Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm nâng cao sản lượng syringomycin e

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU MỤC TIÊU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU PHẦN TỔNG QUAN I.1 Tổng quan syringomycin E I.2 Cấu trúc SRE I.3 Tính chất SRE I.4 Cơ chế tác động SRE tới vi sinh vật gây bệnh I.5 Cơ chế sinh tổng hợp SRE I.6 Các điều kiện nuôi cấy chủng P.syringae cho sinh tổng hợp SRE I.7 Một số phương pháp thu hồi SRE I.8 Nguồn thu nhận SRE 10 I.9 Đặc điểm chủng vi sinh vật sinh Syringomycin E 11 I.9.1 Đặc điểm hình thái 11 I.9.2 Đặc điểm nuôi cấy 12 I.9.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 13 I.10 Ứng dụng SRE 14 II Đột biến sinh học 15 II.1 Khái niệm đột biến sinh học phân loại đột biến 15 Hình 1.4 ADN biến đổi sau bị tia tử ngoại chiếu vào 16 II.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu gây chết tần số phát sinh đột biến 17 II.3 Cơ chế đột biến tia cực tím 17 II.4 Hệ thống sửa chữa bảo vệ ADN 20 II.5 Phát đột biến nấm vi khuẩn 23 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1.Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2.Hóa chất 25 Đỗ Thị Ngọc Huyền i Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.1.3.Thiết bị dụng cụ 25 2.1.4.Môi trường 26 2.2.Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1.Đột biến tia UV 26 2.2.2.Khảo sát tuyển chọn thể đột biến có khả sinh SRE cao 27 2.2.3.Phương pháp cấy trực tiếp 27 2.2.4.Phương pháp khuếch tán thạch 27 2.2.5.Xây dựng đường chuẩn cho xác định hoạt tính SRE 28 2.2.6.Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng P.syringae PS 120 thể đột biến P.syringae PS 120-15 29 2.2.7.Động thái trình sinh tổng hợp SRE từ P.syringae PS 120 thể đột biến P.syringae PS 120-15 29 2.2.8.Kiểm tra tính ổn định thể đột biến 30 2.2.9.Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí 30 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1.Gây đột biến chủng P.syringae PS 120 tia UV 31 3.2.Sàng lọc sơ thể đột biến từ chủng P.syringae PS 120 32 3.3.Chọn lọc thể đột biến có khả sinh SRE cao 33 3.4.Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng P syringae PS 120 thể đột biến P syringae PS 120-15 35 3.5.Phân tích trình tự ARN 16S chủng đột biến PS 120-15 36 3.6 Động thái trình sinh tổng hợp SRE P.syringae PS 120 thể đột biến P.syringae PS 120-15 42 3.7.Kiểm tra tính ổn định chủng đột biến 43 PHẦN KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Đỗ Thị Ngọc Huyền ii Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội CHỮ VIẾT TẮT g/l : gam/lít L/m : litter/minute U/ml : Unit/milliliter Da : Dalton µl : microliter FAO : Food and Agriculture organization (Tổ chức Nông lương giới ) kDa : kilodalton Đỗ Thị Ngọc Huyền iii Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Syringomycin E Hình 1.2 Khuẩn lạc P.syringae mơi trường King B phát quang ánh sáng tia cực tím bước sóng 365 nm 13 Hình 1.3 P.syringae kính hiển vi điện tử 14 Hình 1.4 ADN biến đổi sau bị tia tử ngoại chiếu vào 1616 Hình 1.5 Thymine dimer tạo ta tia UV 19 Hình 1.6 Cơ chế đột biến tia UV(Cytosine hình thành dimer giống nhau) 19 Hình 1.7 Cơ chế quang tái hoạt hóa sửa chữa ADN 211 Hình 1.8 Sửa chữa