Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro

Cấutạo buồng trứng, sựthànhthụctrứng, quátrìnhthụtinh vàpháttriểnphôiinvivoở lợn

Cấutạobuồngtrứngvà sựthànhthụcinvivotrứnglợn

Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bàotrứng (giao tử cái-noãn bào) Không giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoangbụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu Buồng trứng ở các loài gia súclà một tổ chức kép, mỗi cá thể cái có hai buồng trứng gắn với hai đầu sừng tử cung(buồngtrứngphảivàbuồngtrứngtrái).

Buồng trứng của phần lớn động vật có vú gồm có hai miền, miền tủy bên trongvà miền vỏ bên ngoài Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miềnvỏgồmcáctếbàovàcáclớpmôcóchứcnăngtạotếbàotrứng,tổnghợpcáchormoneprogesteron e và estrogen Phía ngoài cùng của miền vỏ là một lớp tế bào lập phươngtạothànhlớpbiểumôbaophủtoànbộbềmặtbuồngtrứng.Ngaybêndướibiểumôbềmặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô kiên kết Phía dưới lớp này là nhu mô chứa cácnangtrứngvàcáctếbào chức năng khác [3].

Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nangnguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục (hình 1.1). Nangtrứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình pháttriểntrứng(oogenesis), bảođảmkhảnăng thụtinhvàhìnhthànhphôicủachúng[3].

Trong quá trình phát triển nang (folliculogenesis), nang không có xoang dichuyểntừngoạivivàotrungtâmbuồngtrứng,tạothànhnangcóxoang,pháttriểntiếpthành nang trứng thành thục và di chuyển lại bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sựrụngtrứng.Tếbàocậnnoãncủatrứngtrongcácnangthứcấptiếtradịch,pháttriểnvàtách rời, từ đó hình thành nang có xoang Tế bào trứng tiếp tục phát triển cho đến khithành thục và được giải phóng khỏi buồng trứng (sự rụng trứng) Các hoạt động tổnghợp các thành phần của tế bào chất, sắp xếp và giảm số lượng nhiễm sắc thể liên kếtchặt chẽ với nhau trong quá trình này để đảm bảo sự tích hợp đồng thời sự thành thụcnhânvàthànhthụctếbàochất[4].

Nang thành thục Trứng thứ cấp

Thể vàng giai đoạn sớm

Giải phóng trứng Thể vàng

Nang nguyên thủy Mạch máu

Trứng sơ cấp Nang phát triển

Hình1.1.Cấutrúcbuồngtrứngvàsựpháttriểnnang,trứngởđộng vậtcóvú[5]. Ở lợn,các tế bào mầm nguyên thủy xuất hiện vào ngày 18 sau thụ tinh và tuyếnsinh dục bắt đầu hình thành vào giai đoạn phôi 24-26 ngày tuổi Sau khi sinh, mỗi cáthểlợncáicókhoảng500.000nangnguyênthủygồmmộttếbàotrứngđượcbaoquanhbởi một lớp tế bào cận noãn [6] Ước tính thời gian để nang nguyên thủy phát triểnthành nang thứ cấp là 84 ngày và sau đó cần thêm 19 ngày để đạt được đến giai đoạnnangthànhthục[7];[8].

Các giai đoạn phát triển của nang liên quan chặt chẽ với sự gia tăng kích thướcvà sự thành thục của trứng (Hình 1.2) Trong giai đoạn đầu, kích thước của nang vàcủa tế bào trứng có sự biến đổi song song và tuyến tính Ở các giai đoạn tiếp sau, tếbào trứng bước vào quá trình phân chia giảm phân và đạt kích thước gần như tối đa,kíchthướccủatrứngkhôngđổinhưngkíchthướcnangtiếptụctăngtrưởng[9].Đườngkính tế bào trứng tăng từ khoảng 30 àm đến 120 àm và trứng hoàn thành quỏ trìnhtăngtrưởngtrongcácnang1,8mm.Trứnglợnởgiaiđoạnnàycóhìnhcầu,đườngkínhtrứngkhông màngsỏngdaođộngtrongkhoảng120-170àm[10].

Sự hình thành khoang Trước khi rụng trứng Đường kính trứng Đường kính nang và sự phát triển Nang hình thành Trước rụng trứng

Hình1.2 Sựpháttriển củanang,tếbàotrứnglợnthông quaquátrình giảmphân[8].

Quá trình phát triển của trứng (oogeneisis) từ khi hình thành đến khi thành thục,có khả năng thụ tinh trải qua các giai đoạn biến đổi về hình thái và chức năng, phânchiagiảmnhiễmđặctrưngchocácloàiđộngvậtcóvú [11].

Giaiđoạntăngsốlượngnoãnnguyênthủydiễnrakhicáthểcáichưathànhthụcvề tính, bắt đầu từ ngày thứ 13 sau thụ tinh cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh. Noãnnguyênthủygồmmộttếbàotrứng(ovocytI)đượcbaobọcbởilớptếbàonangmỏng,dẹt được sinh ra từ biểu mô mầm của bào thai Số lượng noãn nguyên thủy được tănglên do quá trình phân chia nguyên phân lặp lại liên tiếp nhiều lần, các noãn bào đượchìnhthànhởgiaiđoạnnàyđều mangbộ nhiễmsắc thể2n.

Giai đoạn sinh trưởngvới đặc điểm các noãn nguyên thủy tích lũy chất dinhdưỡng, tăng kích thước và khối lượng, phát triển thành các noãn bào sơ cấp và noãnbào cấp I Tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n Noãn sơ cấp của lợn baogồm một ovocyt I cú đường kớnh khoảng 30-60 àm, nhõn to, cú hạt dự trữ Balliani,bênngoàiđượcbaobọcbởimộtlớptếbàonangmỏng.NoãnthứcấpgồmmộtovocytI đã phát triển lớn hơn và chứa nhiều noãn hoàng Vỏ của ovocyt I dày lên tạo thànhmàngtrongsuốt,cónhiềulớptếbàobaoquanh.OvocytIcóđườngkínhkhoảng120-

Giai đoạn hình thành trứngkhi noãn bào cấp I trải qua hai lần phân bào giảmphânliêntiếpđểtạomộttrứngvàbacựccầuđềuchứabộnhiễmsắcthểđơnbội1n.Ở lần phân bào I, noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II (noãn bào thứ cấp) cókhối lượng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàng của noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kíchthước bé (cực cầu thứ nhất) Ở lần phân bào II, noãn bào cấp II phân chia hình thànhtế bào trứng có kích thước lớn và cực cầu bé thứ hai, cực cầu bé thứ nhất cũng phânchiathành hai cực cầubé.

Hình1.3 Quátrìnhthànhthụccủatrứnglợn. a: Phức hợp tế bào cận noãn và noãn chưa thành thục, b: Tế bào cận noãn đang pháttriển xung quanh, c: Tế bào cận noãn đang giãn nở, d: Trứng thành thục có thể cực(mũitên) (100X)[13].

Trứng lợn thành thục khoảng 38-42 giờ sau khi xuất hiện đỉnh LH (luteinizinghormone).Trứngchứanhiềunoãnhoànghơn,nhânto,trònvàrõ(Hình1.3).Ba oquanhtế bào trứng là màng trong suốt, bên ngoài màng trong suốt là vành phóng xạ Màngtrong suốt bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dưỡngtếbàotrứng.Màngtếbàochấtlàlớpmàngmỏngbaobọclấytếbàochấtvànhân,cònđược gọi là màng noãn hoàng Màng này có tác dụng nuôi dưỡng tế bào trứng đã thụtinh.Đĩatrứnghìnhthànhtừcáctếbàocậnnoãndàylênxungquanhhaibên ovocytI.SựrụngtrứngxảyrakhitrứngphânchiađếngiaiđoạnkỳgiữaII(MetaphaseII-M.II)[7].

Sự thành thục của trứng bao gồm thành thục của nhân và thành thục tế bào chấtlàhaiquátrìnhthànhthụccầnphảicùngđượchoànthànhtrướckhirụngtrứng.Thôngthường tế bào trứng được coi là thành thục khi xuất hiện thể cực thứ nhất (sự thànhthụcvềnhân)vàtrứngđangởgiaiđoạnM.II.Mặcdùtếbàotrứngđãthànhthụcvề nhân có khả năng thụ tinh với tinh trùng, tuy nhiên sự thành thục về tế bào chất chưađược hoàn thiện có thể dẫn đến sự thiếu hụt một số chất có ảnh hưởng quan trọng lênsựpháttriểncủa phôi[14].

Trạng thái nang có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợninvitro.Trứngđượcthutừcácnangcókíchthước≥3mmcókhảnăngpháttriểnđếngiai đoạn thành thục hoàn toàn trong điều kiện nuôiin vitro, trong khi trứng được thutừnangcókíchthướctừ0,8mmđến2,9mmcótỷlệthànhthụcthấpsaukhinuôicấy48giờvàtrứ ngthutừcácnangcókíchthước3mmchiếmưuthế [33].

Mùa vụ có ảnh hưởng đáng kể tới chất lượng buồng trứng, từ đó ảnh hưởng tớisố lượng và chất lượng trứng đủ tiêu chuẩn đưa vào TTON Việc đánh giá ảnh hưởngcủamùađốivớihoạtđộngcủabuồngtrứngvàkhảnăngcungcấpcũngnhưchấtlượngtrứng đã được Kumar và cs tiến hành [34] Theo đó, trung bình số lượng nangtrứng/buồng trứng và trung bình số thể vàng/buồng trứng trong mùa đông cao hơn sovới mùa có gió mùa Số lượng tế bào trứng thu được từ các nang phát triển từ trứngthu vào mùa đông cao hơn đáng kể số với 2 mùa còn lại (mùa hạ và mùa gió mùa)(6,24±0,42trứng sovới3,78±0,1trứng). Suzukivàcs,2010đãnghiêncứuảnhhưởngcủamùa(liênquanđếnnhiệtđộkhíquyển)đốivớis ựpháttriểnphôitrongốngnghiệmđượctạorabằngphươngpháptiêmtinh vào trứng thành thục (ICSI) Tỷ lệ hình thành phôi nang từ trứng thu vào mùa đông(48%)lớnhơnsovớicácmùa:xuân,hạvàthu(24%,21%và19%)chothấykhảnăngphát triển tế bào trứng của lợn bị ảnh hưởng bởi mùa Tốc độ hình thành phôi nangcũngcó sự tươngquannghịchvớinhiệtđộ[35].

Sốc nhiệt làm giảm đáng kể chất lượng trứng với các biểu hiện như giảm quátrình phát triển của tế bào cận noãn, quá trình giảm phân diễn ra chậm hơn, giảm tỷ lệtrứngsống,tỷlệtrứngxuấthiệnthểcựcthấp,giảmbiểuhiệncủacácgenmãhóaADNty thể và tăng phản ứng oxy hóa ở ty thể Nghiên cứu của Yin và cs cho thấy bề mặtmàng trong suốt của tế bào trứng có chứa các kênh vận chuyển TZP (transzonalprojection) giúp vận chuyển các chất chuyển hóa, trao đổi tương tác giữa trứng và tếnàocậnnoãntrongquốtquátrìnhpháttriểncủatrứng.Hiệntượngsốcnhiệtlànguyênnhânứcchế hoạtđộngtổnghợpcácsợiactin(F-actin)dẫnđếnsựgiánđoạnkênhvậnchuyểngiữa trứngvàtếbàocậnnoãn [36].

