Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp rhamnolipid từ vi khuẩn pseudomonas fluorescens hs5

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học - Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Thu Huyền Với kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cám ơn chân thành đến ThS Nguyễn Thị Thu Huyền, người định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, bảo tận tình ln đồng hành giúp đỡ tơi q trình hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn tới tồn thể cán nhân viên làm việc Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học - Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, người giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi thời gian thực khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học-Viện Đại học Mở Hà Nội, giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian học tập phấn đấu trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ ủng hộ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Hà nội, ngày 15 tháng 05 năm 2015 Người thực Nguyễn Thị Thảo Nguyễn Thị Thảo Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG i DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii MỞ ĐẦU MỤC TIÊU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét chất hoạt động bề mặt 1.2 Phân loại chất hoạt động bề mặt 1.3 Tổng quan Rhamnolipid 1.3.1 Cấu tạo 1.3.2 Tính chất 1.3.3 Ứng dụng 10 1.3.4 Nguồn thu nhận 12 1.3.5 Cơ chế sinh tổng hợp 13 1.3.6 Tổng quan vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 14 1.3.6.1.Phân loại 14 1.3.6.2.Đặc điểm hình thái 14 1.3.6.3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 15 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp rhamnolipids từ vi khuẩn Pseudomonas sp 16 1.4.1 Chủng giống vi sinh vật 16 1.4.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường lên men đến khả sinh tổng hợp RL 17 1.4.2.1.Nguồn Carbon 17 1.4.2.2.Nguồn Nitơ 19 1.4.3 Các thông số vật lý cho sinh tổng hợp RL 19 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 Nguyễn Thị Thảo Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.1.1 Đối tượng 22 2.1.2 Môi trường 22 2.1.3 Hóa chất 23 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Giữ giống 23 2.2.2 Nhân giống 24 2.2.3 Lên men sinh tổng hợp RL 24 2.2.4 Thu nhận RL 24 2.2.5 Định lượng RL 25 2.2.6 Ảnh hưởng môi trường lên men đến khả sinh tổng hợp RL 27 2.2.7 Ảnh hưởng nguồn Carbon 27 2.2.8 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 28 2.2.9 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp RL 29 2.2.10.Ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh tổng hợp RL 29 2.2.11.Nghiên cứu tỷ lệ tiếp giống ban đầu thích hợp cho sinh tổng hợp RL 29 2.2.12.Nghiên cứu động học trình sinh trưởng sinh tổng hợp RL 29 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Ảnh hưởng môi trường lên men đến khả sinh tổng hợp RL từ chủng P fluorescens HS5 30 3.2 Ảnh hưởng nguồn Carbon đến sinh tổng hợp RL 32 3.3 Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến sinh tổng hợp RL 35 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp RL 37 3.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp RL 39 3.6 Nghiên cứu tỷ lệ tiếp giống ban đầu thích hợp cho sinh tổng hợp RL 40 3.7 Nghiên cứu động học trình sinh trưởng sinh tổng hợp RL 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Tài liệu tiếng việt 44 Tài liệu tiếng Anh 44 Nguyễn Thị Thảo Lớp: CNSH-1103 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại CHĐBMSH Bảng 1.2 Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp RL 17 Bảng 1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả sinh tổng hợp RL Pseudomonas (Markus et al., 2011) 20 Bảng 2.1 Kết OD490 nm theo lượng rhamnose 26 Bảng 3.1 Sự sinh trưởng sinh tổng hợp RL P fluorescens HS5 theo thời gian lên men 41 Nguyễn Thị ThảoiLớp: CNSH-1103 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc RL Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp RL từ Pseudomonas putida 14 Hình 1.3: Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens HS5 15 Hình 1.4: P fluorescens hình roi 15 Hình 2.1 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan OD490nm lượng rhamnose 26 Hình 3.1 Khả sinh tổng hợp RL P fluorescens HS5 môi trường khác 31 Hình 3.2 Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp RL chủng P fluorescens HS5… 33 Hình 3.3 Xác định nồng độ glycerol thích hợp cho sinh tổng hợp RL từ 34 P fluorescens HS5 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp RL chủng P fluorescens HS5… 35 Hình 3.5 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho sinh tổng hợp RL từ P fluorescens HS5 37 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả sinh tổng hợp RL P fluorescens HS5 38 Hình 3.7 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp RL P fluorescens HS5 39 Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh tổng hợp RL từ P fluorescens HS5… 40 Hình 3.9 Ảnh hưởng động học trình sinh trưởng sinh tổng hợp RL từ P fluorescen HS5 42 Nguyễn Thị ThảoiiLớp: CNSH-1103 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CHĐBM: chất hoạt động bề mặt CHĐBMHH: chất hoạt động bề mặt hóa học CHĐBMSH: chất hoạt động bề mặt sinh học MIC: minimal inhibition concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) RL: Rhamnolipid COD: Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy hóa học) Vvm: volume of air per volume of fermetation solution per minute (thể tích khí/thểtích dịch lên men/phút) mg/l: miligam/liter (miligam/lít) g/l: gram/liter (gam/lít) g/RE l : g/ Rhamnose Equivalent/liter (gam/ Rhamnose Equivalent/lít) N/m: Newton/meter (newton/mét) mN/m: milinewton/meter (mininewton/mét) Nguyễn Thị ThảoiiiLớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Trong vài thập niên trở lại đây, với phát triển khoa học kỹ thuật lĩnh vực thay đổi lối sống nhu cầu người tiêu dùng làm gia tăng việc sử dụng chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) Hàng năm, tồn giới, sản xuất CHĐBM đạt trung bình 10 triệu lợi nhuận ước tính khoảng 9,4 tỷ đô la Mỹ Hiện Việt Nam, đểđáp ứng nhu cầucủa người tiêu dùng, nhiều công ty sản xuất CHĐBM thành lập như: công ty TICO, công ty NETCO… Thống kê ngành công nghiệp cho thấy, việc sử dụng CHĐBM nước ta hàng năm chiếm khoảng 0,5 triệu mà chủ yếu CHĐBM tổng hợp từ hóa học Tuy nhiên, CHĐBM tổng hợp từ hóa học khơng tự phân hủy gây nhiễm mơi trường, làm ảnh hưởng đến sức khỏe người Do đó, cần có nghiên cứu để tìm chất thay CHĐBMHH để giảm nguy ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe người (Lại Thúy Hiền, 2010) Việc nghiên cứu tạo CHĐBM có nguồn gốc tự nhiên hay gọi chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) với đặc tính ưu việt như: khơng độc, có khả phân hủy cao, trì hoạt tính thay đổi nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl, Ca2+, Mg2+ điều kiện khắc nghiệt, sản xuất nguồn phế thải công nghiệp quy mô lớn…CHĐBMSH quan tâm nhiều nhà khoa học giới Các CHĐBMSH thu nhận từ loài thực vật, động vật vi sinh vật Tuy nhiên, CHĐBMSH có nguồn gốc từ động, thực vật thường không ổn định tác dụng ánh sáng, nhiệt độ điều kiện khắc nghiệt từ môi trường Chất HĐBMSH từ vi sinh vật với đặc tính ưu việt khắc phục nhược điểm Năm 1946, CHĐBMSH Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1 Từ đến giới có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng CHĐBMSH nhiều lĩnh vực sản xuất đời sống Một CHĐBMSH biết đến nhiều Rhamnolipid (RL) RL có nhiều tính chất ưu việt : hoạt tính bề mặt; khả nhũ hóa; khả chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối lực ion biến đổi rộng; khả bị phân hủy sinh học; độc tính thấp; khả diệt số Nguyễn Thị Thảo 1Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội loài vi sinh vật như: Phythium, Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium globoum Penicillium funiculosum, Klebsiella pneumoniae, Entrobacteraerogenes, Bacillus subtilis, Micrococcusluteus (Haba et al., 2002, Luiz et al., 2012) RL thường tổng hợp từ số loài vi sinh vật Pseudomonas,Burkholdera, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter Trong đó,Pseudomonas sp nghiên cứu nhiều khả tạo RL với hoạt tính bề mặt tương đối cao, dễ lên men cho sản lượng cao so với vi sinh vật khác Trong lên men sản xuất RL, bên cạnh chủng giống vi sinh vật yếu tố thành phần môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, nguồn nitơ) số yếu tố vật lý (nhiệt độ, thời gian, tốc độ lắc, tỷ lệ tiếp giống…) có ảnh hưởng lớn đến phát triển vi sinh vật sinh tổng hợp RL Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố đến trình sinh tổng hợp RL việc làm cần thiết Ở Việt Nam, việc sản xuất ứng dụng CHĐBMSH lĩnh vực mẻ chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu vấn đề Đặc biệt chưa có cơng trình nghiên cứu sản xuất RL từ P fluorescens Nắm bắt tình hình đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp Rhamnolipid từ vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5.” Nguyễn Thị Thảo 2Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC TIÊU Xác định yếu tố ảnh hưởng đếnquá trình lên men sinh tổng hợp RL từ vi khuẩn P.fluorescens HS5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường lên men đến khả sinh tổng hợp RL - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp RL - Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ carbon đến khả sinh tổng hợp RL - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp RL - Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp RL - Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả sinh tổng hợp RL - Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh tổng hợp RL - Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp RL - Nghiên cứu động học trình sinh trưởng sinh tổng hợp RL Nguyễn Thị Thảo 3Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét chất hoạt động bề mặt Trong năm gần đây, chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) số sản phẩm quan trọng ngành cơng nghiệp hóa học Hàng năm, tồn giới sản xuất CHĐBM trung bình khoảng 10 triệu lợi nhuận thương mại ước tính đạt 9,4 tỉ đô la Mỹ Chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) ứng dụng nhiều lĩnh vực sản xuất sống Người ta ước tính, thời gian thập kỷ qua, nhu cầu CHĐBM tăng 300% ngành cơng nghiệp hóa chất Hoa Kỳ Tuy nhiên, CHĐBM tổng hợp từ hóa học lại khơng tự phân hủy nguy gây nhiễm mơi trường Do đó, cần có nghiên cứu để tìm chất thay CHĐBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010) Năm 1946, chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1 CHĐBMSH hợp chất có cấu trúc đa dạng hoạt tính bề mặt tổng hợp vi sinh vật Tất CHĐBMSH hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm nhóm ưa nước (thường phân tử đường amino acid) nhóm kị nước (thường acid béo) Do cấu tạo phân cực, CHĐBMSH có xu hướng co cụm bề mặt mặt phân cách chất (có thể chất lỏng-chất lỏng, chất lỏng-chất rắn), kết làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng khơng khí) giảm sức căng chất (chất lỏng-chất lỏng chất lỏng-chất rắn) So với CHĐBMHH CHĐBMSH có nhiều ưu điểm hơn: - Có khả phân hủy sinh học - Hầu khơng có độc tính có độ độc tính thấp - Có tính dung hợp sinh học tiêu hóa nên thường dùng mỹ phẩm, dược phẩm hay chí làm phụ gia thực phẩm - Sản xuất có hiệu kinh tế (có thể sản xuất từ phụ phẩm cơng, nơng nghiệp) - Có tính đặc hiệu (các CHĐBMSH dạng phức hợp chất hữu với nhóm chức đặc trưng nên thường có hoạt tính chun biệt) - Tính hiệu điều kiện cực đoan nhiệt độ, pH muối Nguyễn Thị Thảo 4Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đạii h học Mở Hà Nội tạo RL chủng ng P.aeruginosa PA1 mơi trường ng có bbổ sung nguồn carbon khác glucose, mannitol, fructose, fru tose, maltose, lactose, glycerol hexadecane Kết cho th thấy khả sinh tổng hợp RL cao nhấtt mơi tr trường có bổ sung 2% mannitol Chủng Ch P.aeruginosaPA1 cho lượng ng RL đạt cao môi trường ng 1% glycerol so với v môi trường bổ sung n-hexandecane, hexandecane, ddầu parafin dầuu babassu ( Anna et al., 2002) Chủng Pseudomonas luteola B17 Pseudomonas putida B12 cho lượng l RL tăng dần, từ 0,45 g/l đếnn 0,53 g/l llượng rỉ đường