sai khác ADN tia UV gây 233 Hình 2.1 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan đường kính vịng kháng nấm G candidum đơn vị SRE khác 29 Hình 3.1 Mật độ tế bào vi khuẩn tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến tia UV 322 Hình 3.2 Kiểm tra hoạt tính SRE chủng gốc P syringae PS 120 (hình A) thể đột biến P syringae PS 120-15 (hình B) phương pháp khuyếch tán đĩa thạch 344 Hình 3.3: Hình ảnh ADN tổng số chủng vi khuẩnPS 120-15 gel agarose 1% (chạy lặp lại lần) 37 Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rARN chủng vi khuẩn PS 120-15 37 Hình 3.5: Sơ đồ phát sinh loài chủng PS 120-15 sử dụng công cụ BLAST NCBI 400 Đỗ Thị Ngọc Huyền iv Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót vi khuẩn sau xử lý đột biến tia UV 311 Bảng 3.2 Khả ức chế nấm G candidum thể đột biến 333 Bảng 3.3 Xác định hoạt tính SRE thể đột biến tuyển chọn 36 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng gốc 35 Bảng 3.5: Định lượng ADN tổng số 39 Bảng 3.6: Kết định danh sử dụng công cụ BLAST NCBI…………………….…39 Bảng 3.7: Sự sai khác sau giải trình tự 16S rARB chủng PS 120-15khi so sánh với chủng Pseudomonas syringae NBRC 14076 GenBank 41 Bảng 3.8 Khả sinh SRE P syringae PS 120 thể đột biến P syringae PS 12015 khoảng thời gian khác 422 Bảng 3.9 Khả sinh SRE chủng gốc P syringae PS 120 thể đột biến P syringae PS 120-15 qua hệ 43 Đỗ Thị Ngọc Huyền v Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, vấn đề bảo quản sản phẩm nông sản sau thu hoạch xã hội đặc biệt quan tâm Trái đáp ứng nguồn dinh dưỡng cao yêu cầu trái phải tươi ngon, đảm bảo chất lượng đáp ứng nhu cầu vệ sinh an tồn tiêu chí hàng đầu lĩnh vực bảo quản sau thu hoạch Trên thực tế, nơng sản q trình bảo quản thường bị số sinh vật gây hại, chủ yếu vi sinh vật côn trùng Hoạt động mạnh mẽ vi sinh vật gây tổn thất lớn cho nông sản giai đoạn sau thu hoạch, tổn thất nấm mốc chiếm phần đáng kể Theo công bố FAO, 25% đến 50% nơng sản tồn giới nhiễm độc tố Qua nghiên cứu cho thấy ngô, lạc cà phê thường nhiễm loại nấm mốc Aspergillus spp, Fusarium spp, Penicillium spp, Rhizopus spp, Aspergillus niger Ngoài việc gây tổn thất lượng cho nơng sản, nấm mốc cịn sinh độc tố đặc biệt nguy hiểm với người động vật kinh tế Trong đó, Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus lồi có khả sinh độc tố aflatoxin mạnh nhất, độc tố tích tụ gan người, động vật không bị phân hủy nhiệt độ cao Aspergillus ochraceus, A niger Penicillium viridicatumcó khả sinh độc tố ochratoxin Ngoài ra, số loại nấm Fusarium có khả sinh độc tố trichothecen fumonisin Hàm lượng aflatoxin nhiễm nhiều mẫu ngô, lạc cà phê vượt ngưỡng giới hạn cho phép tiêu chuẩn Việt Nam Quốc tế Ở nước ta sử dụng khoảng 200 loại thuốc trừ sâu, 83 loại thuốc trừ nấm, 52 loại thuốc trừ cỏ…Những hóa chất nằm danh mục cho phép sử dụng bảo quản nông sản nhóm pyvethroid, malathion, sumithion, DDVP, actellic 2D, cacbon dioxit, monocrotophos, cypermethrin Tuy nhiên, theo kiểm tra quan chức hóa chất thường sử dụng vượt lượng cho phép nhiều lần (http:// www hoahocngaynay.com) Việc sử dụng thuốc hóa học khơng hợp lý, sử dụng lâu dài kéo theo vấn đề như: ảnh hưởng tới sức khỏe người động vật, tăng khả