Hiện tượng suy giảm khả năng sinh sản ở lợn nái vào các tháng cuối mùa hạ vàđầumùathuđượcgọilàhiệntượngvôsinhtheomùa,thểhiệnngaycảtrongtrườnghợpc hănnuôicôngnghiệp.TheoBertoldovàcs,khảnănghìnhthànhphôinangvàomùađônglớn hơnsovớimùahạ(54,94±6,11%sovới21,09±5,59%).Trongmùađông,cáctrứngthuđượ ctừcácnangcókíchthướclớncótỷlệpháttriểnđếngiaiđoạnphôicaohơnđángkểsovớicáctếb àotrứngđượcthutừcácnangnhỏ(54,94±6,11%sovới 23,17±6,02%).Sốlượng tếbào/phôinangở cácphôipháttriểntừcáctrứngthuởcácnangcókíchthướcnhỏđạtthấpnhấttrongmùahạ(24,25 ±1,48)vàđạtcaonhấtởcác phôi phát triển từ trứng của các nang lớn thu trong mùa đông (37,51±1,3, P3mm có thể phát triển đến giaiđoạn metaphaseIIsau48giờnuôiinvitro.

Tế bào trứng lợn thành thục trong ống nghiệm trong điều kiện cơ bản thường bịthiếu một số yếu tố mà hiện nay vẫn chưa được xác định, dẫn tới tỷ lệ phát triển củaphôithànhconconsaucấychuyểnphôirấtthấp.Bổsungdịchnangtrứnghoặctếbàocận noãn (cumulus cell) vào môi trường nuôi thành thục có thể được khắc phục mộtphầncáchạnchế này.

Môitrườngnuôitrứnglợnthànhthụccónhiềuloạikhácnhau,cóthànhphầnđơngiản hoặc phức tạp, tuy nhiên thông thường sẽ bao gồm môi trường nền (môi trườngHank với L-glutamine và Hespes) được bổ sung huyết thanh (fetal calf serum: FCS)hoặc dịch nang trứng (follicular fluid: FF) và các thành phần khác như gonadotropin,cácnhântốtăngtrưởngHormone(LH,FSH), Dibutyryl-cAMP(dbc-AMP)[4].

Trong đó môi trường TCM-199 và môi trường NCSU-23 được sử dụng rộng rãitrong các nghiên cứu nhằm tăng khả năng thành thục hoàn toàn của trứng phục vụTTON và NBVT Kết quả nghiên cứu đánh giá sự thành thục của trứng lợnin vitrotrong hai loại môi trường TCM-199 và NCSU-23 và bổ sung 10% dịch nang trứng(pFF) hoặc 0,1% PVA cho thấy tỷ lệ thành thục ở các lô thí nghiệm tương ứng là:TCM+PVA(54,5%-61/112);TCM+pFF(65,0%-63/97);NCSU-23+PVA(54,6%- 65/119) và NCSU-23+pFF (58,1%-61/105) Như vậy tỷ lệ thành thục của trứng trongmôitrườngTM199TCM+pFFđạtcaonhấtlà65,0%[44].

Liu và cs, 2011 cũng thông báo kết quả tương tự khi so sánh chất lượng trứngthànhthụcinvitrotrongcácmôitrườngTCM-199vàNCSU-23cóbổsungdịchnang trứng(pFF)hoặchuyếtthanhthaibò(FBS)vớitỷlệ10%cũngchokếtquảtươngtự.Tỷlệ trứng thành thục sau 42 giờ nuôi trong môi trường TCM-199, TCM-199+FBS,TCM-199+pFF, NCSU-23, NCSU- 23+FBS, NCSU-23+pFF tương ứng là: 54,2%,68,5%,69,3%,51,6%,63,2%và65,5% [45].

PyoosII và cs đã so sánh tỷ lệ thành thục và tỷ lệ xuất hiện thể cực của trứng lợnsau khi nuôi trong ống nghiệm với các loại môi trường NCSU-23, NCSU-37 và môitrườngTCM- 199cóbổxungyếutốtăngtrưởngbiểubì(EGF/TCM-199).Kếtquảchobiếttỷlệtrứngthànhthục vàtỷlệtrứngxuấthiệnthểcựctrong môitrườngNCSU-37đạt85,9%và81,9%- caohơnsovớihaimôitrườngcònlại[46].

Yuka và cs cho biết, tỷ lệ trứng thành thục và tỷ lệ trứng xuất hiện thể cực trongmôitrườngTCM-199vàmôitrườngNCSU-23khôngcósựkhácbiệtvềmặtthốngkêvớicác tỷlệtương ứnglà: 77,1%và72,5%so với77,1%và72,7%[47].

Ngoài ra, một số tác giả sử dụng môi trường cơ bản nuôi trứng (Porcine oocytemedium: POM) làm nền cho môi trường nuôi thành thục Theo Yoshioka và cs, 2002bổ sung 3 mg/mL polyvinyl alcohol (PVA),50 μmol/L β-mercaptoethanolmol/L β-mercaptoethanol (β-ME), 10IU/mL chorionic gonadotropin từ huyết thanh thai ngựa (pregnant mare serum: eCG),10 IU/mL chorionic gonadotropin human (hCG) và 1.0 mmol/L dibutyryl cyclicadenosine monophosphate sodium salt (dbcAMP) cho kết quả trứng đạt được tỷ lệthànhthụccaohơnso vớimôitrườngnuôicơbản.

Hiện tại, hệ thống TTON tại các nước phát triển thường cho kết quả 85- 90%trứng thành thục sau khi nuôi từ 44-46 giờ ở điều kiện 39 O C, 5% CO2, 5% O2, 90%N2,độẩmbãohòa [48] [49].

Kếthợphàihòasựthànhthụctếbàochấtvàthànhthụcnhâncủatrứngtrongquátrình nuôiin vitrolà yếu có ảnh hưởng quan trọng lên chất lượng thụ tinh và sự pháttriển phôi Do trứng lợn thu từ các nang khác nhau có quá trình thành thục nhân và tếbào chất không đồng nhất, sự khác biệt đáng kể về nồng độ steroid, lượng tế bàogranulosavànồngđộLHtrongdịchnangtrứngcóthểảnhhưởngđángkểlênthờigiancần thiết để trứng phát triển đến giai đoạn metaphase II [50] So với trứng thành thụcinvivo,trứngthànhthụcinvitrothườngcótỷlệxâmnhậpcủatinhtrùngvàtỷlệphânchia thấp hơn,sự phát triển của tiền nhân thường không đồng pha và tốc độ phát triểnphôichậmhơn[51].Điềunàychứngtỏcácđiềukiệnnuôithànhthụcinvitrocóthể chưa đáp ứng đầy đủ các yếu tố cần thiết để bảo đảm chất lượng trứng khi tham giaquá trình TTON Việc bổ xung các yếu tố kích thích tổng hợp vào môi trường nuôitrứng trong 24 giờ đầu được xem là giải pháp có ảnh hưởng quan trọng đối với quátrìnhtạophôiinvitro.

Bổsung1mmol/LdibutyrylcAMP(dbcAMP)-mộthoạtchấtcAMPcókhảnăngthấm qua màng có tác dụng ức chế tạm thời sự phân chia giảm phân của trứng là mộtphát hiện có giá trị đột phá đối với quá trình nuôi thành thục trứng lợn Bổ xungdbcAMP từ có tác dụng tăng cường sự thành thục đồng bộ của nhân và tế bào chất,dẫn tới tăng tỷ lệ hình thành phôi nang từ 9% lên 22% [51] Bổ xung các yếu tố kiểmsoát mức độ phản ứng oxy hóa trong tế bào (reactive oxygen species -ROS) nhưglutathione (GSH), các hợp chất cysteine, cysteamine, glutamine, b-mercaptoethanol,dịch nang trứng, LH, EGF, pFF cũng góp phần hỗ trợ sự thành thục tế bào chất củatrứnglợn[52].

Trạng thái tế bào cận noãn cũng có ảnh hưởng đối với sự thành thục tế bào chất.Tế bào cận noãn bao quanh trứng có nguồn gốc từ các tế bào granulosa và đóng mộtvai trò quan trọng tới quá trình thành thục của trứng Ở động vật có vú, tế bào trứngcủacácnangthứcấpđượcbaoquanhbởimộtlớpcáctếbàocậnnoãnliênkếtchặtchẽvớinhau,t ạothànhphứchợptếbàotrứng-tếbàocậnnoãn(Cumulus-OocyteComplexes-

COC).Vàogiaiđoạnchuẩnbịrụngtrứng,cáctếbàocậnnoãntrởlênbôngtơi,nớirộngkhoảngcáchvàh ợpthànhlớpmàngnhầybaobọcxungquanhtrứng(Hình1.7) [53] Cấu trúc này cho phép tăng cường quá trình trao đổi các phân tử nhỏ (chấtdinhdưỡng,cáchormone.) , cáctínhiệuparacrinegiữa trứngvàcáctếbàonang. Bing và cs, 2002 [54] và Maedomari và cs, 2007 [55] cho biết tỷ lệ trứng thànhthục ở trứng có lớp tế bào cận noãn từ 2 lớp trở lên cao hơn nhiều so với trứng có íthơn2lớptếbàocậnnoãn.

Longvàcsđãtiếnhànhnghiêncứutácđộngtươnghỗgiữayếutốkíchthíchquầnthể bạch cầu hạt-đại thực bào (granulocyte macrophage colony stimulating factor: GM-CSF)vàdịchnangtrứng(pFF)nhằmmụcđíchcảithiệnhiệuquảthànhthụctrongốngnghiệm Kết quả cho thấy GM-CSF giúp cải thiện sự giãn cách và bông tơi của lớp tếbàocậnnoãn,kíchthíchsựtraođổicáchạtcorticalvàtythể,làcácbàoquancóvai

Sự phát triển của nang

Tổ hợp trứng và tế bào hạt

Giai đoạn Giai đoạn MI MII

Nang trước rụng trứng Nang thứ cấp

Tế bào hạt bông tơi tròquantrọngtrongviệcđiềuhòasựpháttriểncủatếbàovàchukỳtếbàonhưquátrình sản xuất năng lượng, các quá trình tăng sinh, biệt hóa, truyền thông tin và quátrìnhapoptosis[56].

Hình 1.7.Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thụccủatrứngđộngvậtcóvú [53].

Nhưvậy,đãcónhiềunghiêncứunhằmhoànthiệnhệthốngnuôitrứng,nângcaotỷ lệ trứng thành thục đồng bộ, chủ động nguồn nguyên liệu có chất lượng cho TTONvà NBVT Tuy nhiên, hiện nay chất lượng trứng trong ống nghiệm vẫn còn thấp hơnso với trứng thành thục tự nhiên trong cơ thể, nghiên cứu tạo được môi trường nuôitrứngcócácđiềukiệnvềlýhóagiốngnhưmôitrườngsinhlýtrongcơthểvẫnlànhữngvấnđềmởđối vớicôngnghệtạophôiin vitrotrênlợn.

