Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở việt nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

BỘGIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNG NGHỆVIỆT NAM NguyễnThịThuHường NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN Ở NGƯỜI BỆNH MẮCBỆNH XIRÔ NIỆU, RỐI LOẠN CHU TRÌNH CHUYỂNHĨA URÊ VÀ BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ Ở VIỆT NAMBẰNGCƠNGNGHỆ GIẢITRÌNHTỰGEN THẾHỆMỚI LUẬNÁNTIẾNSỸCƠNGNGHỆSINH HỌC HàNội,2022 BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂM KHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNGNGHỆ NguyễnThịThuHường NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN Ở NGƯỜI BỆNH MẮCBỆNH XIRƠ NIỆU, RỐI LOẠN CHU TRÌNH CHUYỂNHĨA URÊ VÀ BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ Ở VIỆT NAMBẰNGCƠNGNGHỆ GIẢITRÌNHTỰGENTHẾHỆMỚI Chun ngành: Cơng nghệ sinh họcMãsố:9420201 LUẬNÁNTIẾNSĨCƠNGNGHỆSINHHỌC NGƯỜIHƯỚNGDẪNKHOAHỌC: GS.TS.NguyễnHuy Hoàng TS.Nguyễn ThịKimLiên HàNội,2022 LỜICAMĐOAN Nghiên cứu sinh xin cam đoan cơng trình nghiên cứu củac h í n h b ả n thân hướng dẫn GS.TS Nguyễn Huy Hoàng TS Nguyễn Thị KimLiên Những kết thu luận án mới, trung thực, phần đượccông bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép cácđồngtácgiả.Phầncịnlạichưađượcaicơngbốtrongbấtkỳcơngtrìnhnàokhác HàNội,ngày tháng năm2022 Nghiêncứusinh NguyễnThịThuHường LỜICẢMƠN Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tớiGS.TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện trưởng Viện nghiên cứu hệ gen TS NguyễnThị Kim Liên, Phó Trưởng phịng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn, định hướng tạomọiđiề u k i ệ n t h u ậ n lợ ic h o n g h i ê n c ứ u s i nh tr on g s u ố t q uá t rì nh h ọ c tậ p, n g h i ê n cứucũngnhư thựchiệnluậnán Nghiên cứu sinh xin cảm ơn hỗ trợ, giúp đỡ, ủng hộ tham gia nhiệt tìnhcủacáccánbộthuộcPhịngHệgenhọcchứcnăng,ViệnNghiêncứuhệgen;TS.BS.Vũ Chí Dũng bác sỹ Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnhviện Nhi Trung ương suốt thời gian thực luận án Bằng tình cảmchânthành nhất,nghiêncứusinhxin trântrọngcảmơnnhữnggiúpđỡqbáu Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo; Cán Phòng Quản lýtổnghợp,ViệnNghiêncứuhệgenđãgiúpđỡvàtạođiềukiệnthuậnlợivềmọimặt,hỗtrợnghiêncứusinhthựchiệncácthủtụccầnthiết đểhồnthànhchươngtrìnhhọctậpvàluậnán Nhân dịp này, nghiên cứu sinh xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc,tập thể cán giảng viên Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học Côngnghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợinhấtchonghiêncứusinh trongquátrìnhhọctậpvànghiêncứu Luận án thực khuôn khổ đề tài thuộc Chương trình phát triểnkhoahọccơbảntronglĩnhvựcHốhọc,Khoahọcsựsống,KhoahọctráiđấtvàKhoa