hình thành tính kháng thuốc sâu Đỗ Thị Ngọc Huyền Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội bệnh, tiêu diệt hệ thiên địch, phá vỡ cân sinh học, gây hậu xấu tới môi trường Các nhà khoa học giới nỗ lực nghiên cứu để tạo giống chuyển gen để kháng bệnh, việc tìm kiếm cơng nghệ sản xuất chất sinh học khơng độc hại để phịng trừ nấm sinh độc tố trồng hạt nông sản phương pháp kiểm soát hàng đầu Các syringomycin (SR) gồm A1, E G, syringomycin E (SRE) nhóm nghiên cứu nhiều (Segre et al., 1989) SRE có khối lượng phân tử 1240 kDa SRE có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc nấm men gây bệnh thực vật Candida, Cryptococcus, Geotrichum candidum, Rhodotorula pilimance, Botrytis, Fusarium, Pythium ultimum, Rhizotonia, Greeneria uvicola, Asprgillus japonicas, Mucor sp., Trichophyton sp., Curvularia brachyspora, Nigrospora sphaerica, Penicillium thomii Penicillium sclerotionrum, SRE có khả diệt 95 – 99% nấm mốc Aspergillus (Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus) Fusarium (Fusarium moniliforme Fusarium oxysporum) nồng độ từ 1,9 đến 7,8 µg/ml ( De Lucca et al., 1999) Khả kháng nấm men SR tốt nấm mốc Tuy nhiên, chúng khả ức chế vi khuẩn (Sinden et al., 1971; Mekki, 2009) Nâng cao chất lượng SRE từ chủng Pseudomonas syringae yếu tố công nghệ quan trọng Yukie cộng (2009) gây đột biến với mục đích nâng cao khả sinh SRE tia UV U.S Patent số 5, 576, 298 nghiên cứu đột biến transposon từ chủng dại P syringae MSU 174 Nhiều nghiên cứu khác thông báo sinh SRE thay đổi chủng đột biến (Patent số WO 2012173942A2; WO 00/63240 A1) Do đó, tác nhân đột biến xem có tiềm việc cải thiện sản lượng SRE vi khuẩn P syringae Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm nâng cao sản lượng syringomycin E.” Đỗ Thị Ngọc Huyền Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC TIÊU Lựa chọn thể đột biến có khả sinh tổng hợp SRE với hoạt tính ≥ 40 U/ml NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu gây đột biến chủng P.syringae PS 120 tia UV - Lựa chọn thể đột biến có khả sinh tổng hợp SRE cao - Xác định hàm lượng SRE từ thể đột biến lựa chọn - Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng P.syringae PS 120 thể đột biến P.syringae PS 120-15 - Nghiên cứu động thái trình sinh trưởng chủng gốcP.syringae PS 120 thể đột biến P.syringae PS 120-15 - Nghiên cứu tính ổn định thể đột biến P syringae PS 120-15 Đỗ Thị Ngọc Huyền Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN TỔNG QUAN I.1 Tổng quan syringomycin E Syringomycin E (SRE) chất nghiên cứu nhiều tronghọ lipodepsipeptide sinh tổng hợp số chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas đặc biệt chủng Pseudomonas syringaepv.syringae Syringomycin E chứng minh đóng vai trị quan trọng tương tác vi khuẩn- thực vật khả làm tăng tính độc vi khuẩn thử nghiệm in vitro (N.S Iacobellis et al., 1992) Bên cạnh đó, SRE có đặc điểm bật khả diệt nấm, đặc tính phụ thuộc vào có mặt Cl đầu C cấu trúc protein SRE (I Grgurina et al., 1994) Tính chất sử dụng phương pháp diệt nấm biện pháp sinh học với chủng nấm Geotrichum candidum, Rhodotorula pilimance, Botrytis cinerea, Fusarium, Pythium ultimum, Rhizoctonia, Greeneria uvicola,Aspergillus