TạophôilợnTTON,ảnhhưởngcủachấtlượngtinhtrùng,chếđộ thụtinh,nuôivàbảoquảnphôi

Thụ tinh trong ống nghiệm là một phương pháp hỗ trợ sinh sản mà tinh trùng vàtrứng được kết hợp ở ngoài cơ thể, là một quá trình khôi phục cơ cấu di truyền bị chiphối bởi nhiểu yếu tố ảnh hưởng, từ phương pháp bảo quản và hoạt hóa tinh, tác độngmôitrườngnuôithànhthụctrứng,chếđộthụtinhđếnmôitrườngnuôiphôivàphương phápbảoquảnphôi.

Bảoquảntinhtrùnglà mộtgiảipháphữuíchđểlưugiữlâudàinhữngvậtliệuditruyền có giá trị, có thể khai thác sau khi giải đông để tạo ra phôi thông qua kĩ thuậtTTON Nghiên cứu bảo quản tinh trùng lợn đã được tiến hành trong khoảng 30 nămnhằm mục đích tổ chức các ngân hàng tinh đông lạnh để phát triển các chương trìnhnhângiốngvàcảitạoditruyềntheophương thức chăn nuôicông nghiệp[57].

Thông thường có hai hình thức bảo quản tinh trùng lợn: bảo quản ngắn hạn ởnhiệt độ thấp trong khoảng 24 giờ tới một vài ngày và bảo quản dài hạn ở dạng đônglạnhtrongốngrạ hoặcdạngtinhviên.

Kếtquảbảoquảnlạnhtinhlợnởnhiệtđộ-79°CđãđượcPolgecôngbốvàonăm1952 [59] Các nghiên cứu đông lạnh sâu tinh trùng lợn theo hướng cải tiến hệ thốngđông lạnh tinh bò đã được các tác giả khác theo đuổi trong suốt giai đoạn 1950-

1960vớikếtquảhạnchế,tinhtrùngcóthểvậnđộngsaugiảiđôngnhưngkhôngcókhảnăngthụthai. ThànhcôngđầutiêntrongviệcsửdụngtinhđônglạnhđểthụtinhđãđượcPolgevàcsthôngb áovàonăm1970,tuyvậyviệcthụtinhvẫnphảithôngquacanthiệpgiảiphẫuđểbơmtrực tiếptinhvàovòitrứng [60].

Tinh lợn sau khi thu được tiến hành đông lạnh ở nhiệt độ thấp, sau đó được giảiđông và thụ tinh trực tiếp qua cổ tử cung với lợn cái đến giai đoạn đọng dục đã đượccác nhóm nghiên cứu khác báo cáo vào năm 1971 [60] [61] Kết quả phối giống bằngtinh đông lạnh cho thấy lợn nái được thụ thai và sinh con, con con sinh ra khỏe mạnh,mặcdù tỷlệthụthaivàsốlượngconsinhracònthấp.

RathDvàcs,1997sosánhchấtlượngphôilợnkhisửdụngtinhtươivàtinhđônglạnh cho thấy tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ hình thành tiền nhân và tỷ lệ phôi ở giai đoạn 2-4 tếbàokhisửdụngtinhđônglạnhvẫnthấphơnnhiềusovớitinhtươi(16%sovới58,7%)

[62] Tiến bộ về TTON với tinh đông lạnh đạt tỷ lệ hơn 70-80% trứng được thụ tinhvàphânchiađãđượccáctácgiảkháccôngbố[62] [63].

Nguồn tinh trùng sử dụng cho đông lạnh được khai thác chủ yếu bằng phươngpháp nhảy giá và sử dụng âm đạo giả Trên đối tượng lợn ngoại, lợn đực đến tuổitrưởng thành được huấn luyện riêng để khai thác tinh Trong các trường hợp đặc biệt,tinhtrùngcóthểđượcthutrựctiếptừmàotinhhoàn.NghiêncứucủanhómcáctácgiảNagai (1988) và Kikuchi (1998) cho thấy tinh trùng thu từ mào tinh hoàn có khả năngkhả năng chịu lạnh cao hơn so với tinh trùng thu được sau xuất tinh, có thể đông lạnhvà sử dụng để thụ tinh với trứng thành thục, tạo lợn con bằng cấy chuyển phôi ở giaiđoạn2-4tếbào[39],[64]. Quá trình thụ tinh tự nhiên diễn ra trong cơ thể con cái sau khi tinh trùng đượcxuấtvàoâmđạovàbơingượcdòngđivàotửcung.Tửcunghỗtrợquátrìnhhoạthóa,dichuyển củatinhtrùngvàquátrìnhthụtinhgiữatrứngvàtinhbằngcáchtiếtrasterol- bindingalbumin,lipoproteins,heparin,cácenzymephângiảiproteinvàglycosidasic.Đối với quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, tinh trùng được hoạt hóa bằng cách ủtrong môi trường có các chất được chiết xuất từ mào tinh hoặc trong môi trường xácđịnhcócácthànhphầntươngtựnhưtrongmàotinh.Phảnứnghoạthóatinhtrùng,liênquanđếnsự vậnđộng vàphảnứngacrosomecủatinhtrùng,quyếtđịnhsựthànhcôngcủaquá trình thụ tinhinvitro.

Dựatrêncácnghiêncứuvềhoạtđộngcủatinhtrùngtrongđiềukiệntựnhiên,cácphươngpháprử atinh,phaloãngtinh,lọctinhvàcácchếđộthụtinhthíchhợpđãđượcpháttriểnđểkíchhoạtquátrìnhho ạthóatinhtrongốngnghiệmvàhạnchếsựthụtinhđatinhtrùng[63] [65]. pH có vai trò quan trọng trong quá trình thụ tinh Độ pH thích hợp cho TTON ởlợn là 7,4 Tuy nhiên, Brown và Cheng (1986) đã thử nghiệm và nhận thấy tỷ lệ tinhtrùngxâmnhậptếbàotrứngđạtmứccaonhất(>89%)đốivớitinhtrùngđãđượchoạthóa ở 37 o C trong môi trường pH 7,8 trước khi đưa vào thụ tinh ở môi trường có pH7,4vànhiệtđộ39 o C[66].

Albumin huyết thanh bò BSA fraction V, dịch nang trứng, caffein là các yếu tốđượcbổsungvào môitrườngthụtinhđểhỗtrợhoạthóatinhtrùng.Fukuivàcs,1983đãkiểmtranhiềuyếutốhoạthó atinhsaugiải đôngvànhậnthấydịchnangtrứnglợn

Thành phần của môi trường thụ tinh, các loại phân tử, nồng độ tinh trùng, sự cómặt của các yếu tố kích thích có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thụ tinh và chấtlượngcủaphôi[68].

Muối,cơchấtnănglượng(glucose,pyruvate,lactate)vànguồnprotein,ionCa 2+ ,bicarbonate, Na + ,

K + là các chất cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng trong môitrườngthụtinhcơbảnởlợn.

Hiện nay, có nhiều loại môi trường thụ tinh khác nhau, nhưng 2 loại môi trườngcơ bản được sử dụng phổ biến là môi trường Tyrode’s albumin lactate pyruvate (TALP)bổ sung 3 mg/mL bovine serum albumin (BSA) và 1,10 mmol/L sodium pyruvate; vàmôi trường Pig-FM có chứa 90 mM NaCl,

12 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 0,5 mMNaH2PO4, 0.5 mM MgSO4, 10 mM sodium lactate và 10 mM Hepes (có chứa 8 mMCaCl2,2mMsodiumpyruvate,2mMcafein,5 mg/mlBSA)[69].

Bổ sung 10 mg/mL BSA và 2 mmol/L caffein vào môi trường thụ tinh có tácdụngtăngtỷlệtạophôitốtvàconconđượcsinhrasaucấyphôiđốivớitrứnglợnđượcnuôi thành thụcin vitrovà thụ tinh với tinh trùng đông lạnh [40], Yue Zhang Ngoàitác dụng hỗ trợ hoạt hóa tinh, BSA có khả năng kết dính cholesterol và kẽm nên cònđóng mộtvaitròquantrọngtrongviệctáchbỏcác phântử nàykhỏitinh.

Bổsungdịchnangtrứng(pFF)vàomôitrườngnuôitrứngvàmôitrườngthụtinhlàm tăng đáng kể tỷ lệ tinh trùng xâm nhập, tỷ lệ hình thành tiền nhân đực, tỷ lệ phânchiavà pháttriển của phôi đếngiai đoạn phôi nang[70].

Môi trường nuôi phôi lợn luôn đẳng trương, chứa các ion cần thiết cho quá trỡnhsống của phụi (Na+, K+áCa++, Mg++, PO 4 3++ , Cl-),hệ đệm bicarbonate (HCO3) và cáckhángsinhđểtránhnhiễmkhuẩnvàmộtlượngproteintốithiểu.

Môi trường NCSU-23 đã được sử dụng để nuôi phôi lợn trong ống nghiệm từnăm 1993 [43] Kikuchi và cs, 2002 thông báo tỷ lệ hình thành phôi nang đạt 25,3%khi nuôi phôi lợn trong môi trường North Carolina State University- 37medium(NCSU-37) cú chứa 4mg/ml BSA và 50 àM β-mercaptoethanol, bổ sung

PyrLac)trong2ngàyđầu,vàsử dụngmôitrườngnềncóbổsung5.55mMD-glucose(IVC-Glu)trong5ngàytiếptheo[71].

Các môi trường Porcine Zygote Medium-3 (PZM-3) và PZM-5 được cho là cóhiệu quả tạo phôi cao hơn và bắt đầu được sử dụng nhiều hơn những năm gần đây.Yoshioka và cs, 2002; Li và cs, 2013, Nie và cs 2016 cho biết môi trường nuôi phôiPZM-3baogồmcácthànhphầncủadịchốngdẫntrứnglợnvàcácaminoacidbổsunghỗ trợ sự phát triển của phôi trong giai đoạn phôi nang nhiều hơn so với môi trườngNCSU- 23.Tỷlệhìnhthànhphôinangvàsốtếbào/phôinangcủaphôiđượcnuôitrongmôi trường PZM-3 đều cao hơn so với phôi nuôi trong môi trường NCSU-23 (15,2%sovới9,6%)và(23,6tếbàovà21,4tếbào)[72],[73], [74].

8 [76] thông báo đối với hệ thống nuôi phôi ống nghiệm trong môi trường PZM5.ChođếnnayhệthốngTTONđãđượccảitiến,hiệusuấtthụtinhcũngtăngcao, tỷ lệ hình thành phôi nang ở các hệ thống TTON tại các nước tiên tiến trên thế giới cóthểđạttrên60% [77],[78].

Trở ngại lớn nhất ảnh hưởng tới hiệu quả tạo phôi tạo phôi lợnin vitrolà hiệntượng thụ tinh đa tinh trùng (polyspermic) Tỷ lệ phôi đa tinh trùng ở lợn có thể daođộng từ 13% đến 90% [79] Hệ quả của sự thụ tinh đa tinh trùng là sự hình thành cácthể phôi lưỡng bội, tam bội và thậm chí là thể khảm chỉ có thể phát triển bình thườngtới mộtgiaiđoạnnhấtđịnh[80].

