Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở việt nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Bệnh xirôniệu(MSUD)

Bệnh xirô niệu (MSUD) là một rối loạn chuyển hóa hiếm gặp, di truyền genlặn trên nhiễm sắc thể thường Cơ thể của người bệnh không thể chuyển hóa đượccác amino acid mạch nhánh (BCAA) bao gồm leucine, isoleucine và valine.

Sự tíchtụ của các amino acid này trong nước tiểu tạo ra mùi đặc trưng và là nguồn gốc têncủa bệnh Nếu không được điều trị kịp thời, bệnh có thể tiến triển đến co giật, hônmêvàthậmchítử vongsớm,thườngtrước3thángtuổi.

Xirôniệulàbệnhhiếmgặpvớitỷlệmắcướctínhkhoảng1/185.000trêntoànthếgiới[1]. Tuynhiên,ởcácquốcgiacótỷlệhônnhâncậnhuyếtcao,consốnàycóthể lớn hơn [2] Đến nay, tỷ lệ mắc bệnh xirô niệu ở Việt Nam chưa được thống kêđầyđủvàchínhthức.

Bệnh xirô niệu gây ra do biến thể xuất hiện trên genBCKDHA, BCKDHB,DBTvàDLD,mãhóatương ứngchocác tiểuđơnvịE1α, E1βketoacid,E2, E3c ủaphứchợp α-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD) Phức hợp BCKD xúc tác quátrình khử carboxyl hóa các α-ketoacid mạch nhánh, bước thứ hai trong quá trìnhphân giải các amino acid mạch nhánh Biến thể trên các gen mã hóa làm suy giảmhoặc mất chức năng của phức hợp, từ đó dẫn đến sự tích tụ các amino acid mạchnhánh nhưleucine, isoleucine, valine trongmáu và cácα-ketoacidm ạ c h n h á n h trong máu và nước tiểu [3] Sự tích lũy các chất này có thể gây tổn thương hệ thầnkinh thông qua việc ngăn cản quá trình tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh quantrọngvàquátrìnhmyelinhóa xảyra ởcác tếbàothầnkinh [3].

Leucine,isoleucine,valinelà03aminoacidthiếtyếu,khôngthểtựtổnghợpởđộng vật có vú và được đưa vào cơ thể qua đường thức ăn Do BCAA cần thiết choquá trình tổng hợp protein, các acid béo mạch nhánh, chất dẫn truyền thần kinh nênquá trình dị hóa các BCAA được kiểm soát chặt chẽ, thông qua phức hợp enzymeBCKD Bước đầu tiên trong quá trình dị hóa BCAA là chuyển nhóm amin củaleucine, isoleucine, valine cho α-ketoglutarate(α-KG) tạo thành glutamate và cácketoacid mạch nhánh (BCKA) tương ứng bao gồm α-ketoisocaproate (KIC), α keto-methylvalate(KMV),α- ketoisovalerate(KIV),vớisựxúctáccủaaminotransferase

(Hình1.1).Bướctiếptheolàquátrìnhkhửcarboxyloxyhóathôngquaphứchợp BCKD.Ởngườimắcbệnhxirôniệu,bướcnàybịgiánđoạn.

Quá trình chuyển gốc amin của BCAA được thực hiện nhờ vào vai trò xúc tác củaaminotransferase tạo sản phẩm là các ketoacid mạch nhánh (BCKA): α- ketoisocaproate(KIC), α-keto-βketoacid-methylvalerate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV) (phản ứng 1) Quá trìnhkhử carboxyl oxi hóa của các ketoacid mạch nhánh (BCKA) được thực hiện nhờ phức hợpa-ketoaciddehydrogenasemạch nhánh(BCKD)(phản ứng2) [4].