japonicus, Mucor sp., Trichophyton sp., Curvularia brachyspora, Nigrospora sphaerica, Penicillium thomii Penicillium sclerotiorum lànhững loài thường gây thối hỏng sau thu hoạch Do SRE sinh tổng hợp vi khuẩn Pseudomonas tiết dịch ni Vì vậy, để tách chiết thu nhận kháng sinh SRE từ dịch lên men, nguyên tắc quan trọng dựa vào tính chất chất kháng sinh tạo thành sau lên men, gồm có: i) tính chất hóa học chất kháng sinh dạng chất bazơ yếu, axit yếu, chất trung hịa điện tích, dạng phân cực khơng phân cực; ii) tính chất vật lý kháng sinh gồm: tính tan kháng sinh, độ bền pH, độ bền nhiệt, độ bền loại dung mơi khác Từ tính chất kháng sinh để khảo sát áp dụng phương pháp thích hợp thu nhận kháng sinh với hiệu suất cao (Richard cộng 1998) I.2 Cấu trúc SRE Cấu trúc phân tử SRE lipodepsipeptide, tạo thành amino axit hydroxy axit béo chứa 12 nguyên tử C dạng amide (A Segreet al, 1989; N Fukuchi, 1992) Công thức phân tử SRE: C53H85ClN14O17 , khối lượng phân tử M= 1225,78 thể hình 1.1: Đỗ Thị Ngọc Huyền Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Syringomycin E Các syringomycin gồm A1, E G Trong đó, SRE nghiên cứu nhiều Cấu trúc SRE gồm acid béo mạch dài, không phân nhánh chín acid amin khép vịng, ưa nước, tích điện dương Trình tự acid amin SRE SerSer-Dab-Dab-Arg-Phe-Dhb-4(Cl)Thr-3(OH)Aspđược khép vịng nhóm βcacboxyl đầu cuối C với nhóm OH đầu cuối N nhờ trình acetyl hóa xúc tác acid 3-hydroxydecanoic Syringomycin A1 G khác với SRE acid béo 3-hydroxydecanoic Syringotoxin syringostatin liên quan đến lipodepsinonapeptides sản xuất chủng phân lậpP syringae từ cam, quýt tử đinh hương I.3 Tính chất SRE SRE tan nước tan cồn nồng độ thấp, không tan ether chloroform Điểm đẳng điện pH Hoạt tính kháng sinh SRE không bền dung dịch kiềm, đặc biệt pH bền HCl 1N, bền nhiệt độ cao, khơng bị ảnh hưởng tia cực tím SRE có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc nấm men Khả kháng nấm men SRE tốt nấm mốc Tuy nhiên, chúng khơng có khả ức chế vi khuẩn (Sinden et al., 1971; Mekki,2009) Đỗ Thị Ngọc Huyền Lớp: CNSH-1103 Viện Đại học Mở Hà Nội 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Đối chứng Mật độ tế bào 10 30 60 90 120 Tỷ lệ sống sót (%) Mật độ tế bào(cfu/ml) x 10000000 Khóa luận tốt nghiệp 180 Thời gian chiếu (giây) Tỷ lệ sống sót (%) Hình 3.1 Mật độ tế bào vi khuẩn tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến tia UV Tác động gây chết tia UV cao chứng tỏ ảnh hưởng lên hệ gen vi khuẩn lớn, chủng sống sót chủng có khả có biến đổi ADN Kết bảng 3.1 cho thấy tác động tia UV, số lượng vi khuẩn dịch ni giảm nhanh chóng theo thời gian Mật độ tế bào P SyringaePS 120đã giảm từ 6,82x107 cfu/ml mẫu không chiếu tia UV xuống 5,18 x107 cfu/ml sau tiếp xúc với tia UV 10 giây, tỷ lệ sống sót 76% Mật độ tế bào bắt đầu giảm nhanh tiếp xúc với tia UV 30 giây, tỷ lệ sống sót thời điểm 53,3% Tỷ lệ sống sót cịn 5,67% thời gian chiếu 90 giây 1% thời gian chiếu 180 giây Các khuẩn lạc lựa chọn khuẩn lạc có tỷ lệ sống sót từ 0,1-10% xác suất chủng bị đột biến xuất khoảng cao (Rafal and Hameed, 2009) 3.2 Sàng lọc sơ thể đột biến từ chủng P.syringae PS 120 Chúng lựa chọn 334 thể đột biến có khả sống sót chiếu tia UV thời