Khả năng màng sáng (zonae pelucidae-ZP) không hoàn thành quá trình đóng lạihoàn toàn sau sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên là nguyên nhân trực tiếp gây ra sựthụ tinh đa tinh trùng Wang và cs cho biết, màng sáng của tế bào trứng thành thụcinvivotrảiquaquátrìnhpháttriểntựnhiênthườngmỏnghơnsovớimàngsángcủatrứngđượcnuô ithànhthụctrongốngnghiệmvàsựkhácbiệtcóýnghĩathốngkênàylàmộttrongnhữngnguyênnhân dẫntớitỷlệđathụtinhtrongTTONcaohơnsovớithụtinhtựnhiêntrongcơthểconcái [81].

TạophôilợnbằngkĩthuậtNBVT

NBVT là kĩ thuật tạo ra những bản sao của một cá thể mà không qua sinh sảnhữu tính Cơ thể sống đầu tiên được tạo ra nhờ kĩ thuật NBVT theo phương pháp nàylàchúcừuDollysinhngày5tháng 7năm1996tạiViệnNghiêncứu Roslin[101].

Về nguyên lý, NBVT là quá trình phục hồi lại khả năng toàn năng(Totipotency)của các tế bào lưỡng bội đã biệt hóa nhờ các phương pháp mã hóa lại (geneticreprograming) và tạo điều kiện cho chúng phát triển theo kiểu phôi dưới sự tác độngcủa các yếu tố môi trường tế bào chất của trứng NBVT là một giải pháp công nghệnềntảngtrongviệcpháttriểnứngdụngcôngnghệsinhhọcsinhsảnđểbảotồnđadạngsinhhọcđộn gvậtvàpháttriểncáccôngnghệysinhtronglĩnh vực tếbàogốcvàtái

Tế bào cho được loại màng Phôi nang

Loại ADNĐưa tế bào trứngcho vào trứng

Dung hợp trứng và tế bào Phôi phát triển Kích hoạt tạomôtạng[102]. Để nhân bản bằng kĩ thuật chuyển nhân cần có hai tế bào, một tế bào trứng vàmột tế bào cho nhân (Hình 1.9) NBVT được tiến hành qua các bước: 1) Định vị nhântế bào trứng; 2) Mở màng sáng của trứng; 3) Hút và loại nhân của tế bào trứng để loạibỏ hầu hết thông tin di truyền của trứng; 4-5) Ghép tế bào cho nhân được đưa về giaiđoạn G0 (Pha không hoạt động) vào trứng 6) Dung hòa tế bào cho nhân với tế bàotrứng đã loại nhân.7) Kích thích để tạo hợp tử và 8) Nuôi phôiin vitrovà cấy chuyểnphôivàotử cungmẹnuôihộđểpháttriểnthànhbàothai [83].

Yếu tố kĩ thuật ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả của NBVT Các kĩ thuậtNBVTphổbiếnlàkĩthuậtkinhđiểnsử dụng kínhhiểnviviphẫuthuậtđểloạivàcấynhân bằng kim vi tiêm, kĩ thuật loại và cấy nhân bằng kết hợp kính hiển vi vi phẫuthuật có gắn hệ thống piezo và kĩ thuật handmade cloning-ghép tế bào chất trên kínhhiểnvinổiđãđược thực hiệntừ nhữngnăm2007 [104].

Kĩ thuật Roslin là kĩ thuật kinh điển được các tác giả Ian Wilmut và CampbellcảibiênvàthựchiệnởViệnNghiêncứuRoslin.Trongđó,cáctếbàosinhdưỡng(chứanhân) được nuôi cấy, phân chia và sau đó được nuôi tiếp trong môi trường thiếu chấtdinh dưỡng để các tế bào rơi vào giai đoạn không hoạt động Tế bào sinh dưỡng đượcđặt cạnh tế bào trứng đã loại bỏ nhân và tiến hành sốc xung điện để tạo thành phôi[101].

Mỗi kĩ thuật đều có ưu điểm và hạn chế riêng Wakayama và cs, 1999 công bốđãnhânbảnthànhcông50chuộttừcáctếbàođãtrưởngthành.Kĩthuậtnhânbảnmớido Wakayama phát triển được chứng minh là hiệu quả hơn phương pháp đã được sửdụngđểnhânbảncừuDolly.SửdụnghệthốngPiezođểtiêmtrựctiếptếbàochonhân vào tế bào chất của trứng cho phép tạo tỷ lệ tái hợp trứng-tế bào cho ở mức dao độngtừ79%-95%[105].

Cho tới nay, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công NBVT các loài độngvật khác nhau Tuy nhiên, hiệu quả NBVT vẫn còn thấp, tỷ lệ phôi NBVT có thể pháttriểnthànhcáthể conchỉđạtđượcgiớihạn1-3%[103],[106].

Quátrìnhtáilậptrìnhkhôngđầyđủởgiaiđoạnsaucấynhânlànguyênnhândẫnđến những khiếm khuyết trong hệ gen của phôi NBVT và sự phát triển không bìnhthường của chúng ở các giai đoạn bào thai. Theo quy luật thông thường, sau khi thụtinh,mộtloạtquátrìnhmethylhóa ADNvàhistonesẽđượctriểnkhaiđểxâydựngbộnhiễm sắc thể ban đầu của phôi Tuy vậy, cho tới nay các kĩ thuật NBVT vẫn chưahoàn toàn khống chế được một số biểu hiện bất thường trong quá trình mã hóa lại ởphôinhânbản[105] [103].

TheoBlellochvàcs,2006trongkhiphầnlớncácgenđượctáitậptrìnhmộtcáchchínhxácthìcó mộthoặcmộtsốnhómgentrongtếbàochonhânkhôngđượclậptrìnhlại, lập trình lại không chính xác hoặc lập trình lại không đúng thời điểm thích hợp,dẫntớithayđổicấutrúcgenvàbiểuhiệnrakiểuhìnhkhôngbìnhthường[107].

NBVT khác loài là kĩ thuật tạo phôi do cấy nhân tế bào cho nhân của một loàinày vào trứng đã loại nhân của loài khác (Interspecies somatic cell nuclear transfer -iSCNT).NBVTkhácloàiđượcxemlàmộtgiảipháptiềmnăngđểtáitạo,bảotồncácloài động vật quý hiếm đã và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng và việc áp dụng biệnphápphối giốngtựnhiênhoặc thụtinhnhântạokhôngmanglạikết quảkhảthi.

Wells và cs, 1998 đã công bố nhân bản thành công cá thể bò đảo Enderby (là cáthể duy nhất còn sống sót của giống gia súc quý hiếm bị de dọa tuyệt chủng) Kết quảtrong số 22 phôi được cấy chuyển, có 2 bê con được sinh ra và một bê sống và trưởngthành Các phân tích ADN xác nhận rằng những bê con này giống hệt nhau về mặt ditruyềnvớibòđảoEnderby[108].

Năm 2000, Lanza và cs sử dụng tế bào sinh dưỡng bò tót (Bos gaurus) để cấynhân vào trứng bò nhà đạt tỷ lệ 12% hình thành phôi nang và có 18% số phôi có khảnăng làm tổ sau cấy phôi vào bò nhận hộ, trong đó có 3 phôi phát triển đến giai đoạnbàothai46ngàytuổi,2phôipháttriểnđếngiaiđoạn180-200ngàytuổi.Cácphântích tếbàohọcxácnhận thaiđượctạoracóbộgencủabòBos Gaurus[109].

Từ năm 1999, các nghiên cứu NBVT trên mô hình cấy nhân bào sinh dưỡng củacác loài chuột, khỉ vào trứng bò đã loại nhân đã xác nhận khả năng phát triểnin vitrocủaphôi NBVT khác loàicó khoảngcáchditruyềncáchxa [110].

Phương pháp nhân bản khác loài cách xa đang được sử dụng ở Việt Nam nhằmtạo ra phôi từ các tế bào sinh dưỡng của các loài thú quý hiếm, có nguy cơ bị tuyệtchủngnhư MangLớn,Saola,LợnBản[111].

Sau khi cừu Dolly ra đời vào năm 1996, các nhóm nghiên cứu đã tích cực pháttriển và cải tiến hệ thống NBVT trên lợn nhằm mục đích sản xuất động vật biến đổigen và tế bào gốc phôi ở lợn Do lợn là loài động vật đặc biệt quan trọng, được nuôiphổbiếnởnhiềunướcvàcóýnghĩalớnđốivớingànhnôngnghiệp,ngoàiradocósựtươngđồn gvềmặtditruyền,giảiphẫuvàsinhlývớiconngườilợnlàloàiđộngvậtcógiá trị làm mô hình nghiên cứu các bệnh ở người và phát triển các liệu pháp điều trịmới[112,113].

Cuộc chạy đua nghiên cứu để sản xuất phôi lợn bằng phương pháp NBVT đãđem lại một số thành tích đáng ghi nhận vào những năm 2000 Các nhóm nghiên cứucủa Onishi và Polejaeva đã thông báo thành công trong việc tạo lợn nhân bản [114],[115].

NghiêncứutạophôilợnBảnin vitro

Mộtsốđặcđiểmhìnhtháivàsinhsảncủalợn Bản

Việt Nam có nguồn đa dạng phong phú các giống lợn mini bản địa được nuôithuầntừ rấtlâuđờiở cácbảnngườidântộcthiểusố[52].

LợnBảnlàgiốngvậtnuôibảnđịa,đượcdântộcMán,Mườngnuôitừrấtlâuđờibằngphươngt hứcnuôithảtựdo,mộtsốítnuôinhốtnhưngkhôngthâmcanh,chỉchoăn bằng thức ăn tận dụng (rau rừng, bột ngô, phụ phẩm ) Lợn Bản có ưu điểm là cósứcđềkhángcaovớidịch bệnh,chấtlượngthịtthơmngon. Lợn Bản thuộc lớp động vật có vú (Mammalia), Bộ guốc chẵn (Artiodactyla),Họ:Suidae,Chi:Sus,Loài:Susdomesticus.

Hiện nay,quần thểlợn Bản có khoảng 30.000-32.000 con nhưng đã bị lai tạpnhiều,phânbốởkhắpcáchuyệnvùngnúicaocủatỉnhHòaBình,trongđóchủyếutậptrungởĐàB ắc,CaoPhong,LạcSơn,MaiChâu,TânLạc[130].

LợnBảncótầmvócnhỏ,khitrưởngthànhđạt45-50kg/ con.Khốilượnglợnlúc4thángtuổiđạt6,51 kg,5thángtuổi8,85 kg,6thángtuổi12,10kgvàđến8thángtuổi là22,60-31,85kg[131].

Chu kỳ động dục 21-22 ngày, số ngày động dục 5-6 ngày, tuổi bắt đầu động dụcở lợn cái là 5-6 tháng tuổi, tuổi lợn đực thành thục là 7-8 tháng tuổi Nhìn chung, lợnBản có năng suấtsinh sảnkém, tuổi phối giống lần đầu là 208,02 ngày khi lợn đạt32,80 kg Tuổi đẻ lứa đầu là 13 tháng tuổi Số con đẻ ra 5,58-9,06 con/ổ Số lứa đẻ/năm:1,2-1,2;sốcon/lứa: 6-7 con, khốilượng lợn concaisữa 4-5kg [52][132].