BCKD là enzyme điều hòa quan trọng nhất trong con đường dị hóa của cácBCAA,nằmtrongtythể,gồm03thànhphầnxúctácdecarboxylaseE1,dihydrolipoyl transacylase E2, dihydrolipoamide dehydrogenase E3 và 02 enzymeđiềuhòa(BCKDkinase,BCKDphosphatase)[5].CácthànhphầnE1(02tiểuđơnvịα và 02 tiểu đơn vị βketoacid), E2 và E3 được mã hóa lần lượt bởi các genBCKDHA,BCKDHB,DBT,DLDđềunằmtrongnhân(Bảng1.1).

Thành phần E1, được tạo nên từ 02 tiểu phần E1α và 02 tiểu phần E1βketoacid.GenmãhóachotiểuđơnvịE1α,BCKDHA,nằmtrêncánhdàicủanhiễmsắcthể19tại vịtrí19q13.2(Hình1.2).GenBCKDHAgồm9exon,mãhóachomộtmRNA1,6kb vàđượcdịchmãthành378 aavớimột trìnhtựdẫnđầu dài 45 aa.

(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp) GenBCKDHBmã hóa cho tiểu đơn vị E1βketoacid nằm trên cánh dài của nhiễm sắcthể số 6 tại vị trí 6q14.1, gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,4 kb và dịch mãthành342 aavới mộttrìnhtựdẫnđầudài50aa(Hình1.3).

(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp)

Thành phần E2, là một dihydrolipoyl transacylase (DBT), tồn tại dưới dạnghomo-24mer hình bát giác đối xứng trong phức hợp BCKD, giữ vai trò như là

“lõi”chức năng của phức hợp do sự có mặt của các vùng lipoyl Thành phần này hoạtđộng như cánh tay xoay dài để chuyển giao, tiếp nhận các chất trung gian giữa cáctrung tâm hoạt động hoặc tiểu đơn vị khác của phức hợp Gen mã hóa cho thànhphần E2,DBT, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 1 tại vị trí 1p21.2 (Hình1.4) GenDBTgồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,46 kb và dịch mã thành 421aminoacidvớimộttrìnhtự dẫnđầucókíchthước 56aa.

(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp)

Thành phần E3, tồn tại như một homodimer trong phức hợp BCKD Gen mãhóa cho thành phần E3,DLD, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 7 tại vị trí7q31.1 (Hình 1.5) GenDLDgồm 11 exon, mã hóa 02 mRNA 2,2 kb và 2,4 kb, dịchmã thành 509 aa với một trình tự dẫn đầu có chiều dài không xác định Thành phầnE1 và E2 xuất hiện duy nhất trong phức hợpB C K D , t r o n g k h i t h à n h p h ầ n E 3 c ó mặttronghaienzymetythểkhác(pyruvatedehydrogenasevàphứchợpα- ketoglutarate dehydrogenase, giữ vai trò quan trọng trong chu trình Krebs). Thànhphầnnàycònđược gọilàproteinLcủa hệthốngphâncắtglycinetythể.

(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp)

Dựa vào triệu chứng lâm sàng, MSUD được phân loại thành 05 kiểu, khôngcó mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và kiểu hình bao gồm kiểu cổ điển, trunggian,khôngliêntục,đáp ứngthiaminevàthiếuE3.