học biển giai đoạn 2017 - 2025, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ ViệtNam Chương trình sau tiến sỹ tạo nguồn lực khoa học công nghệ cho Học việnKhoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm KHCNVN, nghiên cứu sinh xin chân thànhcảmơnsựhỗtrợquýbáucủaViệnHànlâmKHCNVN Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ, tạo điều kiện BanGiám hiệu Trường Đại học Hồng Đức, tập thể cán bộ, giảng viên Khoa Nơng LâmNgư nghiệp Phịng Quản lý đào tạo, Trường Đại học Hồng Đức ủng hộ, tạođiềukiệnchonghiêncứusinhtrong suốtthờigianhọctậpvàhoànthànhluậnán Cuối cùng, nghiên cứu sinh bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gia đình, bố,mẹ, anh, chị, chồng, con, bạn bè đồng nghiệp tin tưởng nguồn độngviên tinh thần lớn lao nghiên cứu sinh suốt q trình học tập, nghiêncứu,hồnthànhluậnán HàNội,ngày tháng năm2022 Nghiêncứusinh NguyễnThịThuHường MỤCLỤC LỜICAMĐOAN .i LỜICẢMƠN ii MỤCLỤC iii DANHMỤCCÁCTỪ VIẾTTẮT .vi DANHMỤCBẢNG viii DANHMỤCHÌNH ix MỞĐẦU CHƯƠNG 1.TỔNGQUAN 1.1 Bệnh xirôniệu(MSUD) 1.1.1 Kháiniệm .3 1.1.2 Cơ chếbệnhsinh 1.1.3 Ditruyềnphântử 1.1.4 Triệu chứnglâm sàngvàchẩnđoán 1.1.5 Tình hìnhnghiên cứubệnhxirơ niệutrênthếgiới vàởViệtNam 1.2 Bệnhrốiloạn chutrìnhchuyển hóaurê 11 1.2.1 Kháiniệm .11 1.2.2 Cơchếbệnhsinh 11 1.2.3 Ditruyềnphân tử 13 1.2.4 TìnhhìnhnghiêncứubệnhrốiloạnchutrìnhchuyểnhóaurêtrênthếgiớivàởViệ tNam 20 1.3 Bệnhloạndưỡngcơ 26 1.3.1 Kháiniệm .26 1.3.2 Phânloạibệnh 26 1.3.3 Tình hìnhnghiêncứubệnhloạn dưỡngcơtrênthếgiớivàởViệtNam 34 1.4 Cơngnghệgiảitrìnhtựgenthếhệmới(NGS) 38 CHƯƠNG2.ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU .41 2.1 Đốitượngnghiên cứu .41 2.2 Tiêuchuẩnlựa chọnvàloạitrừ ngườibệnh 42 2.2.1 Bệnhxirôniệu 42 2.2.2 Bệnhrốiloạnchutrìnhchuyểnhóaurê .42 2.2.3 Bệnhloạndưỡng .43 2.3 Thờigianvàđịađiểmnghiêncứu 43 2.3.1 Thờigiannghiêncứu 43 2.3.2 Địađiểmnghiên cứu 43 2.4 Đạođứctrongnghiêncứu 43 2.5 Hóachất,thiết bịvàdụngcụ 44 2.6 Phương phápnghiêncứu 44 2.6.1 TáchchiếtDNAtổngsố 45 2.6.2 Giảitrìnhtựtồn bộvùnggenmãhóabằnghệthốngIllumina .45 2.6.3 Sànglọccácbiếnthểtrêncácgenchứabiếnthểliênquan 48 2.6.4 Kiểmchứngbiến thểcótiềmnănggâybệnh .49 2.6.5 Đánhgiáảnh hưởngcủacácbiếnthể mộtsốcơngcụtinsinh 51 2.6.6 PhânloạikhảnănggâybệnhcủacácbiếnthểcótiềmnăngtheotiêuchícủaHiệph ộiBệnhhọcPhântử vàDitruyềnYhọc HoaKỳ(ACMG) .54 2.6.7 Cơ sởdữliệu 56 CHƯƠNG3.KẾT QUẢNGHIÊNCỨU 58 3.1 Bệnh xirôniệu(MUSD) 58 3.1.1 Kết lâmsàng 58 3.1.2 TáchchiếtDNAtổngsố 59 3.1.3 Kếtquảgiảitrìnhtựtồnbộvùnggen mãhóa 59 3.1.4 Kiểmchứngbiến thể 65 3.1.5 Đánhgiáảnh hưởngcủacácbiếnthể mộtsốcôngcụtinsinh 68 3.1.6 PhânloạikhảnănggâybệnhcủacácbiếnthểcótiềmnăngtheotiêuchícủaHiệph ộiBệnhhọcPhântử vàDitruyềnYhọc HoaKỳ(ACMG) .73 