Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro

BỘGIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄNTHỊNHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀTẠOPHÔILỢNBẢNĐỊAVIỆTNAM BẰNGKỸTHUẬTINVITRO LUẬNÁNTIẾNSĨ SINHHỌC HàNội,2021 NGUYỄNTHỊNHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀTẠOPHƠILỢNBẢNĐỊAVIỆTNAM BẰNGKỸTHUẬTINVITRO Chun ngành: Cơng nghệ sinh họcMãsố:9 42 0201 LUẬNÁNTIẾNSĨ SINHHỌC NGƯỜIHƯỚNGDẪNKHOAHỌC: TS.BùiXuânNguyên TS.NguyễnViệtLinh Hà Nội,2021 LỜICẢMƠN Trướctiên,tơixingửilờibiếtơnsâusắcđếnTS.BùiXnNgun,NgunTrưởngPhịng CơngnghệPhơi,ViệnCơngnghệsinhhọcvàTS.NguyễnViệtLinh,PhóTrưởngPhịngCơngng hệPhơi,ViệnCơngnghệsinhhọcđãtậntìnhhướngdẫn,chỉbảo,hỗtrợkĩthuậtvàtạomọiđiềukiệnt ốtnhấtgiúptơithựchiệnvàhồnthànhluậnánnày Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơngnghệ,BanlãnhđạoViệnCơngnghệsinhhọcđãtạomọiđiềukiệntốtnhấtchotơiđượchọctập,nghi êncứuvàhồnthànhluậnánnày Tơixingửilờicảmơnơncácthầycơgiáo,cáccánbộHọcviệnKhoahọcvàCơngnghệđãchỉbảo, hướngdẫnvàgiúpđỡtơitrongqtrìnhhọctậpnghiêncứuvàhồnthànhcácthủtụcliênquanđếnluậnán TơixinđượcgửilờicảmơnsâusắcTS.NguyễnThịƯớc,PhịngcơngnghệPhơi,Viện cơng nghệ sinh họcđãchỉbảo,hướngdẫnkĩthuậtvàgiúpđỡtơitừnhữngngàyđầulàmviệcchođếnnay,sựgiúpđỡcủaTS.NguyễnThịƯớcđãgópmột phầnrấtlớn khơng kết luận án mà suốt thời gian làm việc củatơi TơixinchânthànhcảmơnTiếnsỹ-BácsỹthúyKazuhiroKikuchi,trưởngnhómnghiêncứuĐơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện sinhhọc,tổchứcnghiêncứunơngnghiệpvàthựcphẩmquốcgia-NhậtBản(NARO); khoa học Tiếnsỹ TamasSomfai,nghiêncứuviênchínhPhịngnghiêncứusinhsảnvàchănni,Viện chăn ni khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp vàthực phẩm quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ ĐỗThị Kim Lành, Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản hướng dẫnkĩthuật,chiasẻtàiliệu,kinhnghiệm,tậntình giúpđỡtơiđểthực hiệnluậnán Tơi xin cảm ơn TS Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Cơngnghệ sinh học cán Phịng cơng nghệ Phơi, Viện cơng nghệ sinh học cónhữnggópýđểtơihồnchỉnhluậnán Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Ban phụ trách đào tạo Học viện KhoahọcvàCông nghệ, Banphụtrách đàotạo ViệnCông nghệsinh đãtậntình hướng dẫn tơi hồn thành thủ tục suốt trình học tập làm nghiên cứu sinh họcviện Tơixinđượcgửilờicảmơnđếngiađình,bốmẹ,chồngconđãlnhỗtrợvàtạođiểukiệntốtnhấtch otơichuntâmlàmviệcvàhồnthànhluậnán Cuối cùng,tơi xin cảmơn bạn bèvàđồng nghiệp đãlnủng hộ, cổvũ vàđộngviêntơinhữnglúckhó khănđểhồnthànhtốt luậnánnày Tơixintrântrọngcảmơn./ Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021Tácgiả NCS.NguyễnThịNhung LỜICAMĐOAN Tôixincamđoan Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng sựkhác; Cácsốliệuvàkếtquảtrìnhbàytrongluậnánlàtrungthực,mộtphầnđãđượccơngbốtrên tạp chí khoa họcchunngànhvớisựđồngývàchophépcủacácđồngtácgiả; Phầncịnlạichưađượcaicơngbốtrongbấtkỳcơngtrìnhnàokhác Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021Tácgiả NCS.NguyễnThịNhung MỤCLỤC LỜICẢMƠN .i LỜICAMĐOANĐOAN iii MỤCLỤC iv DANHMỤCCÁCBẢNG vii DANHMỤCCÁCHÌNHVẼ .viii DANHMỤCCÁCKÝHIỆU,CÁCCHỮVIẾTTẮT .x MỞĐẦU CHƯƠNG1:TỔNG QUANNGHIÊNCỨU 1.1 Cấutạo buồng trứng, sựthànhthụctrứng, qtrìnhthụtinh vàpháttriểnphơiinvivoở lợn 1.1.1 Cấutạobuồngtrứngvà sựthànhthụcinvivotrứnglợn .4 1.1.2 Sựthụtinhvà pháttriểnphôilợninvivo 1.1.3 Ảnhhưởngcủamùavụđếnhoạtđộngsinhsảnởlợn 12 1.2 Tìnhhìnhnghiêncứu tạophơi lợninvitro 15 1.2.1 Nuôithành thụctrứng lợninvitro,ảnhhưởng củanguồn nguyên liệutrứngvàđiềukiện nuôithành thục 15 1.2.2 TạophôilợnTTON,ảnhhưởngcủachấtlượngtinhtrùng,chếđộ thụtinh,nuôivàbảoquảnphôi 19 1.2.3 TạophôilợnbằngkĩthuậtNBVT 26 1.3 NghiêncứutạophôilợnBảnin vitro 32 1.3.1 Mộtsốđặcđiểmhìnhtháivàsinhsảncủalợn Bản .32 1.3.2 Nghiêncứunuôithànhthụct r ứ n g v t o p h ô i l ợ n B ả n t i V i ệ t Nam 33 CHƯƠNG2:VẬTLIỆUPHƯƠNGPHÁP .35 2.1 Vậtliệu, hoáchấtnghiêncứu 35 2.1.1 Mẫunghiêncứu 35 2.1.2 Địađiểmnghiêncứu .36 2.1.3 Hóachấtvà thiếtbị 36 2.1.4 Thiếtbịnghiêncứu 36 2.1.5 Môitrườngthaotác,nuôicấy,bảo quản 37 2.2 Phươngphápnghiêncứu 37 2.2.1 Phânloạithángtheo mùa 37 2.2.2 Phươngpháp thu,bảo quảnbuồngtrứng 37 2.2.3 Phươngphápđokíchthướcvàkhốilượngbuồngtrứng 37 2.2.4 Phươngpháp phânchia nhómnang 37 2.2.5 Phươngphápthutrứng 38 2.2.6 Phươngpháp phânloại chấtlượngtrứng 38 2.2.7 Phươngpháp đokíchthướctrứnglợn 39 2.2.8 Phươngphápnuôitrứng 39 2.2.9 Phươngpháp đánhgiá thànhthục saunuôi 40 2.2.10 Phươngpháp đônglạnhtinhtừmào tinh 40 2.2.11 Phươngpháp kiểmtrachấtlượngtinhtrướcvàsauđônglạnh 42 2.2.12 PhươngphápTTON 43 2.2.13 Phươngpháp đánhgiátrạngtháithụtinh 44 2.2.14 Phươngpháp đônglạnhphôi 44 2.2.15 Phươngpháp thu,nuôi tếbàosinhdưỡnglợn 45 2.2.16 Phươngpháp nhânnuôitếbào 45 2.2.17 Phươngpháp đônglạnhtếbào 46 2.2.18 Phươngpháp NBVT (NBVT) 46 2.2.19 Phươngpháp nuôiphôi 49 2.2.20 Phươngpháp nhuộmHoechst 49 2.2.21 Phươngpháp nhuộmOrcein 50 2.2.22 Phươngpháp phântíchvàxử lýsốliệu 50 CHƯƠNG3:KẾTQUẢVÀTHẢO LUẬN 54 3.1 Đặcđiểmhìnhtháibuồngtrứngvàtiềmnăngkhaitháctrứngởlợ nBảntheo mùa 54 3.1.1 Đặcđiểmhìnhthái, kíchthướcbuồngtrứnglợnBảntheo mùa 54 3.1.2 PhânbốnangbềmặtbuồngtrứnglợnBản 56 3.1.3 Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa kích thước trứnglợnBản 59 3.2 Kếtquảnghiên cứunuôithànhthụctrứnglợnBản 65 3.2.1 Ảnhhưởngcủamùavụ lênkếtquảnuôithànhthụctrứnglợnBản 65 3.2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết nuôi thành 68 thụctrứnglợnBản 3.3 Kếtquảtạophôilợn Bảnbằng TTON 72 3.3.1 NghiêncứuđônglạnhtinhlợnBản 73 3.3.2 Nghiêncứuchế