bổ sung vào môi tr trường tăng từ 1% đếnn 5% (Dilsad and Belma, 2009) 3.3 Ảnh hưởng củaa ngu nguồn Nitơ đến sinh tổng hợp RL Mặc dù nguồn n nitơ khơng tham gia trực tr tiếpp vào q trình lên men sinh tổng hợp RL đóng óng vai trị tr quan trọng trình sinh trưởng ng ccủa vi khuẩn, có ảnh hưởng ng gián tiếp ti đến sản lượng RL Chính vậy, khả sinh RL ccủa chủng P fluorescens HS5 nguồn ngu nitơ khác đượcc kh khảo sát để chọn loại nitơ thích hợp t Các nguồn ngu nitơ sử dụng nguồnn nitơ hữu (ure, trypton, pepton, cao nấm m men) nguồn ngu nitơ vô (NH4NO3, NaNO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4H2PO4) Kếtt qu trình bày hình 3.4 Hàm lượng RL (g/l) 20 16.5 14.2 15 10 9.7 8.4 10.7 10.2 10.9 12.8 10.6 Ngu Nguồn Nitơ Hình 3.4 Ảnh hưởng ng c nguồn nitơ đến khả sinh tổng ng h hợp RL chủng P fluorescens HS5 Nguyễn Thị Thảo 35Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết hình 3.4 cho thấy, hàm lượng RL tạo thành môi trường MSM7 sử dụng nguồn nitơ khác nhau, dao động từ 8,4 g/l – 16,5 g/l Lượng RL đạt thấp mơi trường MSM7 có bổ sung nguồn nitơ trypton, đạt 8,4 g/l đạt cao bổ sung (NH4)2SO4 16,5 g/l Từ kết lựa chọn (NH4)2SO4 nguồn nitơ cho sản xuất RL từ chủng P fluorescens HS5 Trong nghiên cứu sản xuất RL từ P.aeruginosa, tác giả Tugba cộng (2008) so sánh nguồn nitơ vô hữu khác cho sản xuất RL, kết cho thấy sản lượng RL đạt cao bổ sung NaNO3 vào môi trường sản xuất Chủng P.aeruginosa PA1 có khả sử dụng nguồn nitơ ammonia nitrate cho sinh tổng hợp RL Tuy nhiên nitrate cho lượng RL cao ammonia ure (Anna et al., 2002) Kết tương tự công bố số nghiên cứu khác Một số ý kiến khác cho rằng, sản xuất RL với nguồn nitơ nitrate vi khuẩn cần phải chuyển hóa nitrate thành dạng khử để sử dụng Khử nitrate trình tiêu tốn lượng, so với ammonia nitrate nguồn nitơ thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Cần lưu ý đến hàm lượng nitơ bổ sung cho nồng độ nitơ vừa đủ để tạo sinh khối, sau nồng độ sinh khối đạt số lượng tới hạn vi sinh vật cần sử dụng hết nguồn nitơ carbon việc sản xuất RL (Mohammad et al., 2012) Sau chọn (NH4)2SO4là nguồn nitơ thích hợp nhất, chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 đến trình sinh tổng hợp RL chủng P.fluorescens HS5 (NH4)2SO4 bổ sung với nồng độ 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6% 0,8% vào môi trường MSM7 Kết trình bày hình 3.5 Nguyễn Thị Thảo 36Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đạii h học Mở Hà Nội Hàm lượng RL (g/l) 20 15 13.7 15.3 16.8 16.2 16.1 0.4 0.6 0.8 Hàm llượng RL 10 0.1 0.2 Tỷ lệệ bổ sung (%, v/v) Hình 3.5 Xác định nh nồng n độ (NH4)2SO4 thích hợp cho sinh tổng ng h hợp RL từ P.fluorescensHS5 Kết hình 3.5 cho thấy th bổ sung 0,4% (NH4)2SO4 vào môi tr trường MSM7, hàm lượng ng RL thu đạt cao nhấtt 16,8 g/l Tuy nhiên, bbổ sung nitơ với 0,1%, lượng RL tạoo thành th thấp 13,7 g/l Vậy nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho chủng P.fluorescens HS5 tạo RL 0,4% 3.4 Ảnh hưởng a nhiệt nhiệ độ lên men đến sinh tổng hợp RL Nhiệt độ mộtt nh yếu tố ảnh hưởng lớn đếnn trình phát tri triển sinh tổng hợp hoạtt ch chất vi sinh vật Để xác định nhiệt độộ thích hợp cho P.fluorescens HS5 sinh tổổng hợp RL môi trường MSM7ct, nhi nhiệt độ lên men khác khảoo sát: 10oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC 40oC K Kết trình bày hình 3.6 Nguyễn Thị Thảo 37Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đạii h học Mở Hà Nội Hàm lượng RL (g/l) 20 16.1 12.7 15 10.5 10 4.2 0 10 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (oC) Hình 3.6 Ảnh nh hư hưởng nhiệt độ lên men đến khả ăng sinh ttổng hợp RL P.fluorescensHS5 Kết hình 3.6 cho thấy nhiệt độ lên men ảnh hưởng lớ ớn đến khả sinh tổng hợp RL từ P.fluorescens HS5 Ở nhiệt độ 10oC 40oC P.fluorescens HS5 không sinh RL Khi lên men ttại 20oC, hàm lượng RL thấp, p, đđạt 4,2 g/l Hàm lượng RL tăng dầnn theo nhiệt nhi độ lên men đạt cực đại 30oC 16,1 g/l Kh Khả sinh tổng hợpp RL có xu hướng h giảm nhiệt độ lên men 35oC Điều giải thích P.fluorescensHS5 P.fluorescens phát