Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa methionine sulfoxide reductase trong điều kiện stress mặn, hạn ở cây arabidopsis và đậu tương

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO BỘNÔNGNGHIỆPVÀPTNT VIỆNKHOAHỌCNÔNG NGHIỆPVIỆTNAM CHUĐỨCHÀ NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HĨAMETHIONINESULFOXIDEREDUCTASETRONGĐIỀUKI ỆNSTRESSMẶN,HẠNỞCÂYARABIDOPSISVÀĐẬUTƯƠNG LUẬNÁNTIẾN SỸNƠNGNGHIỆP HÀNỘI,2018 BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO BỘNƠNGNGHIỆPVÀPTNT VIỆNKHOAHỌCNÔNG NGHIỆPVIỆTNAM CHUĐỨCHÀ NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HĨAMETHIONINESULFOXIDEREDUCTASETRONGĐIỀUKI ỆNSTRESSMẶN, HẠNỞCÂYARABIDOPSISVÀĐẬUTƯƠNG Chunngành : CơngnghệSinhhọc Mã số : 9420201 NGƯỜI HƯỚNGDẪNKHOAHỌC TS.LêTiếnDũng TS.PhạmThịLýThu HÀNỘI,2018 LỜICAMĐOAN Tơixincamđoancáckếtquảnghiêncứuđượctrìnhbàytrongluậnánlàdotơi thựchiện.Cácsốliệuvàkếtquảnghiêncứuđãnêutrongluậnánlàtrung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu nàokhác.Tơixincamđoanmọisựgiúpđỡđãđượccảmơn, cáctàiliệutríchdẫnđãđược rõnguồngốc HàNội,ngày tháng 2018Tácgiảluậnán ChuĐứcHà năm LỜI CẢMƠN Để hoàn thành luận án này, nghiên cứu sinh nhận tậntìnhgiúpđỡcủa nhiềutậpthểvà cánhân Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Tiến Dũng,TS Phạm Thị Lý Thu, người thầy, người cô anh chị tận tìnhdẫn dắt, động viên tạo điều kiện thuận lợi suốt trình nghiêncứu khoa họcvà hồnthànhluậnán Nghiên cứu sinh xin biết ơn ý kiến đóng góp quý báu cácthầy, cô Ban Đào tạo Sau đại học - Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam,Banlãnh đạo ViệnDitruyền Nơngnghiệptrong suốtqtrình học tập Nghiên cứu sinh xin chân thành cảm ơn cán bộ, bạn bè đồng nghiệpcơngtáctạibộmơnSinhhọcphântử,phịngthínghiệmChọngiốngphântửSắn - Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Tài nguyên Bền vững RIKEN(Nhật Bản) chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ động viên suốt trìnhthực luận án Đồng thời, luận án nghiên cứu sinh hỗ trợkinhphítừđềtàicủaQuỹPháttriểnKhoahọcvàCơngnghệViệtNam,mãsố 106-NN.02-2013.46 Cuối cùng, nghiên cứu sinh xin cảm ơn gia đình bạn bè động viênkhíchlệtrongsuốtq trình học tậpvàhồnthànhluậnán Hà Nội, ngàyt h n g n ă m Tácgiảluậnán ChuĐứcHà MỤCLỤC Lờicamđoan i Lờicảmơn ii Mụclục iii Danh mục chữviếttắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình .ix MỞĐẦU 1 Tính cấpthiếtcủaluậnán .1 Mụctiêunghiêncứucủaluậnán .2 Ýnghĩakhoahọc vàthựctiễncủa luậnán 3.1 Ýnghĩakhoahọc củaluậnán 3.2 Ýnghĩathựctiễncủaluậnán Nhữngđónggópmớicủa luận án CHƯƠNGITỔNG QUANTÀILIỆU .4 1.1 Ảnhhưởngcủađiềukiệnmôi trườngđếnđời sốngthựcvật 1.1.1 Tácđ ộ n g c ủ a b i ế n đ ổ i k h í h ậ u đ ố i v i c â y t r n g n ô n g n g h i ệ p hiệnnay 1.1.2 Cơchếtácđộng yếu tốngoại cảnhbấtlợiđến tếbào thực vật .9 1.1.3 Cơchếđápứngcủa thựcvậtvớiđiềukiệnbấtlợi 15 1.2 aitrịcủaenymemethioninesuloxidereductasevàqtrình