Lợn Bản được xem là đối tượng lý tưởng đối với công nghệ ghép mô tạng khácloài(xenotransplantation)donócóđặcđiểmvềkíchthước,hệgentươngđồngvớiconngười.Ngoài ra lợn Bản là giống lợn duy nhất hiện nay có số lượng bản sao PERVthấp, vì vậy chúng có tiềm năng to lớn trong nghiên cứu và ứng dụng y-sinh đặc biệtlàcấytạngkhácloài[1],[2].

Nghiêncứunuôithànhthụct r ứ n g v à t ạ o p h ô i l ợ n B ả n t ạ i V i ệ t Nam

Hầu hết các nghiên cứu sinh sản và tạo phôi trước đây đều tập trung trên giốnglợnlaiđượcnuôicôngnghiệp,cácnghiêncứu trêngiống lợnBảnvẫn rấthạnchế.

Các thí nghiệm về nuôi thành thục trứng và tạo phôiin vitrotrên lợn Bản đượctriển khai lần đầu tiên trong khuôn khổ dự án hợp tác khoa học Việt-Nhật (JSPS- VAST,2005-2007)vềnghiêncứuứngdụngcôngnghệsinhsảnđểbảotồngiốnglợnnày.Tạibáo cáo trình bày tại Hội nghị thường niên của Hội Cấy phôi quốc tế IETS 2006,Nguyen và cs đã công bố thành công trong việc tạo được phôi lợn Bản NBVT ở ViệtNam Kết quả nghiên cứu cho biết tỷ lệ trứng lợn Bản thành thục sau khi nuôi trongống nghiệm là 52,8%, tỷ lệ phôi nang NBVT từ trứng lợn Bản và tế bào sinh dưỡnglợnBảnlà12,5%, kếtquảnàycònrấtthấpsovớilợnngoại[133].

Cácphươngphápbảoquảnlạnhtinhlợnthutừ màotinhcủacáctácgiảKikuchivà Nagai [64] đã được áp dụng để bảo quản tinh lợn Bản với tỷ lệ 43% sống sau giảiđông.

Năm 2008, trong báo cáo công bố trên tạp chí công nghệ sinh học, Ước và csthông báo kết quả nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa bằng tổ hợp công nghệTTON và NBVT [134] So sánh kết quả tạo phôi trinh sản bằng phương pháp ghépphôi không màng sáng bằng kích thích xung điện cho thấy tỷ lệ phôi nang ở lợnBảnđạt16%,thấphơnsovớitỷlệ20%phôinangởlợnLandrace.Cáctácgiảcũngđãtiếnhànhthàn hcôngthínghiệmthửnghiệmtạophôiNBVTbằngcấynhântếbàosinh dưỡng của lợn Bản vào tế bào trứng của lợn Landras, với tỷ lệ hợp nhất giữa trứng vàtếbàođạt70%và tỷlệphôinangđạt12%.

Nguyen và cs, 2015 đã tiến hành so sánh tỷ lệ trứng thành thục của trứng lợnLandracevàtrứnglợnBảnthutừbuồngtrứngcóvàkhôngcókíchthíchpháttriểnnagbằng gonadotropin Kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷlệ thành thục giữa 3 lô thí nghiệm trên (66,2±7,1%; 55,6±2,8%; và 47,1±1,0% tươngứng theo thứ tự trên) Tuy nhiên, số trứng loại A-B/BT và tỷ lệ phôi TTON phát triểnđếngiaiđoạnphôiđượccảithiệnđángkểđốivớicáctrứnglợnBảnđượcthutừtrứngcókích thích(26,7sovới17,4và10,5%sovới4,0%)[135].

Như vậy, kết quả nghiên cứu đã được công bố trên đối tượng lợn nội nói chungvà lợn Bản nói riêng vẫn còn khiêm tốn so với các kết quả tạo phôi trên các giống lợnnuôi công nghiệp với tỷ lệ khoảng 40%-60% phôi TTON có thể phát triển đến giaiđoạn phôi nang Việc đầu tư để có nhiều nghiên cứu hơn nữa về ảnh hưởng của chấtlượngtrứng,điềukiệnmôitrườngvàchếđộthụtinh,môitrườngnuôiphôilàcầnthiếtđểhoànthi ệnhệthốngtạophôiốngnghiệmổnđịnh,làmcơsởđểpháttriểncácnghiêncứu ứng dụng bảo tồn đa dạng sinh học, tạo nguồn tế bào gốc và mô hình nghiên cứucấytạngkhác giốngtrênđốitượnglợnBản.

Vậtliệu, hoáchấtnghiêncứu

Mẫunghiêncứu

Trongphạmvicủaluậnánnày,chúngtôichỉnghiêncứuduynhấtmộtgiốnglợnbản địa đó là giống lợn Bản được nuôi tại tỉnh Hòa Bình Mẫu vật gồm: Buồng trứng,trứng, tinh trùng, tế bào sinh dưỡng được thu từ giống lợn Bản tại tỉnh Hòa Bình vàgiốnglợnLandracethutừ lòmổ.

Các cá thể lợn Bản khỏe mạnh, không bệnh tật được cán bộ chuyên môn thuộcViện chăn nuôi quốc gia trực tiếp chọn lọc từ các hộ dân thuộc tỉnh Hòa Bình với cácđặc điểm: Thân hình gọn, chắc chắn, bụng không sệ, có 7-8 vú, mình ngắn, tai nhỏ,mặtnhỏ,mõmdàinhọn,cólailịchrõràng,cóchếđộchămsóc,nuôidưỡngđươngđốiđồngđều,lợn ởgiaiđoạn8-10thángtuổi,cânnặngtừ35-

40kg,đãthànhthụcvềtính.LợnđượcvậnchuyểnvềHàNội đểgiếtmổ,thubuồngtrứngvàtrứng.

Tinh trùng lợn Bản được thu từ mào tinh của lợn đực đã thành thục (8-10 thángtuổi),khỏemạnh,khôngdịtật.Ngaysaugiếtmổ,tinhhoànđượcthu,bảoquảnở25 o Cvà vận chuyển về phòng thí nghiệm Tinh dịch được thu từ ống dẫn tinh và đông lạnhtrong cọng rạ, sau đó được bảo quản trong bình nitơ lỏng tại phòng Công Nghệ Phôi-ViệnCôngnghệsinhhọc.

6thángtuổi,chọnlợnkhỏemạnh,khôngdịtật.Tếbàosaukhinuôicấyđượcđônglạnhtrongnitơlỏngt ạiphòngCôngnghệphôi-Việncôngnghệsinhhọc.

Buồng trứng lợn Landrace được chọn lọc từ các cá thể lợn Landrace có lai lịchrõràngdướisựliênhệvàgiámsátcủacánbộchuyênmônphòng Côngnghệphôikếthợp với lò mổ của Công ty trách nhiệm hữu hạn Minh Hiền (Bích Hòa-Thanh Oai-HàNội) để đảm bảo buồng trứng được thu từ các cá thể lợn

Landrace khỏe mạnh, biết rõnguồngốcxuấtxứvàquátrìnhnuôidưỡngchămsócđồngđều,lợnởgiaiđoạn5tháng tuổi,chưaquasinhsản,buồngtrứngsángmàu,nangmọngvàkhôngbịtụmáu,khôngchứathểvàng.

Địađiểmnghiêncứu

Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu trong luận án được thực hiện tại Phòng ôngnghệPhôi-Việncôngnghệsinhhọc-

ViệnHànlâmKhoahọcvàCôngnghệViệtNam,số18HoàngQuốcViệt,NghĩaĐô,CầuGiấy,H àNội.

Hóachấtvà thiếtbị

Hóa chất:TCM-199 dạng bột (chứa muối Hank và L-glutamine, không cóNaHCO 3 , Hepes (Sigma, M0393), Cysteine (Sigma, C7352), eCG (Serotropin, 1000IU/tube), hCG (Puberogen, 1500 IU/tube: Sankyo), dbcAMP (Sigma, D0627), BetaMercaptoethanol(Wako),NaCl(Nacalai,31320),KCL(Nacalai,28514),CaCl2.2H2O(Nac alai,0 6 7 3 1 ) , K H 2PO4( N a c a l a i ,2 8 7 2 1 ) , M g S O4.7H2O( N a c a l a i , 21003), Glutamine (Nacalai, 16919), Phenol red sol (Sigma, P0290), Nước (Sigma), FBS(Hyclone,A2151),pFF(NIAS-J),Calciumlactate(Sigma,L4388),D- glucose(Nacalai,16806),NaHCO 3(Nacalai, 31213),NaH2PO4.H2O(Nacalai,31720),MgSO

4.7H2O (Nakalai, 21003), Sodium lactate (60% syrup; Sigma, L7900), Hepes(Dojindo 346-01373), CaCl2.2H2O (Nacalai, 06731), Sodium pyruvate (Sigma P2256),Caffeine (Sigma, C7731), BSA (Fatty acid free; Sigma, A8806), Na-Lactate (60%syrup, Sigma L7900), Sorbitol (Sigma, S1876), D-Glucose (Sigma G-7021), Glucose(Nacalai,

16806), Paraffine (Nacalai, 26031), Vaseline (Wako: 224-00165),PVA(Sigma P-

8136), Penicillin-G (Sigma P-3032), Streptomycin sulfate (Sigma S-9137),Caffeine- sodium benzoate (Sigma C-4144), Ca-lactate2(Hemicalcium salt; Sigma L-4388), Ca-(lactate) 2.5H2O, L-Glutamax (200 mM stock, 100x), Hypotaurine, BMEAmino Acids Solution (50x, Sigma), MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100x, Sigma), L-cysteine, Tripsin EDTA, Cytochalasin B, NaHCO3(Sigma S-5761),kháng sinh, PVA (Sigma P-8136), Penicillin-G (Sigma P-3032), Streptomycin sulfate(Sigma S-9137), Phenol red (Sigma P-5530), D-

DMEM.PVP,Hoechst33342(Sigma14533),PolyinylPyrolidone(SigmaPVP40),D-

Môitrườngthaotác,nuôicấy,bảo quản

Các môi trường bảo quản, nuôi cấy tế bào trứng, tinh, phôi, tế bào, môi trườngthaotác,môitrườngđônglạnhtinhvàtế bàođược trìnhbàytrong Phụlục 2.

Phươngphápnghiêncứu

Phânloạithángtheo mùa

Phương pháp phân loại mùa được tính theo khí tượng dựa vào nhiệt độ:Mùaxuântừ 1/3đến31/5

Phươngpháp thu,bảo quảnbuồngtrứng

Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng được thực hiện theo Ước và cs, 2008[134] Buồng trứng được thu từ lợn cái khỏe mạnh ngay sau khi mổ lợn, cắt và thuphần buồng trứng và ống dẫn trứng, rửa sạch 3 lần với nước muối sinh lý 0,9% có bổsung0,24mg/mlkhángsinhGentamicin,bảoquảnở37 o Cvàvậnchuyểnvềphòngthínghiệm.