triển yếu 5oC, phát triểển tốt 25oC 30oC không phát triểnn t 42oC Mỗi vi sinh vật có khả ăng phát tri triển dải nhiệt độ khác Trong m nghiên cứu cho thấy lượng RL thu tốối tối đa từ chủng Pseudomonas sp., sp nuôi cấy nhiệt độ 30oC - 40oC pH 6,5 – 7,0 (Tugba and Emir, 2008) Theo Solali cộng c (2011), P.aeruginosa OCD lên men khoảng nhiệt độ 30oC - 35oC đạt sản lượng ng RL 9,8 g/l, ngư ngược lại lên men nhiệt độ 25oC 37oC, lượng RL thu thấp p Nghiên ccứu Priya Usharani (2009) cho th thấy P.aeruginosa sinh tổng hợp chấất hoạt động bề mặt nhiệt độ từ 35oC đếến 40oC, tối ưu 37oC Trong nghiên cứu u này, P.fluorescensHS5 tạo RL cao 30oC Chính vậy, nhiệt độ đượcc lựa l chọn cho nghiên cứu tiếpp theo Nguyễn Thị Thảo 38Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đạii h học Mở Hà Nội 3.5 Ảnh hưởng củaa tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp RL Đối với vi sinh vậtt sản s xuất RL, đặc biệt Pseudomonas độ khơng khí đóng vai trị quan trọng ng công ngh nghệ nuôi cấyy lên men cho sinh ttổng hợp RL Để tìm tốc độ lắcc thích hợp h cho q trình lên men P.fluorescens HS5, tốc độ lắc khác đư khảoo sát 100, 150, 200 250 vịng/phút Kết hình 3.7 cho thấy tốc độ lắc l thích hợp cho P.fluorescens HS5 sinh tổng ng hhợp 150 – Hàm lượng RL (g/l) 200 vòng/phút, lượng ng RL đđạt 16,5 16,2 g/l 20 16.5 16.2 13.8 15 Hàm llượng RL 10.4 10 100 150 200 250 Tốc độ lắc ắc (vịng/phút) Hình 3.7 Ảnh hưởng ng c tốc độ lắc đến khả sinh tổng ng h hợp RL P.fluorescens HS5 So sánh vớii nghiên ccứu giới cho thấy mỗii ch chủng khả sinh tổng hợpp RL khác lên men với v tốc độ lắcc khác quy mô ssản xuấtt khác Khi lên men bình tam giác 250ml với v tốcc đđộ lắc 100 vòng/phút, P.aeruginosa ATCC 10145 P.aeruginosa JC có khả sinh tổng hợp RL tương ứng ng 9,6 g/l 13,3 g/l, cao h nhiều so vớii ttốc độ lắc 200 vòng/phút (khoảng ng 4,5 g/l 7,5 g/l, theo thứ th tự)) (Aylin and Huseyin, 2013) Ảnh hưởng tốc độ khuấyy đến đ khả sinh tổng hợp RL P.aeruginosa LB1 nghiên cứuu lên men tăng t lên lít (thể tích lít) Khảả sinh RL chủng đượcc đánh đ giá tốc độ khuấy khác nhau: vớii m tốc độ sục khí vvm vvm, tốc t độ khuấyy 500 vòng/phút, 800 vòng/phút K Kết cho thấy tốc độ sụcc khí vvm, tốc t độ khuấy 800 vịng/phút cho khả sinh RL cao (Roberta et al., 2010) Nguyễn Thị Thảo 39Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đạii h học Mở Hà Nội 3.6 Nghiên cứu tỷ lệệ tiếp tiế giống ban đầu thích hợp cho sinh tổng h hợp RL Tỷ lệ giống đóng óng m vai trị quan trọng ng q trình lên men T Tỷ lệ giống thích hợp khơng ng tiết ti kiệm môi trường giống, tiết kiệm m chi phí mà cịn làm cho q trình lên men đạt hiệu cao P.fluorescens HS5 đượ ợc lên men môi trường MSM7ct 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút với tỷ lệ gi giống khảo sát 2%, 4%, 6%, 8% % 10% (chất (ch lượng giống đạt khoảng 108 cfu/ml) K Kết trình bày hình 3.8 Hàm lượng RL (g/l) 20 14.5 15 10 16 16.4 Hàm llượng RL 8.7 10.2 10 Tỷ lệ giống ống ban đầu (%) Hình 3.8 Ảnh hưởng ng c tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh tổng ng h hợp RL từ P.fluorescens HS5 Kết nghiên cứu u cho thấy, th với lượng giống đưaa vào môi trư trường lên men thấp 8% , khả ăng sinh RL thấp, th đạtt 8,7 g/l; 10,2 g/l 14,5 g/l Trong đưa lượng giống tỷ ỷ lệ 8% 10%, lượng RL thu đượcc cao hhơn, nhiên lượng ng RL khơng khác biệt bi có ý nghĩa hai tỷ lệ giống Từ kkết cho thấy, tỷ lệ giống từ 8% - 10% (chất lượng giống đạt khoảng 108 cfu/ml) đạt yêu cầu để lên men sản xuấtt RL từ t P.fluorescens HS5 3.7 Nghiên cứu động ng học họ trình sinh trưởng sinh tổng hợp p RL Trong giai đoạn n lên men, trình sinh trưởng tr vi sinh vậtt trải tr qua giai đoạn: tiềm phát -> > sinh trưởng trư -> cân -> suy vong Toàn q trình ni ggắn liền với thay đổii kéo dài c điều kiện nuôi Chất dinh dưỡ ỡng giảm đi, số lượng tế bào tăng lên rồii giảm gi dần, đồng thời chất trao đổi chấtt ccũng thay đổi Nguyễn Thị Thảo 40Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Do việc nghiên cứu động thái trình sinh trưởng P.fluorescens HS5 cần thiết để xác