3.2 Bệnhrốiloạn chutrìnhchuyển hóaurê(UCD) .75 3.2.1 Kết lâmsàng 75 3.2.2 TáchchiếtDNAtổngsố 76 3.2.3 Kếtquảgiảitrìnhtựtồnbộvùnggenmãhóa 77 3.2.4 Kiểmchứngbiếnthể 81 3.2.5 Đánhgiáảnhhưởngcủacácbiếnthểbằng mộtsốcôngcụtinsinh 84 3.2.6 PhânloạikhảnănggâybệnhcủacácbiếnthểcótiềmnăngtheotiêuchícủaHiệph ộiBệnhhọcPhântử vàDitruyềnYhọc HoaKỳ(ACMG) .86 3.3 Bệnhloạndưỡngcơ (MD) 88 3.3.1 Kết lâmsàng 88 3.3.2 TáchchiếtDNAtổngsố 89 3.3.3 Kếtquảgiảitrìnhtựtồnbộvùnggen mãhóa 89 3.3.4 Kiểmchứngbiến thể 93 3.3.5 Đánhgiáảnh hưởngcủacácbiếnthể mộtsốcôngcụtinsinh 95 3.3.6 PhânloạikhảnănggâybệnhcủacácbiếnthểcótiềmnăngtheotiêuchícủaHiệph ộiBệnhhọcPhântử vàDitruyềnYhọc HoaKỳ(ACMG) .97 CHƯƠNG 4.THẢOLUẬN 99 4.1 Bệnh xirôniệu(MUSD) 99 4.2 Bệnhrốiloạn chutrìnhchuyển hóaurê(UCD) 109 4.3 Bệnhloạndưỡngcơ 116 KẾTLUẬNVÀ KIẾNNGHỊ 122 Kếtluận 122 Kiếnnghị 122 NHỮNGĐÓNGGÓPMỚICỦALUẬN ÁN 123 DANHMỤCCƠNGTRÌNHCỦATÁCGIẢ 124 TÀILIỆU THAM KHẢO .125 PHỤLỤC P DANHMỤCCÁCTỪVIẾTTẮT Từviếttắt aa ACMG AD AR ASL ASS BCAA BCKDH BCKDHA BCKDHB BDK BDP CK CMD CP CPSI CSDL DBT DD DLD DM DNA DQ ExAC F FSHD GATK HET hg19 HMM TừtiếngAnhđầyđủ NghĩatiếngViệt dùngtrongluậnán Aminoacid AmericanC o lle ge s o f M e d i c Hiệph ộ i B ệ n h h ọ c P h â n t v al Di GeneticsandGenomics truyềnYhọcHoaKỳ Dit r u y ề n g e n t r ộ i t r ê n n h i ễ m s ắ c t Autosomaldominant hể thường Dit r u y ề n g e n l ặ n t r ê n n h i ễ m s ắ c t Autosomalrecessive hể thường Argininosuccinicacidlyase Argininosuccinicacidsynthetase Brandchainaminoacid Branched-chain ketoacid Ketoaciddehydrogenasemạchnhánh dehydrogenase Branched-chainαketoacid dehydrogenase Branched-chainβketoacidketoacid dehydrogenase BCKDkinase BCKDphosphatase Creatinekinase Congenitalmusculardystrophy Loạndưỡngcơbẩmsinh Carbarmoylphosphate CarbamylphosphatesynthetaseI Cơsởdữliệu Dihydrolipoamide dehydrogenase Distal musculardystrophy Loạndưỡngcơvùngngọnchi Dihydrolipoamittransacylase Myotonicdystrophy Loạndưỡngtăngtrươnglựccơ Deoxyribonucleotideacid Developmentalquotient Chỉsốpháttriển Exomeaggregationconsortium Family Giađình Facio-scapulo -humeral Loạndưỡngcơ mặt-vai-cánhtay musculardystrophy Genomeanalysistoolkit Heterozygous Dịhợptử Humangenomeassembly19 HiddenMarkovmodel Mơhìnhthốngkê Markovẩn HOM LAMA2 LGMD MAF MAF MD MK MRI MSUD NAG NGS NST OTC PM PolyPhen-2 PP PS PVS Q RI RNA SIFT SMG SNP SSCP STR STT TLTK UCD WES Homozygous Laminine-2 Limb-girdlemuscular dystrophy Minorallelefrequency Minorallelefrequency Musculardystrophy Marker Magneticresonanceimaging Maplesyrupurinedisorder N-acetylglutamate Nextgenerationsequencing Orinithinetranscarbamylase Pathogenic moderate Polymorphismphenotypingv2 Pathogenicsupporting Pathogenicstrong Pathogenicverystrong Quality