gian chiếu từ 60 giây đến 180 giây để tiến hành sàng lọc sơ khả sinh SRE thể đột biến theo phương pháp cấy trực tiếp Katarina Gasic cộng sự, 2012 Kết trình bày bảng 3.2 Đỗ Thị Ngọc Huyền 32 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.2 Khả ức chế nấm G.candidum thể đột biến Vùng ức chế nấm G.candidum phân Thể đột Tỷ lệ (%) theo mức biến Đột biến âm (thể đột biến có vùng ức 329 98,5 1,5 334 100 chế G.candidum ≤ 17 mm) Đột biến dương (thể đột biến có vùng ức chế G.candidum 18-21 mm) Tổng số khuẩn lạc kiểm tra Những thể đột biến có vùng ức chế G.candidum ≤ 17mm (vùng ức chế đột biến thấp chủng bố mẹ ) Từ kết bảng 3.2 cho thấy 334 thể đột biến có khả sinh SRE có 329 thể đột biến âm chiếm 98,5%, thể vùng ức chế G.candidum ≤ 17mm, có 1,5 % xuất thể đột biến dương, thể vùng ức chế G.candidum 18 – 21mm Phần lớn chủng đột biến có khả sinh SRE với xuất cao chủng bố mẹ thu đc thời điểm 60 90 giây chiếu tia UV Sư tăng sản lương SRE chủng đột biến tác dụng tác nhân gây đột biến việc làm bất hoạt gen điều hòa (salA, syrF syrG) dẫn tới tăng tổng hợp SRE tác động trực tiếp tới promoter syrB tác động gián tiếp đến q trình điều hịa phiên mã Để hiểu sáng tỏ chế sinh tổng hợp SRE, tiến hành nghiên cứu phân tích tính chất gen liên quan đến trình sinh tổng hợp SRE trước sau trình đột biến tia UV mức độ biểu chúng Đây hướng nghiên cứu có ý nghĩa để điều khiển trình tổng hợp SRE mong muốn 3.3 Chọn lọc thể đột biến có khả sinh SRE cao Từ kết sàng lọc trên, chọn thể đột biến dương để xác định hoạt tính SRE chủng theo phương pháp khuếch tán thạch thể đột biến có kí hiệu P syringae PS 120-15, P syringae PS 120-223, P,syringae PS 120-117, P syringae PS 120-79, P syringae PS 120-91 Kết xác định hoạt tính sau 72 lên men thể bảng 3.3 Đỗ Thị Ngọc Huyền 33 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.3 Xác định hoạt tính SRE thể đột biến tuyển chọn STT Tên chủng Hoạt tính Hoạt tính SRE gia SRE (U/ml) tăng so với chủng gốc (%) P syringae PS 120-223 41,0 14 P syringae PS 120-15 47,6 32,2 P syringae PS 120-117 38,8 8,0 P syringae PS 120-79 44,6 24 P syringae PS 120-91 39 8,6 Kết bảng 3.3 cho thấy thể đột biến P Syringae PS 120-15 có hoạt tính SRE cao đạt 47,6 U/ml, hoạt tính SRE cao so với chủng gốc (36 U/ml ) 32,2%, thể đột biến P syringae PS 120-79 có hoạt tính SRE đạt 44,6U/ml, hoạt tính tăng so với chủng gốc 24% Các thể đột biến cịn lại có hoạt tính SRE từ 38,8 – 41,0 U/ml, hoạt tính tăng so với chủng gốc từ – 14% Kết cho thấy phương pháp gây đột biến tia UV cho hiệu rõ rệt đến việc nâng cao hoạt tính chủng giống Hình 3.2 Kiểm tra hoạt tính SRE chủng gốc P syringae PS 120 (hình A) thể đột biến P syringae PS 120-15 (hình B) phương pháp khuyếch tán đĩa thạch Đỗ Thị Ngọc Huyền 34 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp 3.4 Viện Đại học Mở Hà Nội Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng P.syringae PS 120 thể đột biến P.syringae PS 120-15 Chúng lựa chọn thể đột biến P syringae PS 120-15 để tiến hành quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào thể đột biến so sánh với đặc điểm chủng gốc Kết trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng gốc P syringae PS 120 thể đột biến P