định giai đoạn phát triển khả sinh RL Kết thể bảng 3.1 hình 3.9 Bảng 3.1 Sự sinh trưởng sinh tổng hợp RL P.fluorescens HS5 theo thờigian lên men Thời gian (giờ) OD600nm pH 0.364 6.5 Hàm lượng RL (g/l) 12 18 1.368 2.037 7.0 7.2 0.6 1.5 24 30 36 42 48 54 60 66 72 2.394 3.762 5.238 5.208 5.347 5.214 5.275 5.223 4.824 7.1 7.1 7.2 7.0 7.2 7.0 7.2 7.1 6.9 4.8 6.7 8.5 10.9 12.1 14.6 16.3 17.2 16.5 Nguyễn Thị Thảo 41Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 20 18 16 OD600nm 14 pH 12 Hàm lượng RL (g/l) 10 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 Thời gian (giờ) Hình 3.9 Ảnh hưởng động học trình sinh trưởng sinh tổng hợp RL từ P fluorescen HS5 Kết nghiên cứu cho thấy trình sinh trưởng P.fluorescens HS5 bắt đầu sau nuôi cấy trình sinh tổng hợp RL diễn sau 12 lên men Pha sinh trưởng chủng kéo dài từ đến 36 đến thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại 36 (OD600nm = 5,238) chuyển sang pha cân Trong 36 đầu với tăng mật độ tế bào (OD600nm tăng từ 0,364 đến 5,238) hàm lượng RL tổng hợp tăng nhanh (từ 0,6 đến 8,5 g/l) Mật độ tế bào đạt cực đại 36 giờ, lượng RL đạt cực đại 66 (17,2 g/l) Như vậy, lượng RL sinh tổng hợp suốt pha phát triển sang pha cân Pha suy vong bắt đầu sau 72 lên men, mật độ tế bào giảm xuống 4,824 Trong trình lên men, pH thay đổi không đáng kể, dao động từ 6,5 đến 7,2 Theo kết thí nghiệm thu được, lựa chọn thời gian 66 thời gian P.fluorescens HS5 sinh tổng hợp RL cao để tiến hành thí nghiệm Nguyễn Thị Thảo 42Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội KẾT LUẬN Đã xác định số yếu tố cơng nghệ thích hợp cho q trình lên men sinh tổng hợp RL từP.fluorescens HS5: môi trường MSM7ct với nguồn carbon bổ sung glycerol 2%, nguồn nitơ bổ sung (NH4)2SO4 0,4%.Thành phần môi trường MSM7ct cho lên men sinh tổng hợp RL từ chủng P.fluorescensHS5 (g/l): glycerol 20; (NH4)2SO4 4; KH2PO4 0,7; Na2HPO4 2; CaCl2.2H2O 0,01; MgSO4.7H2O 0,4; FeSO4.7H2O 0,001; pH: 7,2 ± 0,2 - Nhiệt độ lên men 30oC - Tỷ lệ tiếp giống – 10% - Tốc độ lắc 150 – 200 vòng/phút - Thời gian lên men 66 Với thông số này, sản lượng RL đạt cao 17,2 g/l sau 66 lên men Nguyễn Thị Thảo 43Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Lại Thuý Hiền (2010) Nghiên cứu sản xuất ứng dụng chất hoạt hoá bề mặt sin học từ vi sinh vật biển số ngành công nghiệp sử lý môi trường Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ đề tài Tài liệu tiếng Anh Abbas, T., Fatemeh, K and Mahnaz, M A (2004) Improved Production of Rhamnolipids by a Pseudomonas aeuginosa Mutant Iranian Biomedical Journal (1): 25-31 Ahmad, M A., Rudolf, H., Francois, L., Markus, M M., and Eric, D (2011) Rhamnolipids: Detection, Analysis, Biosynthesis, Genetic Regulation, and Bioengineering of Production Microbiology Monographs 20 Al-Araji, L., Rahman, R., Basri, M., Salleh, A., (2007) Optimization of Rhamnolipids Produced by Pseudomonas aeuginosa 181 using Response Surface Modeling Annals of Micobiol 57: 571-575 Andreas, W., Till, T., Torsten, T A., Pamela, W., Johannes, H., Carsten, M R W., Benjamin, K., Michaela, Z., Susanne, W., Rudolf, H., Christoph, S., Frank, R and Lars, M B (2011) Growth independent Rhamnolipids Production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonasputida KT2440 Wittgens et al Microbial Cell Factories Anna, L M S., Sebastian, G V., Menezes, E P., Alves, T M L., Santos, A S., Pereira, N J., and Freire, D M G (2002) Production of Biosurfactants from Pseudomonas aeuginosa PA1 isolate in oil environments Brazilian Journal of Chemical Engineering 19(2): 159-166 Aylin, K C., Huseyin, K (2013) The use of raw cheese whey and olive oil mill wastewater for Rhamnolipid Production by recombinant Pseudomonas aeuginosa Environmental and Experimental Biology 11: 125-130 Banat, I M., Makkar, R S., Cameotra, S S (2000) Potential commercial applications of microbial surfactants Appl Microbial Biotechnol, 53: 495-508 Nguyễn Thị Thảo 44Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Benincasa, M., Contiero, J., Manresa, M A., Moraes, I