ơxi hóa methionineởthựcvật 18 1.2.1 Qtrìnhơxihóa methionineởthực vật 18 1.2.2 Tổng quan vềhọenzyme methioninesulfoxidereductase 21 1.3 Methioninevàproteingiàu methionineởthực vật 29 1.3.1 Một vài nétvềmethionine vàvaitrò củamethionine ởthựcvật 29 1.3.2 Proteingiàumethionine ởthựcvật 32 1.4 Tiềmnăngứngdụngcủaenzymemethioninesulfoxidereductasetrong chọn tạogiốngnhằmnâng caotính chốngchịuởcâytrồng 34 CHƯƠNGIITLIỆUÀ PHƯƠNGPHP NGHIN CU 38 2.1 ậtliệunghiên cứu 38 2.1.1 ậtliệu chonghiên cứutinsinhhọc 38 2.1.2 ậtliệuchonghiêncứuthựcnghiệm 38 2.2 Thờigianvàđịađiểmnghiên cứu 38 2.2.1 Thờigiannghiên cứu 38 2.2.2 Địađiểmnghiêncứu .38 2.3 Phươngphápnghiêncứu 39 2.3.1 Phươngpháptiếp cậnbằngtin sinhhọc 39 2.3.2 Phươngpháptiếp cậnbằngthựcnghiệm 47 CHƯƠNGIIIKẾTQUẢÀ T H Ả O L U N 51 3.1 XácđịnhvàphântíchproteingiàumethionineởArabidopsis 51 3.1.1 Tìmkiếm,xácđịnhvàđịnhdanhgenmãhóap r o t e i n g i u methioni neởArabidopsis 51 3.1.2 PhânloạichứcnăngcủaproteingiàumethionineởArabidopsis 53 3.1.3 Phântíchđặctínhcơbảnc ủ a p r o t e i n g i u m e t h i o n i n e Arab idopsis .55 3.1.4 Phântíchmứcđộbiểuhiệngenm ã h ó a M R P t r ê n A r a b i d o p s i s trongđiều kiện thường vàđiềukiệnbất lợi 60 3.1.5 Đánhgiámứcđộđápứ n g c ủ a c â y A r a b i d o p s i s t h a l i a n a c h u y ể n genbiểuhiện quámứcgenAt3G55240vớiđiều kiệnbấtlợi 67 3.2 XácđịnhvàphântíchproteingiàuMethionineởđậutương .74 3.2.1 Tìmkiếm,xácđịnhvàđịnhdanhgenmãhóap r o t e i n g i u methioni neởđậu tương .75 3.2.2 Phânloạic h ứ c n ă n g c ủ a g e n m ã h ó a p r o t e i n g i u m e t h i o n i n e đậu tương 76 3.2.3 Phântíchmứcđộbiểuhiệnc ủ a g e n m ã h ó a p r o t e i n g i u methio nineởđậu tương 78 3.3 Phântíchinsilicohọgen mãhóaenzymeMSRởđậu tương .82 3.3.1 Xácđịnh họgen mã hóaenzymeMSRAởgenomecâyđậu tương 83 3.3.2 PhântíchhiệntượnglặpgencủahọgenmãhóaenzymeMSRA ởđậutương 85 3.3.3 Phântíchmộtsố đặct í n h c b ả n c ủ a h ọ e n z y m e M S R A đ ậ u tương .87 3.4 Đánhgiáđặctính củahọgen mãhóaenzyme MSRởđậutương .90 3.4.1 Dự đốnyếutốđiều hịa cis-ởvùng promotercủa họ genmã hóaenzymeMSRởđậutương .90 3.4.2 Đánh giámứcđộbiểuhiệncủag e n m ã h ó a M S R đ ậ u t n g trongđiềukiệnthườngvàđiềukiệnn g o i c ả n h b ấ t l ợ i b ằ n g t i n sinhhọc 93 3.4.3 PhântíchmứcđộđápứngcủagenmãhóaMSRBở đậutươngtrongđi ềukiệnthườngvàđiềukiệnngoạicảnhbấtlợibằngthựcnghiệm 97 KẾTLUN À Đ N G H 105 Danhmụccáccơngtrìnhđãcơngbố cóliênquanđếnluận án 106 Tàiliệuthamkhảo 107 Phụlục 128 DANHMỤCCHỮVIẾTTẮT Chi ế 120RH Thun g T i ế n g Anh Thun g T i ế n g Việ Roothaircellsisolated120hours after Tếbàolông rễthuởthờiđiểm sowing giờsaukhigieo Roothaircellsisolated84hoursafter Tếbàolông rễthuởthờiđiểm sowing giờsau khigieo ABA Abscisicacid Axitabscisic Cd Cadmium Cadimi CRE Cis-regulatoryelement Yếutốđiều hịacis- cTP Chloroplasttransitedpeptide Trìnhtựhướngvào lụclạp Cys Cysteine