syringae PS 120-15 P syringae PS 120 P syringae PS 120-15 Hình dạng khuẩn lạc hình trịn, có viền mép hình trịn, có viền mép Kích thước khuẩn lạc 1,5 – mm 1,5 – mm Trắng kem sáng Trắng đục Pyocianin - - Fluorescin + + 50C + + 200C ++ ++ 300C +++ +++ 420C - - Nhuộm gram gram(-) gram(-) Hình thái tế bào hình que hình que - - Đặc điểm (mm) Mầu sắc khuẩn lạc Sắc tố Phát triển Bào tử Ghi chú: (+): phản ứng dương tính (-): phản ứng âm tính ++: phát triển tốt +++: phát triển tốt Đỗ Thị Ngọc Huyền 35 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết bảng 3.4 cho thấy hai chủng có đặc điểm kiểu hình giống khuẩn lạc trịn, lồi, bóng, nhẵn, đường kính 1,5 – mm, tế bào hình que, khơng có bào tử, có khả di động, gram âm Duy có mầu sắc khuẩn lạc chủng đột biến thay đổi so với chủng gốc (4 thể đột biến P syringae PS 120-223, P syringae PS 120-117, P syringae PS 120-79, P syringae PS 120-91cũng có màu sắc khuẩn lạc trắng đục trắng ngả sang vàng) Như vậy, q trình lựa chọn thể đột biến có hoạt tính SRE cao ta dựa vào đặc điểm hình thái chủng xác định tần số đột biến kiểu hình 3.5 Phân tích trình tự ARN 16S chủng đột biến PS 120-15 Từ kết ta thấy, chủng đột biến từ chủng Pseudomonas syringae PS 120 chủng đột biến P syringae PS 120-15 cho hoạt tính SRE cao đạt tới 47,6 U/ml sau 72 lên men Vì vậy, chúng tơi lựa chọn chủng đột biến P syringae PS 120-15 để đem phân tích trình tự 16S ARN
Tách chiết ADN tổng số Từ khuẩn lạc đặc trưng chủng PS 120-15, tiến hành nuôi cấy tách chiết ADN tổng số sử dụng Kit Tách chiết ADN KIT Pure Link Genomic ADN mini Kit (Invitrogen), sau định lượng ADN thu cách đo quang phổ máy Biophotometer plus chương trình đo ADN Kết bảng 3.5 Bảng 3.5: Định lượng ADN tổng số Tỉ lệ Tỉ lệ Mẫu A260/A280 A260/A230 STT 1,89 PS 120-15 1,83 Nồng độ ADN (ng/µL) 210 Từ bảng 3.5, nhận thấy ADN chủng đem tách chiết ADN tổng số cho số A260/A280 khoảng 1,8 - 2,0 A260/A230 lớn 1,5 chứng tỏ quy trình tách chiết đảm bảo độ tinh cần thiết Mặt khác, kết thực nghiệm điện di gel agarose 1%, ADN tách chiết nhuộm thuốc nhuộm SYBR Green (hình 3.3) cho thấy chủng sau Đỗ Thị Ngọc Huyền 36 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội lần chạy có băng ADN sáng không bị đứt gẫy, chất lượng ADN đảm bảo độ tinh lượng phù hợp cho phân tích PCR Hình 3.3: Hình ảnh ADN tổng số chủng vi khuẩnPS 120-15 gel agarose 1% (chạy lặp lại lần)
Khuếch đại gen 16S ARN chủng vi khuẩnPS 120-15 Sau có ADN genome từ chủng trên, tiến hành PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 16S rARN với quy trình tiến hành miêu tả phương pháp nghiên cứu Kết PCR miêu tả hình 3.4 1 3000 bp 1465 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rARN chủng vi khuẩn PS 120-15 - Chứng âm - Chủng PS 120-15 - Thang chuẩn ADN (Intron) Từ hình 3.4 cho thấy sản phẩm PCR băng (số 2) có trọng lượng phân tử khoảng 1465 bp điều chứng tỏ khuếch đại gen 16S rARN