O (2002) Rhamnolipids Prodution by Pseudomonas aeuginosa LBI growing on soapstock as the solr carbon source Journal of Food Engineering 54: 283288 10 Ceslia, F., Centeno, D R., Mariano, M., Janaisna, F., Medeiros, B., Susana, J K., Carlos, A., Veiga, B (2010) Production of a Rhamnolipid-type biosurfactant by Pseudomonas aeuginosa LBM10 grown on glycerol African Journal of Biotechnology Vol 9(53): 9012-9017 11 Clarke, K G., Ballot, F., Reid, S J., (2010) Enhanced Rhamnolipids Prodution by Pseudomonas aeuginosa under phosphate limiton World J Microbiol Biotechnol 26: 2179-2184 12 Desai, J D., Banat, I M (1997) Microbial production of surfactants and their commercial potential Microbial Biotechnol 50: 520-529 13 Deziel, E., Paquette, G., Villemur, R., Lepine, F., Bisaillon, J., (1996) Biosurfuctant production by a Soil Pseudomonas strain growing on polycyclic aromatic hydrocarbon Appl Environ Microbiol 62: 1908-1912 14 Dilsad, O and Belma, A (2009) Biosurfactant production in sugar beet molasses by some Pseudomonas spp J environ Biol 30(1): 161-163 15 Haba, E., Espuny, M J., Busquete, M., Mamresa, A (2000) Sceening and production of Rhamnolipids by Pseudomonas aeuginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oils J Appl Microbiol 88: 379-387 16 Lee, K M., Hwang, S H., Ha, S D., Jang, J H., Lim, D J., Kong, j y., (2004) Rhamnolipid production in batch ang fed batch fermentation using Pseudomonas aeuginosa BYK-2 KCTC 18012P Biotechnol Bioprocess Eng 9: 267-273 17 Lin, Z., Tracey, A V., Arpad, S., Jeanne, E P and Raina, M M (2012) Fatty acid co-substrate provides β-oxidation precursors for Rhamnolipid biosynthesis in Pseudomonas aeuginosa : evidence from isotope tracing and gene expression App.Environ Microbiol Nguyễn Thị Thảo 45Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 18 Luo, Z., Yuan, X., Zong, H., Zeng, G., Liu, Z., Ma, X., Zhu, Y (2013) Optimizing Rhamnolipids Prodution by Pseudomonas aeuginosa ATCC 9027 grown on waste frying oil using respone surface method and batch-fed fermentation J Cent South Univ 20: 1015-1021 19 Markus, M M., Barbara, H., Michaela, K., Christoph, S., Rudolf, H (2011) Evaluation of Rhamnolipid Prodution capacity of Pseudomonas aeuginosa PA01 in comparison to the Rhamnolipid over-producer strains DSM 7108 and DSM 2874 Appl Microbiol Biotechnol 89: 585-592 20 Matsufuji, M., Nakata, K., Yoshimoto, A., (1997) High production of Rhamnolipid by Pseudomonas aeuginosa growing on ethanol Biotechnol Letters 19: 1213-1215 21 Michael, E S., and Raina, M M., (1997) Biosurfactants Their Identity and Potential Efficasy in the Biological Control of Zoosporic Plant Pathogens Department of Plant Pathology, University of Arizona, Tucson 22 Milena, G R., Gordana, G., Miroslav, M V and Ivanka, K (2012) Production and characterization of Rhamnolipid from Pseudomonas aeuginosa san-ai J Serb.Chem.Soc 77(1) 27-42 23 Miriam, H., Olga, S., Rchard, J., Josef, C., Jan, M., Karel, S., Tomas, S (2013) Characterization of Rhamnolipid production by non-pathogenic Acinetobacter and Enterobacter bacteria Bioresource Technology 130: 510516 24 Mohammad, G A., Mohammad, H F., Seyed, A J., Seyed, A A (2012) Comparison between batch and fed-batch pfoduction of Rhamnolipid by Pseudomonas aeuginosa Jranian J.Biol., 10(4): 263-269 25 Mukherjee, S., Das, P., Sen, R (2006) Towards commercial production of microbial surfactants Trends Biotechnol 24: 509-515 26 Muller, M M., Hormann, B., Kugel, M., Syldatk, C., Hausmann, R., (2011) Evaluation of Rhamnolipids production capacity of Pseudomonas aeuginosa PAO1 in comparison to the Rhamnolipid over-producer strains DSM 7108 and DSM 2874 Apl microbiol Biotechol 89: 585-592 Nguyễn Thị Thảo 46Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 27 Nayak, A S., Vijaykumar, M H., Karegoudar, T B., (2009) Characterization of biosurfuctant producer by Pseudoxanthomonas sp PNK-04 and its applicarion in bioremediation Int J Bioder Biodeg 63:73-79 28 Nereus, W G., Alberto, N., William, F., and