Tại phòng thí nghiệm, dùng kéo vô trùng cắt bỏ hoàn toàn phần cuống và ốngdẫn trứng, lau sạch máu Rửa 3 lần trong nước muối sinh lý 0,9% có bổ sung0,24mg/mlkhángsinh Gentamicin.Quátrìnhthaotácluôngiữbuồngtrứngở37 o C.

Phươngphápđokíchthướcvàkhốilượngbuồngtrứng

Được thực hiện theo phương pháp của Nguyen và cs, 2015 [135], theo đó buồngtrứng lợn sau khi thu và vận chuyển về phòng Công nghệ phôi được rửa sạch, cắt bỏống dẫn trứng Sử dụng thước kẹp cơ khí Mitutoyo 150 mm để đo 3 chiều của buồngtrứng (chiều dài, chiều rộng và chiều dầy) Khối lượng buồng trứng được xác địnhbằngcânđiệntửMettleToledorME54.

Phươngpháp phânchia nhómnang

Căncứvàokíchthướcbuồngtrứng,kíchthướcnangthựctếquansát,căncứvàophươngphápp hânloạikíchthướcnangtheoFoxcroftvàcs,1985[3]vàthựctếquan sátkíchthướccácnangtrênbuồngtrứnglợnBản,chúngtôiphânchianangbềmặtbuồngtr ứngtheocáckíchthướcsau:

Phươngphápthutrứng

TrứnglợnđượcthutheophươngphápcủaKikuchivàcs,2002[71].Buồngtrứngsaukhithuvềp hòngthínghiệmđượcrửasạchbằngnướcmuốisinhlýở37 o C3-5lần.Sau đó tiến hành thu các nang trứng có kích thước từ 2-6mm nhưng không thu nhữngnangtrứngcókíchthước quá to.

Phương pháp thu trứng được tiến hành là phương pháp rạch nang trứng. Dùngmũi dao số 11 rạch nang trứng, nhẹ nhàng xoay khắp trong nang để giải phóng tế bàotrứng.Phươngphápnàycóưuđiểmlàthuđượcnhiềutrứnghơn,tếbàotrứnghầunhưkhông bị ảnh hưởng do tác động cơ học Tuy nhiên, cần chú ý quá trình vô trùng đểtránhnhiễmtạp.

Sau khi thu xong dung dịch bao gồm: dịch nang trứng, trứng và các tế bào nangđược đưa vào ống 15 ml, giữ ấm ở 37 o C trong điều kiện vô trùng 10-15 phút nhằmmục đích cho trứng lắng xuống dưới đáy ống Dùng pipet hút bỏ đi phần dung dịchphía trên, thu phần lắng phía dưới cho vào đĩa nhựa petri vô trùng có chứa sẵn môitrườngthutrứng(TCM-199).

Trứngđượcthudướikínhhiểnvivớibộdâyhútvàkimcóđườngkínhthíchhợp(đã được vô trùng). Trứng sau khi thu sẽ được rửa lại 3-4 lần trong môi trường thutrứng (TCM-199), tiếp đó mới tiến hành phân loại trứng và đưa vào môi trường nuôi.Trướckhiđưavàomôitrườngnuôi,trứngđượcrửalại3lầntrongmôitrườngnuôiđểloạibỏd ungdịchrửatrứng.Toànbộthaotáchútvàthutrứngđềuđượcthựchiệntrongđiềukiệnvôtrùngở37 o C.

Phươngpháp phânloại chấtlượngtrứng

Trứng phân loại chất lượng dựa vào hình thái và số lớp tế bào cận noãn theophươngphápcủaKarja(2008)vàLeibfriedvà First(1979)[136][137].Thờigianhúttrứng ra khỏi buồng trứng đến khi phân loại trứng tiến hành càng nhanh càng tốt đểchất lượng của trứng không ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, ánhsáng.

Trứng loại A: Có từ 4 lớp tế bào cận noãn bao quanh trứng, các lớp tế bào cậnnoãn này dày, đều đặn, đồng nhất và liên kết chặt chẽ với nhau, tế bào chất của trứngđồngđều,toànbộtrứngnhìntrongvàđầyđặn.

TrứngloạiB:Cótừ2-4lớptếbàocậnnoãnbaoquanhtrứng,cáctếbàonàyliênkết không chặt chẽ, tế bào chất đồng đều nhưng hơi tối màu ở vùng ngoại vi trứng,toànbộtrứngnhìníttrongvàítđầyđặn hơn.

TrứngloạiC:Cóíthơn2lớptếbàocậnnoãnbaoquanhtrứng,cáctếbàocậnnoãnkhôngliênkết chặtchẽ,tếbàochấtkhôngđồngđềuvàtốimàu.

Phươngpháp đokíchthướctrứnglợn

TrứnglợnBảnđượcthutheomùa,chọntrứngloạiA+Bđểđokíchthước,khôngđo kích thước trứng loại C Phương pháp đo kích thước được thực hiện theo phươngpháp của Phòng công nghệ phôi-Viện công nghệ sinh học Loại bỏ tế bào cận noãntrong môi trường hyaluronidase 0,1% trong TCM-199 Hespes Trứng được đo đườngkínhbằngcáchsửdụngthịkínhmicrometgắntrênkínhhiểnvi(OK15KM;độphóngđại

150), mỗi tế bào trứng được thực hiện bằng 2 phép đo: đường kính có chứa màngsángvàđườngkính khôngchứamàngsáng,30trứngđãđượcđotrong mỗi mùa.

Phươngphápnuôitrứng

Thí nghiệm nuôi trứng được tiến hành với 5 loại môi trường: NCSU-37+ 10%pFF,NCSU-37+10% F B S , TCM-199+10% p F F , TCM-

199+10% FB S, POMcó b ổ sung 10ng/ml EGF Trứng lợn sau khi thu được nuôi theo phương pháp của Kikuchivà cs, 2002 [71] Theo đó trứng sau khi thu được rửa 2 lần trong đĩa chứa 2 ml môitrường nuôi Trứng được nuôi trong môi trường nuôi trong thời gian từ 44-46 h tùytừng loại môi trường trong đĩa 4 giếng với điều kiện vô trùng 5% CO 2 , 5% O2, độ ẩm95%, ở 38,5 o C Toàn bộ thao tác thu trứng và nuôi được thực hiện bằng kim thủy tinhdướikínhhiểnvi,trênbàn ấmvàtrongtủhútvôtrùng.

Phươngpháp đánhgiá thànhthục saunuôi

46giờđượctáchsạchlớptếbàocậnnoãnbằngmenhyaluronidasekếthợpvớikimthủytinh,rửa2- 3lầntrongmôitrườngnuôiđểsạchhếtlớptếbàocậnnoãn.Trứngsauđóđượcđượccốđịnhtrênlamkí nh và ngâm trong dung dịch cố định ethanol : acid acetic theo tỷ lệ 3:1 về thể tích(v/v) tối thiểu 3 ngày Sau đó trứng được nhuộm bằng thuốc nhuộm orcein 1% trong5- 7phút,rửabằngdungdịchAcetoglycerol(Acidacetic:glycerol:nước=1:1:3)tỷlệtheothểtích.Tiê ubảnđượcquansátdướikínhhiểnviphảnphacóđộphóngđại100-400 lần Dựa vào hình thái của nhân để đánh giá các giai đoạn phát triển nhân của tếbào trứng [137] Có ba giai đoạn phát triển chính của nhân:Trứng chưa thành thục(GerminalVesicle-

GV):Màngnhânchưatan,thấyrõnhân.Trứngbắtđầuthànhthục(MetaphaseI-

MI):Màngnhântan,nhiễmsắcthểởgiaiđoạnMetaphaseI.Trứngthànhthục(MetaphaseII-

MII):Trứngởgiaiđoạnnàyđãcóthểthụtinh,nhiễmsắcthểởgiaiđoạnMetaphaseII,cóthểquansátđ ược thểcựcthứ nhất.

Phươngpháp đônglạnhtinhtừmào tinh

Thực hiện theo phương pháp của Kikuchi và cs, 1998 [64] Thu 2 tinh hoàn từlợnđực,bảoquảnởnhiệtđộ25 o Cvàvậnchuyểnngayvềphòngthínghiệm.Táchlấyphần ống dẫn tinh Sử dụng đầu kim xilanh đã được mài bằng để đẩy tinh tịch từ ốngdẫntinh.Tinhdịchđượctrữtrongốnglytâm15mlvàgiữở15 o Ctrong2-

3giờ.Đánhgiáchấtlượngcủatinhdịchtrướcvàsauđônglạnhthôngquamộtsốchỉtiêu:Thểtíchtinhd ịch,hoạtlực củatinhtrùng,nồngđộtinh,tỷlệkỳhình…

-Môi trường: Môi trường pha tinh dịch, môi trường NSF.Ib và NSF.IIb (Phụ lục 2)đượclàmấmđếnnhiệtđộ30 o C-32 o Ctrướckhisử dụng

Pha loãng tinh dịch với môi trường pha tinh theo tỷ lệ tính toán (căn cứ vào sốtinhtrùngđếmđược trongbuồngđếm)

-Saukhiphatinhdịchvớimôitrườngphatinh,chuyểntinhdịchđãpha(Trongchậunướcấm) giữ ởnhiệtđộ15 o Ctrong2giờ.

-Sau 2 giờởbuồng nhiệt độ15 o C, kiểmtrahoạt lựcvàlytâm3000 vòng/phút ởnhiệtđộ15 o C, trong10phút,thuphầntinhtrùnglắngphíadưới.

Chúý:Nhỏtừnggiọtởnhiệtđộ15 o C,lắcnhẹđểtrộnđều,nhiệtđộmôitrườngNSF.Ibtươngđươngnhiệtđộti nhdịch(15 o C), khôngchạmđầupipetvàothànhống.

Chúý:Nhỏtừnggiọtởnhiệtđộ5 o C,lắcnhẹđểtrộnđều,nhiệtđộmôitrườngNSF.IIbtươngđươngnhiệtđột inhdịch(5 o C),khôngchạmđầupipetvàothànhống. Đóngtinhvàocọngrạ vàlàmđóngbăngtinh

-Sau khi trộn đềuvớiNSF.II, chotinhdịch vàocọngrạ0,25ml vàgiữở nhiệt độ

Saukhiđểcọngrạ10phútởnhiệtđộ5 o C,chuyểncọngrạchứatinhvàohộpđựngnitơlỏng ,cáchmặtnitơlỏng5cmtrongvòng 10phút.

-Saukhiđể trênhơinitơlỏng10phút,thảtrựctiếpcọngtinhvào nitơlỏng.

-Ghichép đầyđủcácthôngtincầnthiết(ngàytháng,đực giống,sốhiệu,.)

