượng EL4 HPLC Hình Phương trình đường ch̉n mối quan hệ diện tích pic nồng độ EL4 ch̉n Hình Sắc kí đồ mẫu cao mật nhân đo HPLC Phụ lục ... Khánh Hà Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho việc nghiên cứu ứng dụng mật nhân Vậy... Khánh Hà Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe thấy mật nhân có tác dụng bảo vệ thần... Hà 11 Nghiên cứu điều kiện chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dung môi nước phương pháp chưng ninh Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe chưng ninh hồi lưu phương pháp chiết cho