Daniel, K Y S (2007) Production of Rhamnolipid by Pseudomonas chlororaphis, a Nonpathogenis Bacterium Applied and environmental microbiology 71(5): 2288-2293 29 Pantazaki, A A., Dimopoulou, M I., Simou, O M., Pritta, A A., (2010) Sunflower seed oil and oleic acid utilization for the production of Rhamnolipids by Thermophilus HB8 Appl Microbiol Biotechnol 88: 939951 30 Parthasarathi, R and Sivakumaar, P K (2009) Effect of Different Carbon Sources on the Production of Biosurfactant by Pseudomanas fluorescens Isolates from Manfrove Forests (Pichavaram), Tamil Nadu, India Global Journal of EnvironmentalResearch 3(2): 99-101 31 Praveesh, B V., Soniyamby, A R., Mariappan, C., Kavithakumari, P and Palaniswamy, M (2010) Production of Biosurfactant using cashew nut shell liquid as the carbon source from Pseudomonas aeuginosa MTCC424 Global Journal of Biotechnology and Biochemistry 5(4): 216-219 32 Qinhong, W., Xiangdong, F., Baojun, B., Xiaolin, L., Patrick, J S., William, A G., Yongchun, T (2007) Engineering Bacteria for Production of Rhamnolipid as an Agent for Enhanced Oil Recovery Biotechnology and Bioengineering: 842-853 33 Rahim, R., Burrows, L L et al (2000) Involvement of the locus in core oligosaccharide and O polysaccharide assembly in Pseudomonas aeuginosa, Microbiology: 2803-2814 34 Rahman, K S M et al (2002) Rhamnolipid biosurfactant production by strains of Pseudomonas aeuginosa using low-cost raw materials Biotechnology Progress, 18 Nguyễn Thị Thảo 47Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 35 Raza, Z A., Khan, M S., Rehman, A., (2006) Production kinetics and tensioactive characteristics of biosurfantant from Pseudomonas aeuginosa mutant grown on watse frying oils Biotechnol Letters 28: 1623-1631 36 Roberta, B L., Siddhartha, S G V A O C., Lireny, A G G and Jonas, C (2010) Effect of C/N Ratio and physicochemical Conditions on the production of Rhamnolipid by Pseudomonas aeuginosa LB1 Applied and environmental microniology : 985-989 37 Sarachat, T., Pornsunthorntawee, O., Chavadej, S., Rujiravanit, R., (2010) Purification and concentration of a Rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeuginosa SP4 using foam fractionation Biores Technol.101: 324-330 38 Seema, D and Nakuleshwar, D J (2012) Isolation of biosurfactant- producing marine bacteria African Journal of Environmental Science and Techmology 6(6): 263-266 39 Sneha, K S., Padmapriya, B and Rajeswari, T (2012) Isolation and Screening of Biosurfactants produced by Pseudomonas aeuginosa from Oil Spilled Soils International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives 3(2): 321-325 40 Sonali, S., Sriparna, D., Dipa, B (2011) Optimization of culture conditions for biosurfactant production from Pseudomonas aeuginosa OCD Journal of advanced scientific research, 33-36 41 Soniyamby, A R., Praveesh, B V., Vilamin, H J., Kavithakumari, P., Lalitha, S., Palaniswamy, M (2011) Enhanced production of biosurfactant from Isolated Pseudomonas SP Growing On Used Edible Oil Journal of American Science 7: 50-53 42 Tavares,L F., Silva, P M., Junqueira, M., Mariano, D C., Nogueira, F C., Domont, G B., Freire, D M., Neves, B C (2013) Characterization of Rhamnolipid produced by wild-type and engineered kururiensis Appl Microbiol Biotechnol 97(5): 1909-1921 Nguyễn Thị Thảo 48Lớp:CNSH-1103 Burkholderia Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 43 Tugba, S., Emir, C (2008) Nutritional factors effecting Rhamnolipid production by s Nosocomail Pseudomonas aeuginosa Hacettepe J Biol & Chem 36(1): 77-81 44 Wei, Y H., Chou, C L., Chang, J S., (2005) Rhamnolipids Prodution by indigenous Pseudomonas aeuginosa J4 originating from prtrochemical wastewater Biochem Eng J 27: 146-154 45 Zhu, K., Rock, C O (2008) RhlA converts beta-hydroxyacyl-acyl carrier protein intermediates in fatty acid synthesis to the beta-hydroxycanoyl betahydrocydecanoate componemt of Rhamnolipid in Pseudomonas aeuginosa J Bacteriol 190:3147-3154 Nguyễn Thị Thảo 49Lớp:CNSH-1103