Phươngpháp kiểmtrachấtlượngtinhtrướcvàsauđônglạnh

Kiểmtrahoạtlực:Lấymộtgiọttinhdịchcholênbềmặtphiếnkínhkhô,sạch,đãđượclàmấm37 o C,đậ ylamen,cholênkínhhiểnvicóđộphóngđại200-

Kiểm tra nồng độ tinh trùng:Tinh trùng được pha loãng 200 lần trong môi trườngNaCl3%vàsửdụngbuồngđếmNeubauer(Marienfeld)đểxácđịnhnồngđộtinht rùng

- Đếmtinh:Lấy10àltinhđóphaloóngcholờnlờnbuồngđếm,đếmtinhtrựngcủa4ụtrongcựngmộth àng

Kiểmtratỷlệkỳhình:SốtinhtrùngkỳhìnhđượcxácđịnhbằngbuồngđếmNeubaver(Marienfeld) tương tự như phương pháp kiểm tra nồng độ tinh trùng Tỷ lệ kỳ hình

+)Đuôibấtthường:thườngcóđuôingắn,hoặccónhiềuhơn1đuôi,hoặctồntạicáchạttếbảo nhỏphíasauđuôi.

TTON được thực hiện theo phương pháp của Somfai và cs 2019 [138] (cải biêntheo phương pháp của Kikuchi và cs, 2002 [71] Trứng sau khi nuôi 44-46 giờ trongmôitrườngnuôi,sẽđượcgiữ nguyênhoặctáchbỏmộtphầnlớptếbàocậnnoãn.

Tinh trùng lợn đông lạnh giữ trong nitơ lỏng được giải đông ở 37 o C trong môitrường M199 pH 7,8 Sau khi loại bỏ dung dịch đông lạnh bằng phương pháp ly tâm,toàn bộ tinh trùng được giữ trong môi trường M199 ở 38,5 o C Tiến hành pha loóng10àl tinh dịch trong 2ml mụi trường NaCL 3%, tiến hành đếm bằng buồng đếm tinhtrùng-Makler Counting Chamber (Thermo scientific) Sau khi đếm, tính toán lượngtinh trùng cần thiết để pha loãng trong môi trường pig FM trong đĩa 4 giếng sao chođạt nồng độ tinh trùng mong muốn (thường là 1x10 5 tinh trùng/ml hoặc 1x10 6 tinhtrùng/ml).

Trứngvàtinhtrùngđượcthụtinhtrongmôitrườngthụtinh(PigFMhoặcTALP)trong thời gian 3 giờ. Sau 3 giờ, sử dụng ống hút pipet để tách sạch tinh trùng khỏitrứng,trứngsauđóđược nuôi trong môitrườngnuôiphôi. Để đánh giá khả năng thụ tinh thì sau 10 giờ tiến hành cố định trứng và nhuộmvới1%orcein. Để đánh giá khả năng phát triển của phôi, trứng sau khi thụ tinh 3 giờ được táchsạch tinh và nuôi trong môi trường nuôi 6-7 ngày Tiến hành kiểm tra tỷ lệ phân chiaởngàythứ 2saunuôi,tỷlệphôinang,sốtếbào/phôinangởcácngàythứ 5,6,7.

TrạngtháithụtinhcủatếbàotrứngđượcđánhgiásauTTON10giờtheophươngpháp của Ước và cs, 2008 [134] Tế bào trứng được cố định trên lam kính và lamen,sau đó được cố định trong môi trường 1 acetic acid: 3 ethanol trong ít nhất 5 ngày.Trứng được nhuộm với dung dịch thuốc nhuộm orcein 1% (Sigma) và rửa sạch bằngdung dịch glycerol: acid acetic: nước

(1:1:3) Đánh giá trạng thái thụ tinh bằng kínhhiểnvisoinổivớivậtkính10X.0.25(tươngđươngđộphóngđại160 lần).

+) Trứng thụ tinh bình thường: được xác định là trứng có sự xuất hiện của tiền nhânđựcvàtiềnnhâncáihoặc sựxuấthiệnđồngthờicủa đầu tinhtrùngtrongtếbàochất vàthểcựcthứ nhất vàthứ 2.

+) Trứng có tinh trùng xâm nhập: được quan sát khi thấy đầu của tinh trùng ở trongtrứnghoặc cótiềnnhânđựchoặc cảhai xuấthiệntrongtếbàochất.

+) Số trứng có tiền nhân đực: Trứng được thụ tinh bởi tinh trùng và tinh trùng đã hoạthóa để tạo tiền nhân đực (nhân của tinh trùng) Tiền nhân đực có kích thước lớn hơntiềnnhâncái.

+)Trứngthụtinhđơntinhtrùng:làtrứngquansátđượcduynhấtmộttếbàotinhtrùngbêntrongtếbào chất(xuấthiện1tiềnnhânđực hoặc 1 tiềnnhầncái).

Hợp tử sau thụ tinh 10 giờ được tiến hành đông lạnh theo phương pháp củaSomfaivàcs[138]vàNguyenKVvàcs,2018[99].Hợptửđượcrửatrongmôitrườngcơbản:NC SU-37khôngchứaglucose,bổsung20mMHepes,50mMβ- mercaptoethanol,pyruvatenatri0,17mM,natrilactate2,37mMvà4mg/ mlBSA(Môitrườngnền:Basemedium:BM).SauđóhợptửđượcchuyểnvàotrongmôitrườngBMbổ sung 2% propylene glycol-PG (29218-35, Nacalai) và 2% ethylene glycol-EG(E9129,Sigma- Aldrich)ở35°Ctrong13-15phút.

Hợp tử được chuyển tiếp vào môi trường đông lạnh là môi trường BM bổ sung50 mg/ml polyvinylpyrrolidone (P0930, Sigma-Aldrich), sucrose 0,3 M (19600015,Waco Pure Chemical Industries, Nhật Bản), 17,5% EG và 17,5% PG và ngay lập tứcchúng được chuyển lên tấm cryotop (Kitazato Biopharma, Shizuoka, Nhật Bản) vàngâmtrongnitơlỏng.

Saukhibảoquảnhợptửtrongnitơlỏngítnhất3tuần,cáchợptửđượcgiảiđôngđểkiểmtratỷl ệsốngvàpháttriển.Cryotopcóchứahợptửđượcbảoquảntrongnitơsẽđượcchuyểnnhanhsangm ôitrườngBMbổsung0,4Msucroseđãđượclàmấmở42°Ctrong1-

2phỳt.Tiếptheo,hợptửđượcchuyểnvàogiọt500àl mụitrường

BMbổsung0,05Msucroseở38°C,sauđóđược rửatrongBM vànuôitrong PZM-3.

Tỷlệsống/chếtcủahợptửđượcđánhgiábằngviệcquansáthìnhtháiởthờiđiểm2 h sau khi giải đông dưới kính hiển vi soi nổi Hợp tử được nuôi cấy và chất lượngphôiđượctheodõivàđánhgiáđếnngàythứ

2.2.15 Phươngphápthu,nuôitếbàosinhdưỡnglợn ĐượcthựchiệntheoNguyenvàcs,2015[135].Tếbàosinhdưỡnglợnđượcphânlập từ mảnh tai lợn khỏe mạnh, không bệnh tật ở giai đoạn 2 tháng tuổi, sau đó đượcrửasạch3lầnvớidungdịchđệmmuốiphosphate(PBS-)vàvậnchuyểnvềphòngởnhiệtđộ3

7 o C.TiếnhànhrửalạibằngPBSvàcồn,cạobỏphầndangoàivàlông,tiếnhànhthulớp biểu bì Cắt lớp biểu bì thành các mảnh nhỏ 1-2 mm và nuôi trong môi trườngDulbecco’sModifiedEagle’s(DMEM)cóbổsung10%FetalBovineSerum(FBS).Sau5n gàynuôi,tếbàobámkínđĩasẽđượccấychuyểnvàđônglạnh.Ởcáclầncấychuyển,tếbàosẽđượcki ểmtratốcđộtăngtrưởngthôngquaviệcđếmsốlượngtếbàobằngcáchsử dụng buồng đếm hồng cầu (hemocytometer) tại thời điểm trước và sau khi cấychuyển Trước khi chuyển nhân 3 ngày, tế bào được giải đông và nuôi trong DMEM0,2% FBS nhằm mục đích đưa tế bào về pha G0 Tế bào sử dụng cho chuyển nhân tếbàosinhdưỡnglànhữngtếbàoởcác lầncấychuyểntừ 2-7.

2.2.16 Phươngphápnhânnuôitếbào ĐượcthựchiệntheophươngphápcủaNguyenvàcs,2015[135].Tếbàosaukhibám kín đĩa (thường sau 5 ngày nuôi) thì tiến hành cấy chuyển Hút bỏ toàn bộ môitrường nuôi, rửa lại bằng dung dịch PBS-. Cho 250 àl mụi trường Tripsin EDTA 0,25%trongPBS- vàomỗiđĩanuụiỉ35mm.Đểtrongtủấm3phỳt,khitếbàobonglờnkhỏiđỏy đĩa, sục nhẹ nhàng và trung hũa bằng môi trường nuôi (DMEM 10% FBS) vớilượngbằnghoặclớnhơnlượngtripsin.Thutoànbộtếbàovàmôitrường,lytâm2000vòng/phút trong 3 phút Loại bỏ phần dung dịch phía trên, thu phần tế bào lắng ở phíadưới, thêm môi trường nuôi sau đó gieo tế bào vào đĩa petri với mật độ 110.000 tếbào/đĩaỉ35mmvànuơitrong2mlmơitrườngnuơi.

Sau 5 ngày tiến hành cấy chuyển lần tiếp theo Ở mỗi lần cấy chuyển, đếm tổngsố tế bào sau nuôi để đánh giá khả năng nhân lên và mức độ ổn định của tế bào quacác lần cấy chuyển cấy chuyển lần tiếp theo Phương pháp đếm tổng số tế bào đượcthực hiện tương tự như phương pháp đếm tổng số tinh trùng trong buồng đếm Neubauernhưđãtrìnhbày.

Môitrường Dầukhoáng Dầuoperation Khôngkhí Dầukhoáng ngày nuôi được rửa bằng PBS-và thu bằng phương pháp ly tâm sau khi xử lý trongtripsin EDTA 0,25% Tế bào sau đó được đông lạnh trọng cọng rạ trong môi trườngDMEM+10%Dimethylsulfoxide.Hạnhiệtđộxuống4 o Ctrong30phút,sauđóxuống0 o C trong60phút,hơinitơtrong30phút,sau đógiữ trongnitơ.

KimsửdụngtrongNBVTlàkimvithaotácBorosilicateGlasswithfilament,vớiđườngkínhngo ài1.0mm,đườngkínhtrong0.78mm,độdài10cm.Kimtheotácbaogồm3loại:

Kim giữ trứng: được kéo với độ dài từ 5-6 cm, thu nhỏ dần về 1 phía, đầu giữđượcmàitùvớiđườngkínhtrongkhoảng 15-20μmol/L β-mercaptoethanolm.

Kim loại nhân: được kéo với độ dài từ 5-6 cm, thu nhỏ dần về 1 phía, một đầuđượclàmnhỏvớiđườngkínhtrongkhoảng10-12μmol/L β-mercaptoethanolm.

Kim chuyển tế bào: được kéo với độ dài từ 5-6 cm, thu nhỏ dần về 1 phía, mộtđầuđượclàmnhỏ vớiđườngkínhtrongkhoảng8-10μmol/L β-mercaptoethanolm.