Trình tự 16S rARN chủng vi khuẩn PS 120-15 Đỗ Thị Ngọc Huyền 37 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Sản phẩm PCR đưa giải trình tự có trình tự sau: GGGCCTAACCATGCAAGTTCGAGCGGCAGCACGGGTACTTGTACCTGGTGGCGAGCGGCGGAC GGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAAT ACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTA GGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGA GGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATT GTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGA CAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAA TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGC TCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCT GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACT GATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAAACGCATT AAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACAT CCAATGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTG TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTT ACCAGCACATTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGA TGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGA GGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCT GCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATAC GTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAG TCTAACCTTCGGGGGGACGGTACCACGGTTATTCA Trình tự chủng đưa lên ngân hàng gen sử dụng công cụ BLAST NCBI để phân tích Kết định danh sơ đồ phân loại thể bảng 3.6 hình 3.5 Đỗ Thị Ngọc Huyền 38 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.6: Kết định danh sử dụng công cụ BLAST NCBI Đỗ Thị Ngọc Huyền 39 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.5: Sơ đồ phát sinh loài chủng PS 120-15 sử dụng công cụ BLAST NCBI Đỗ Thị Ngọc Huyền 40 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.7: Sự sai khác sau giải trình tự 16S rARB chủng PS 120-15khi so sánh với chủng Pseudomonas syringae NBRC 14076trên GenBank Đỗ Thị Ngọc Huyền 41 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Từ kết thu kết luận: - Bằng kỹ thuật PCR, đoạn gen 16S rARN chủng nghiên cứu sau nhân lên đọc giải trình tự có tên lồi PS 120-15 với độ tương đồng 99% so với chủng gốc 3.6 Động thái trình sinh tổng hợp SRE P.syringae PS 120 thể đột biến P.syringae PS 120-15 Bảng 3.8 Khả sinh SRE củaP syringae PS 120 thể đột biến P syringae PS 120-15 khoảng thời gian khác Thời gian Hoạt tính Hoạt tính lên men SRE từ P SRE từ P (giờ) syringae PS syringae PS 120 (U/ml) 120-15 (U/ml) 12 3,2 5,4 24 9,5 14,8 48 25,7 48,5 72 36,2 47,6 96 34,0 44,2 Đỗ Thị Ngọc Huyền 42 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết cho thấy hoạt tính SRE thu từ chủng gốc P syringae PS 120 đạt cao thời gian lên men 72 36,2 U/ml Bên cạnh hoạt tính SRE từ thể đột biến P syringae PS 120-15 đạt cao 48 lên men với 48,5 U/ml 3.7 Kiểm tra tính ổn định chủng đột biến Chúng tiếp tục kiểm tra mức độ ổn định hoạt tính thể đột biến P syringae PS 120-15 cách cấy chuyền xác định lại hoạt tính theo phương pháp khuếch tán thạch Kết bảng 3.6 cho thấy phần lớn thể đột biến ổn định, 80% hoạt tính trì mức cao so với chủng gốc Bảng 3.9 Khả sinh SRE chủng gốc P syringae PS 120 thể đột biến P syringae PS 120-15 qua hệ Kí hiệu Hoạt tính SRE chủng qua hệ (U/ml) chủng F1 F2 F3 F4 F5 P syringae 47,6 47,2 46,6 46,0 44,2 36,1 36,0 35,8 35,6 34,5 PS 120-15 P syringae PS 120 Đỗ Thị Ngọc Huyền 43 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN KẾT LUẬN - Đã xác định tỉ lệ gây chết (0,1-10%) UV chủng P