độthụ tinhtốiưu 78 3.3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi thành thục lên thụ tinh pháttriểnphôi 84 3.3.4 ĐônglạnhphôiTTON 89 3.4 Kếtquảnghiên cứutạophôilợnBản NBVT 91 3.4.1 Kếtquảnghiêncứukhảosátchấtlượngtrứng lợnLandrace 91 3.4.2 Kếtquảnuôithành thụctrứnglợnLandrace 94 3.4.3 Tạonguồn tếbàochonhântrongNBVT 96 3.4.4 Kếtquảtạo phôilợnBảnNBVT 97 KẾTLUẬNVÀ KIẾNNGHỊ 107 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUANĐẾNĐỀTÀI 109 TÀILIỆUTHAMKHẢO 110 PHỤLỤC DANHMỤCCÁCBẢNG Bảng3.1.Kíchthước buồngtrứnglợnBản theo mùa 54 Bảng3.2.Sốlượngnangtrungbìnhtheo kíchthước .57 Bảng3.3.ẢnhhưởngmùavụđếnchấtlượngtrứnglợnBản 60 Bảng3.4.KíchthướctrứnglợnBản (µm) 62 Bảng3.5.Sựthànhthụccủatrứnglợn Bản 66 Bảng3.6.Kếtquả nuôi thànhthục trứnglợnBản 67 Bảng3.7.Chấtlượngtinhsaukhi thu 73 Bảng3.8.ChấtlượngtinhlợnBảnsauđônglạnh 74 Bảng3.9.Thửnghiệm khảnăngtạophôicủatinhtrùngsauđônglạnh .77 Bảng3.10.Đánhgiátrạngtháithụtinhcủatrứng 79 Bảng3.11.Ảnhhưởng củalớptếbàocận noãnlêntrạngtháithụtinhởlợnBản 80 Bảng3.12.Trạngthái thụtinh củatrứng trongmơi trường thụ tinhcónồng độcafeinkhácnhauvàthờigianthụtinhkhácnhau 81 Bảng3.13.Sựthành thụcvàkhảnăngthụtinh củatrứnglợn Bảnsau khinuôi 85 Bảng 14.Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên phát triển phôi lợnBảnsauthụtinh 86 Bảng3.15.Ảnhhưởng củamôitrườngnuôi phôilênsựphát triểncủaphôilợn Bảnsauthụtinh .86 Bảng3.16.Kếtquảđônglạnhphôi TTON 89 Bảng3.17.Phân loạichấtlượngtrứnglợnLandrace 913 Bảng3.18.Khảnăngthànhthục củatrứnglợnLandracetrongcácloại môi trườngnuôi 94 Bảng3.19.Ảnhhưởng củaloạitếbàocấylên pháttriểncủa phôilợnNBVT 96 Bảng 3.20.Sự phát triển phôi lợn Landrae phôi lợn Bản NBVT môitrườngnuôi 97 DANHMỤCCÁCHÌNHVẼ Hình1.1 Cấutrúcbuồngtrứng vàsựpháttriển nang,trứngởđộngvật cóvú Hình1.2 Sựphát triển nang,tếbào trứng lợn thơngqua q trìnhgiảmphân Hình1.3 Quátrìnhthànhthụccủa trứnglợn Hình1.4 Trứng lợn sauthụtinhđượcquansátdưới kính hiểnvi vớinhiềutinh trùng ởcảtrongvùng giữavàtrên màngsáng 10 Hình1.5 Cácgiaiđoạnpháttriểncủaphơilợn 11 Hình1.6 Sự pháttriểncủaphơilợntừ ngày1đếnngày10 12 Hình1.7 Sự phát triển nang, phát triển tế bào cận nỗn sựthànhthục củatrứngđộngvậtcóvú 19 Hình1.8 Thụtinhbìnhthườngsovớipolyspermic 24 Hình1.9 KĩthuậtNBVT 27 Hình2.1 Buồngđếmtinhtrùng 43 Hình2.2 Bốtrídầu trongkim 47 Hình2.3 Đĩamơitrươngthaotácloạinhân tếbàotrứng 47 Hình2.4 Micropipetvàtrứngtrongthaotác hútvàcấynhân 47 Hình2.5 Đĩamơitrườngthaotáccấynhântếbàovàotrứng 48 Hình2.6 Xungđiện trứngsaucấynhân 49 Hình3.1 Kíchthướcvà khốilượngbuồngtrứnglợnBản: 55 Hình3.2 PhânbốnangbềmặttheokíchthướcbuồngtrứnglợnBản theomùa 57 Hình3.3 TrứnglợnBảnsaukhi thuphânloạiA,B,C 59 Hình3.4 TrứnglợnBảnsauthu vàtáchtếbàocậnnỗn 62 Hình3.5 Mốitươngquangiữasốlượngnang>2mmvàsốtrứng 64