Tất cả các kim đều được làm cong 20-30 o để dễ dàng thao tác Môi trường thaotác, dầu khoáng, dầu operation, được chuẩn bị sẵn trong kim loại nhân hoặc kim cấynhân như hình 2.2 Việc chuẩn bị kim có tốt đảm bảo cho hệ thống piezo hoạt độngtốt,giúpchoquátrìnhloạinhânvàcấynhândễdàngthựchiện.

Hình2.2.Bốtrídầutrongkim 2.2.18.2 Loạinhân tếbào trứng

HệthốngmáyloạinhânvàcấytếbàovàotrứngsửdụnghệthốngmáypiezoPMM4G- ModelPMAS-CT4G(41333)vàkínhhiểnviNikonTi-U833255(NhậtBản)

Tế bào trứng sau khi nuôi thành thục, tiến hành loại bỏ một phần lớp tế bào cậnnoãntrongenzymehyaluronidase10%.Dùngmouthpipetingloạibỏhoàntoàntếbào

Cytochalasin B cậnnoãntrongmôitrươngTCM-199bổsung1%D-sorbitol.Những trứngthànhthục(xuấthiệnthểcực)được chọnvàgiữtrongtủấmđểloạinhân.

Mụitrườngloạinhõn:IVCPyrulac+5àg/ mlCytochalasinB.Môitrườngrửakimthaotác:IVCPyrulac+20%PVP.

Môi trường loại nhân và môi trường rửa kim được tạo giọt đối xứng (20 àl/giọt)trong đĩa ỉ 60 mm Sử dụng kim giữ và kim loại nhõn để di chuyển trứng sao cho thểcực ở vị trớ 3 giờ, kim giữ trứng ở vị trớ 9 giờ.

Sử dụng lực piezo để chọc thủng màngzona, sau đó hút bỏ toàn bộ thể cực và phần tế bào chất xung quan thể cực Trứng saukhi loại nhân được giữ trong môi trường IVC pyrulac ở 38,5 o C Kiểm tra trứng loạinhânthànhcôngbằngphươngphápnhuộmphầnthểcựcvàtếbàochấtđượchútravớithuốcnhuộ mHoechst1àg/ml.

Tếbàocấyđược nuôitrongmôi trườngDMEM10%FBSởcáclần cấychuyểntừ 2-

7, trước khi tiến hành cấy chuyển, tế bào được nuôi trong môi trường DMEM0,2%FBS trong 3 ngày nhằm mục đích đưa tế bào về giai đoạn G0 (tế bào ở trạng thái tĩnhlặng,khôngthamgiavàochukỳvàngừngphânchia

TếbàotrứngđượcloạinhânthànhcôngsẽđượcchọnđểcấytếbàotrongNBVT.Đĩathaotácđượ cchuẩnbịvớicỏcgiọtmụitrườngIVCPyrulac+tếbàovàgiọtmụitrườngIVCPyrulac+20%PVP,20àl /giọtvàđượcchuẩnbịnhư hình2.3.

Kim giữ trứng ở vị trí 9 giờ, kim chuyển tế bào ở vị trí 3 giờ, dùng lực piezo đểphá màng zona, tạo lỗ tròn trên màng zona Sử dụng kim chuyển tế bào để hút tế bào,đẩy hút nhẹ nhàng làm bong màng tế bào cấy, sau đó đưa kim tới vị trí lỗ tròn trênmàng zona, từ đó đưa tế bào cấy vào tế bào chất của trứng, rút nhẹ nhàng kim chuyểnra.TrứngsaukhiđượccấytếbàosẽđượcgiữtrongmôitrườngIVC

Pyrulac+5àg/mlCytochalasinBtrong2giờở38,5 o Ctrướckhixungđiện.

Máyxungđiệnsửdụng:BEXCoModel:LF101HB(S/N927).Phứchợptrứng vàtếbàođượctiếnhànhxungđiệnvớidòngđiện1,5kV/ cm,100μmol/L β-mercaptoethanolstrongmôitrườngMannitol0,28mM.

Phức hợp trứng loại nhân và tế bào sau khi được xung điện thì tiến hành nuôitrong môitrườngnuôiphôi

Phươngpháp đánhgiátrạngtháithụtinh

TrạngtháithụtinhcủatếbàotrứngđượcđánhgiásauTTON10giờtheophươngpháp của Ước và cs, 2008 [134] Tế bào trứng được cố định trên lam kính và lamen,sau đó được cố định trong môi trường 1 acetic acid: 3 ethanol trong ít nhất 5 ngày.Trứng được nhuộm với dung dịch thuốc nhuộm orcein 1% (Sigma) và rửa sạch bằngdung dịch glycerol: acid acetic: nước

(1:1:3) Đánh giá trạng thái thụ tinh bằng kínhhiểnvisoinổivớivậtkính10X.0.25(tươngđươngđộphóngđại160 lần).

+) Trứng thụ tinh bình thường: được xác định là trứng có sự xuất hiện của tiền nhânđựcvàtiềnnhâncáihoặc sựxuấthiệnđồngthờicủa đầu tinhtrùngtrongtếbàochất vàthểcựcthứ nhất vàthứ 2.

+) Trứng có tinh trùng xâm nhập: được quan sát khi thấy đầu của tinh trùng ở trongtrứnghoặc cótiềnnhânđựchoặc cảhai xuấthiệntrongtếbàochất.

+) Số trứng có tiền nhân đực: Trứng được thụ tinh bởi tinh trùng và tinh trùng đã hoạthóa để tạo tiền nhân đực (nhân của tinh trùng) Tiền nhân đực có kích thước lớn hơntiềnnhâncái.

+)Trứngthụtinhđơntinhtrùng:làtrứngquansátđượcduynhấtmộttếbàotinhtrùngbêntrongtếbào chất(xuấthiện1tiềnnhânđực hoặc 1 tiềnnhầncái).

Phươngpháp đônglạnhphôi

Hợp tử sau thụ tinh 10 giờ được tiến hành đông lạnh theo phương pháp củaSomfaivàcs[138]vàNguyenKVvàcs,2018[99].Hợptửđượcrửatrongmôitrườngcơbản:NC SU-37khôngchứaglucose,bổsung20mMHepes,50mMβ- mercaptoethanol,pyruvatenatri0,17mM,natrilactate2,37mMvà4mg/ mlBSA(Môitrườngnền:Basemedium:BM).SauđóhợptửđượcchuyểnvàotrongmôitrườngBMbổ sung 2% propylene glycol-PG (29218-35, Nacalai) và 2% ethylene glycol-EG(E9129,Sigma- Aldrich)ở35°Ctrong13-15phút.

Hợp tử được chuyển tiếp vào môi trường đông lạnh là môi trường BM bổ sung50 mg/ml polyvinylpyrrolidone (P0930, Sigma-Aldrich), sucrose 0,3 M (19600015,Waco Pure Chemical Industries, Nhật Bản), 17,5% EG và 17,5% PG và ngay lập tứcchúng được chuyển lên tấm cryotop (Kitazato Biopharma, Shizuoka, Nhật Bản) vàngâmtrongnitơlỏng.

Saukhibảoquảnhợptửtrongnitơlỏngítnhất3tuần,cáchợptửđượcgiảiđôngđểkiểmtratỷl ệsốngvàpháttriển.Cryotopcóchứahợptửđượcbảoquảntrongnitơsẽđượcchuyểnnhanhsangm ôitrườngBMbổsung0,4Msucroseđãđượclàmấmở42°Ctrong1-

2phỳt.Tiếptheo,hợptửđượcchuyểnvàogiọt500àl mụitrường

BMbổsung0,05Msucroseở38°C,sauđóđược rửatrongBM vànuôitrong PZM-3.

Tỷlệsống/chếtcủahợptửđượcđánhgiábằngviệcquansáthìnhtháiởthờiđiểm2 h sau khi giải đông dưới kính hiển vi soi nổi Hợp tử được nuôi cấy và chất lượngphôiđượctheodõivàđánhgiáđếnngàythứ

Phươngpháp thu,nuôi tếbàosinhdưỡnglợn

ĐượcthựchiệntheoNguyenvàcs,2015[135].Tếbàosinhdưỡnglợnđượcphânlập từ mảnh tai lợn khỏe mạnh, không bệnh tật ở giai đoạn 2 tháng tuổi, sau đó đượcrửasạch3lầnvớidungdịchđệmmuốiphosphate(PBS-)vàvậnchuyểnvềphòngởnhiệtđộ3

7 o C.TiếnhànhrửalạibằngPBSvàcồn,cạobỏphầndangoàivàlông,tiếnhànhthulớp biểu bì Cắt lớp biểu bì thành các mảnh nhỏ 1-2 mm và nuôi trong môi trườngDulbecco’sModifiedEagle’s(DMEM)cóbổsung10%FetalBovineSerum(FBS).Sau5n gàynuôi,tếbàobámkínđĩasẽđượccấychuyểnvàđônglạnh.Ởcáclầncấychuyển,tếbàosẽđượcki ểmtratốcđộtăngtrưởngthôngquaviệcđếmsốlượngtếbàobằngcáchsử dụng buồng đếm hồng cầu(hemocytometer) tại thời điểm trước và sau khi cấychuyển Trước khi chuyển nhân 3 ngày, tế bào được giải đông và nuôi trong DMEM0,2% FBS nhằm mục đích đưa tế bào về pha G0 Tế bào sử dụng cho chuyển nhân tếbàosinhdưỡnglànhữngtếbàoởcác lầncấychuyểntừ 2-7.

Phươngpháp nhânnuôitếbào

ĐượcthựchiệntheophươngphápcủaNguyenvàcs,2015[135].Tếbàosaukhibám kín đĩa (thường sau 5 ngày nuôi) thì tiến hành cấy chuyển Hút bỏ toàn bộ môitrường nuôi, rửa lại bằng dung dịch PBS-. Cho 250 àl mụi trường Tripsin EDTA 0,25%trongPBS- vàomỗiđĩanuụiỉ35mm.Đểtrongtủấm3phỳt,khitếbàobonglờnkhỏiđỏy đĩa, sục nhẹ nhàng và trung hũa bằng môi trường nuôi (DMEM 10% FBS) vớilượngbằnghoặclớnhơnlượngtripsin.Thutoànbộtếbàovàmôitrường,lytâm2000vòng/phút trong 3 phút Loại bỏ phần dung dịch phía trên, thu phần tế bào lắng ở phíadưới, thêm môi trường nuôi sau đó gieo tế bào vào đĩa petri với mật độ 110.000 tếbào/đĩaỉ35mmvànuơitrong2mlmơitrườngnuơi.

Sau 5 ngày tiến hành cấy chuyển lần tiếp theo Ở mỗi lần cấy chuyển, đếm tổngsố tế bào sau nuôi để đánh giá khả năng nhân lên và mức độ ổn định của tế bào quacác lần cấy chuyển cấy chuyển lần tiếp theo Phương pháp đếm tổng số tế bào đượcthực hiện tương tự như phương pháp đếm tổng số tinh trùng trong buồng đếmNeubauernhưđãtrìnhbày.

Phươngpháp đônglạnhtếbào