syringae PS 120 nằm khoảng 60-180 giây - Đã lựa chọn 334 thể đột biến để sàng lọc sơ khả sinh SRE Trong số có 329 thể đột biến chiếm 98,5% đột biến âm (vùng ức chế nấm G.candidum ≤ 17 mm, nhỏ so với chủng gốc) đột biến dương (có vùng ức chế G.candidum từ 18-21 mm, lớn so với chủng gốc) - Đã xác định hoạt tính SRE thể đột biến lựa chọn, có thể đột biến cho hoạt tính SRE 48,6 U/ml (cao 35% so với chủng gốc) Chủng kí hiệu P syringae PS 120-15 - Quan sát đặc điểm ni cấy, hình thái khuẩn lạc tế bào cho thấy chủng gốc P syringae PS 120 thể đột biến P syringae PS 120-15 có đặc điểm gần giống nhau, có biến đổi màu sắc khuẩn lạc thể đột biến khuẩn lạc có màu trắng đục cịn chủng gốc khuẩn lạc có màu trắng kem sáng - Kiểm tra tính ổn định thể đột biến P syringae PS 120-15 cho thấy hoạt tính SRE chủng phần lớn ổn định, 80% hoạt tính trì mức cao chủng gốc Đỗ Thị Ngọc Huyền 44 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Ashok, P B., Lei, Z., Robert, C B., and Jon, Y T (1987) Mechanism of Action of Pseudomonas syringae Phytotoxin, Syringomycin Plant Physiol 83, 39-43 Gross, D C (1985) Regulation of syringomycin synthesis in Pseudomonas syringae pv syringae and defined conditions for its production Journal of Applied Bacteriology, 58, 167-174 Gross, D C and Devay, J E (1977c) Production and purification of syringomycin, a phytotoxin produced by Pseudomonas syringae Physiological Plant 11, 13-28 Gross, D C and Devay, J E (1977a) Population dynamics and pathogenesis of Pseudomonas syringae in maize and cowpea in relation to the in vitro production of syringomycin Phytopathology 67: 475-483 Jon Yutaka Takemoto, (2012) Organic syringomycin methods and compositions International Publication number WO 2012173942 A2 Katarina Gasic, Anđelka Prokic, Milan Ivanovic, Nemanja Kuzmanovic and Aleksa Obradovic (2012) Differentiation of Pseudomonas syringae Pathovars Originating from Stone Fruits Pestic Phytomed (Belgrade), 27(3), 2012, 219229 Kulanthaivel, Belvo, Martin, (2001) Antyfungal adents isolated from Pseudomonas syringae International Publication number: WO 00/63240 Al Massimiliano, A., Tommaso, E., Laura, Z., Maria, R F., Vincenzo, F., Alfredo, D., Maurizio, P., Ingeborg, G (2011) Structure of the lipodepsipeptide syringomycin E in phospholipids and sodium dodecylsunphate micelle studied by circular dichroism, NMR spectroscopy and molecular dynamics Biochimica et Biophysica Acta 1808: 2102-2110 Neil, B Q and Dennis, C G (1994) Syringomycin Production among Strains of Pseudomonas syringae pv syringae: conservation of the syrB and syrC genes and Activation of Phytotoxin Production by Plant Signal Moleculas The American Phytopathological Society 7(1): 78-90 Đỗ Thị Ngọc Huyền 45 Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 10 Otta, J D., and English, H (1991) Serology and pathology of Pseudomonas syringae Phytopathology 61: 443-452 11 Sinden, S L., Devay, J E and Backmanp, A (1971) Properties of syringomycin, a wide spectrum antibiotech and phytotoxin produced by Pseudomonas syringae, and its role in bacterial canker-disease of peach trees Physiological Plant Pathology 1, 199-214 Đỗ Thị Ngọc Huyền 46 Lớp: CNSH-1103