Reliabilityindex Ribonucleicacid Sortingintolerantfromtolerant Serine-methionine-glycine Singlenucleotidepolymorphism Singlestrandconformation polymorphism Shorttandemrepeat Ureacycledisorder Wholeexomesequencing Đồnghợp tử Loạndưỡngcơvùng gốcchi Tầnsốallen Tầnsốallenhiếm Loạndưỡngcơ Thangchuẩn Hìnhảnhcộnghưởngtừ Bệnhxirơniệu Giảitrìnhtựgenthếhệ Nhiễmsắcthể Gâybệnh mứctrungbình Gâybệnh mứchỗtrợ Gâybệnh mạnh Gâybệnhrất mạnh Chấtlượng Chỉsốđộtincậy Đahìnhđơn Đahìnhsợiđơn Sốthứtự Tàiliệuthamkhảo Rốiloạnchutrình chuyểnhóaurê Giảitrìnhtựtồnbộvùngmãhóa DANHMỤCBẢNG Bảng1.1 Cácgenliên quanđếnbệnhxirô niệu… Bảng2.1 Thơngtinvềngườibệnhvàgiađình .41 Bảng2.2 Điểmchấtlượng .47 Bảng2.3.Trìnhtựcácđoạnmồi 50 Bảng2.4 Chutrìnhnhiệtkhuếchđạitừngvùnggen .51 Bảng2.5 Quytắcphânloạibiếnthểtrêncơsở kếthợpcáctiêuchí 56 Bảng3.1.Thơngtinlâmsàngvàcậnlâmsàngcủangườibệnhmắcxirơniệu .58 Bảng3.2.ThơngtinđọctrìnhtựcủangườibệnhR01,R02,R03,R04 61 Bảng3.3.Kếtquảphântíchvàdựđốnbiếnthểtrongtồnbộvùnggenmãhóaởngườib ệnhR01,R02,R03,R04 62 Bảng3.4.Kếtquảsànglọcbiếnthểcótiềmnănggây bệnhởngườibệnhR01,R02,R03,R04 63 Bảng35.Phântíchtiềmnănggâ ybệnhcủac ác biếnthểở ngườibệnhR01,R02, R03,R04 mộtsố côngcụtinsinh 70 Bảng3.6.PhânloạicácbiếnthểtiềmnănggâybệnhMUSDtheotiêuchícủaHiệphộiBệ nhhọcPhântửvàDitruyền YhọcHoaKỳ(ACMG) 73 Bảng3 T h ô n g t i n l â m s n g v c ậ n l â m s n g c ủ a n g i b ệ n h m ắ c r ố i l o n c h u trìnhchuyểnhóaurê 76 Bảng3.8.ThơngtinđọctrìnhtựcủangườibệnhR05,R06,R07 78 Bảng3.9 Kếtquảphântíchvàdựđốnbiếnthể trongtồnbộvùnggenmãhóacủangườibệnhR05,R06,R07 79 Bảng3.10.KếtquảsànglọcbiếnthểtiềmnănggâybệnhởngườibệnhR05,R06,R07 80 Bảng 3.11 Kết quảphântíchbiếnthểIVS7+1G>AbằngphầnmềmMaxEntScan::score5ss 85 Bảng3.12.P h â n tíchảnhhưởngcủabiếnthểthaythếc.365A>T;p.E122Vt r ê n gen OTCbằngmộtsốcơngcụtinsinh 85 Bảng3.13.Phânloạ itiềmnănggâybệnhUCD củacácb iế n thểtheotiêuchícủa HiệphộiBệnhhọcPhântử vàDitruyềnYhọc HoaKỳ(ACMG) 87 Bảng314.Thơngtinlâmsàngvàcậnlâmsàngcủangườibệnhmắcloạndưỡngcơ88 Bảng3.15.ThơngtinđọctrìnhtựcủangườibệnhR08,R09vàBố,Mẹ 91 Bảng3.16.KếtquảphântíchvàdựđốnbiếnthểtrongtồnbộvùnggenmãhóacủangườibệnhR08 ,R09vàBố,Mẹ 92 Bảng3.17.Kếtquảsànglọc biếnthểcótiềmnănggâybệnhloạndưỡngcơ .93 Bảng3 P h â n t í c h ả n h h n g c ủ a b i ế n t h ể c 7 C > T ( p H Y ) v c.2 987G>A(p.C996Y) trêngenLAMA2bằng mộtsốcôngcụtin sinh 95 Bảng3.19.PhânloạicácbiếnthểởngườibệnhloạndưỡngcơtheotiêuchuẩncủaHiệp hộiBệnhhọcPhântửvàDitruyềnYhọc HoaKỳ(ACMG) 98 Bảng4.1 Cácbiến thểthaythếđãđượccôngbốtạiexon 10của genBCKDHB1 Bảng4.2 Cácbiến thểthaythếđãđượccôngbốtạiexon9củagenBCKDHB 104 Bảng4.3 Cácbiến thểthaythếđãđượccôngbốtạiexon1củagenBCKDHB 106 Bảng4.4 Cácbiến thểthaythếđãđượccôngbốtạiexon 4củagenOTC .113