Cystein DNA Deoxyribonucleicacid Axitdeoxyribonucleic fMet N-Formylmethionine N-Formylmethionin GEO Geneexpressionomnibus Khodữliệubiểuhiệngen Ile Isoleucine Isoleucin JA Jasmonicacid Axítjasmonic Ka Nonsynonymoussubstitutionsper Trịsốthaythếtrái nghĩa 84RH nonsynonymoussite Ks Synonymoussubstitutionsper Trịsốthaythếđồngnghĩa synonymoussite L Leaf Lá Lys Lysine Lysin Met Methionine Methionin MetO Methioninesulfoxide Methioninsulfoxit MetO2 Methioninesulfone Methioninsulfon Met-S-O Methionine-S-sulfoxide Methionin-S-sulfoxit Met-R-O Methionine-R-sulfoxide Methionin-R-sulfoxit MRP Methioninerichprotein Proteingiàumethionin mRNA MessengerRNA ARNthôngtin MS Murashige-Skoog Murashige-Skoog MSR Methioninesulfoxidereducatase Methioninsulfoxitreducataza MYBR MYBrecognition Yếutốnhậnbiết MYB MYCR MYCrecognition Yếutốnhậnbiết MYC N Nodule Nốtsần NADPH Nicotinamideadeninedinucleotide Nicotinamitadenindinucleotit phosphate phosphat NST Chromosome Nhiễmsắcthể OPH O-phosphohomoserine O-phosphohomoserin PEL Pseudo-etiolationinlight Giảvàngúa trongánhsáng pI Isoelectricpoint Điểmđngđiện Phe Phenylalanine Phenylalanin PlantCARE Plantcis-actingregulatoryelement Yếutốđiềuhòacis-ởthựcvật PS Phytosiderophore Phytosiderophore qRT-PCR QuantitativeRealtime PCR PCRđịnhlượngthờigianthực R Root Rễ RBC RIKENBioresourceCenter Trungtâmtàinguyênsinhhọc RIKEN RNA Ribonucleicacid Axitribonucleic ROS Reactiveoxygenspecies Gốchoạtđộngchứxi RT Roottips Chóprễ S Sulfur Lưuhuỳnh SA Salicylicacid Axítsalicylic SAM Adenosyl-L-methionine Adenosyl-L-Methionin TF Transcriptionfactor Nhântốphiênmã TraVA Transcriptomevariationanalysis Phântíchhệthống biểuhiện Trp Tryptophan Tryptophan βAPAP βAP-aspartylphosphate βAP-aspartylphosphat DANHMỤCBẢNG Bảng 1.1 Tómtắthọgenm ã h ó a e n z y m e m e t h i o n i n e s u l f o x i d e reductaseởmộtsố loàitrongsinh giới 26 Bảng2.1 DanhsáchmồisửdụngchophảnứngqRT-PCR 47 Bảng 3.1 PhânloạichứcnănggenmãhóaMRPtrongArabidopsis 53 Bảng 3.2 Một sốphântửMRPchứanhiềuMet ởArabidopsis .55 Bảng 3.3 PhântíchđịnhkhunộibàocủaMRPvàyếutốđiềuhịaciscủagen mã hóaMRPởArabidopsis .57 Bảng 3.4 GenA t M R P có m ứ c đ ộ p h i ê n m ãđ áp ứ n g t r on g đ i ề u k i ệ n hạn vàmặn 65 Bảng3.5 ThơngtinvềmộtsốMRPcóthànhphầnMetvàkíchthướcphântửn ổibật 76 Bảng3.6 Phânloạichứcnăng genmãhóaMRPởđậut n g t h e o Mapman .77 Bảng 3.7 GenmãhóaGmMRPcómứcđộbiểuhiệnđápứngvớiđiều kiệnhạnởlá V6và R2 81 Bảng 3.8 ThơngtinchúgiảivềhọgenmãhóaenzymeMSRAởđậutương.84 Bảng 3.9 Hiệntượnglặpgen ởhọenzymeMSRAởđậu tương 85 Bảng3.10.M ộ t s ố đ ặ c tính cơbản củahọ enzymeMSRAởđậu tương 88 Bảng 3.11.T ó m tắtkếtquảphântíchbiểuhiệncủagenmãhóaMSRB ởđậu tươngtrongđiều kiện thường 102 Bảng 3.12.T ó m tắtkếtquảphântíchbiểuhiệncủagenmãhóaMSRB ởđậu tươngtrongđiều kiện hạn 103 Bảng 3.13.T ó m tắtkếtquảphântíchbiểuhiệncủagenmãhóaMSRB ởđậu tươngtrongđiều kiện mặn 104