Bệnh xirô niệu kiểu cổ điển và kiểu thiếu E3 thường khởi phát ngay trongthời kỳ sơ sinh, trong khi các kiểu còn lại có thể xuất hiện bất cứ giai đoạn nào khingười bệnh phải đối mặt với các yếu tố stress Các triệu chứng lâm sàng của MSUDphụ thuộc vào mức độ hoạt động của phức hợp BCKD Ở người bệnh kiểu cổ điển,hoạt tính của BCKD A p.R307Q),0 2 b i ế n t h ể t h ể d ị h ợ p t ử t r ê n g e nISPD(c.458T>C, p.I153T, c.535-3C>G) [113] Áp dụng phương pháp giải trình tựtoàn bộ vùng mã hóa của một người bệnh nữ (38 tuổi) được chẩn đoán loạn dưỡngcơ vùng gốc chi và phát hiện được 01 biến thể trên genCOL6A1(c.1056+1G>A) lànguyên nhân gây bệnh cơ Bethlem [114] Công nghệ WES được áp dụng để phântích di truyền 03 người Iran và đã phát hiện được 03 biến thể (c.8665G>A, c.397-4_c.478del, c.7452-1G>A) trên genLAMA2[115] Tiến hành phân tích trên 168người mắc bệnh loạn dưỡng cơ bằng phương pháp MLPA, nhóm nghiên cứu củaLuce và cộng sự (2018) [116] chỉ phát hiện được các biến thể mất/lặp đoạn ở 96người bệnh.Những người bệnh có kết quả âm tính vớiM L P A đ ư ợ c t i ế p t ụ c s à n g lọc bằng WES và xác định được 16 biến thể điểm trên genDMDở 38 người Bằngcông nghệ WES, 04 biến thể (c.4516delG, c.7898G>A, c.9621delT, c.6259A>T)trên genDMD, gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở 04 gia đình người Trung

Quốcđãđượcsànglọc [117].Nghiêncứucủa Dingvàcộng sự(2019)đã pháthi ện02biến thể thay thế c.2881G>A (p.A961T) và c.4406G>A (p.C1469Y) ở 01 ngườiTrung Quốc [118] Năm

2019, 01 biến thể thay thế thể đồng hợp tử trên genTTN,c.98807G>A;p.R32936Hđượcpháthiệnvàlànguyênnhângâybệnhloạ ndưỡngcơ vùng gốc chi type 10 ở 01 người Pakistan [119] Công nghệ WES được áp dụngvà chẩn đoán bệnh cho 07 trong số 08 gia đình Jordan không có mối quan hệ huyếtthống mắcbệnhloạndưỡngcơ[120].

Năm 2003, nhóm nghiên cứu của Trần Vân Khánh tiến hành phân tích ditruyền trên 05 người mắc bệnh loạn dưỡng cơ tủy và xác định được 01 biến thể mấtđoạn, trạng thái đồng hợp tử ở 01 người bệnh [121] Tạ Minh Hiền và cộng sự(2003) sử dụng kỹ thuật MLPA để sàng lọc nhanh các biến thể trong 06 gia đình,khôngcómốiquanhệhuyếtthốngbaogồm08phụnữđangmangthaicónguycơ sinhconmắcbệnhDMDcao.Kếtquảsànglọcpháthiệnđượcbiếnthểmấtđoạnlớ n ở 05 người mắc bệnh DMD và một biến thể mất đoạn nhỏ, làm dịch khung đọctrên exon43ở01 người bệnh[122] Năm 2013,TrầnVânKhánh và cộngs ự khuếchđại 19exon,thường xuấthiệnbiếnthểmất exon, trên genDMDở1 5 2 ngườim ắ c b ệ n h l o ạ n d ư ỡ n g c ơ K ế t q u ả n g h i ê n c ứ u c h o t h ấ y , 5 4 % n g ư ờ i b ệ n h mang biến thể mất exon được phân loại thành 37 kiểu khác nhau Trong đó, biến thểmất các exon 45 -

50 và 49 - 52 là phổ biến nhất (7,3%/mỗi loại), tiếp đến các exon45-47,48-50,49- 50,51(6,1%/mỗiloại),cácexon46-51và44chiếmtỷlệ4,9%[123] Một biến thể c.424C>T trên genCAPN3gây ra sự thay thế glutamine (E)thành bộ ba kết thúc được sàng lọc ở một người bệnh nữ 15 tuổi có các triệu chứngyếu các cơ vùng gốc chi tiến triển bằng NGS sử dụng hệ thống Ion Torrent Nhờ đó,người bệnh được chẩn đoán mắc bệnh LGMD type 2A, di truyền gen lặn trên nhiễmsắcthểthường[124].KỹthuậtMLPAđượcápdụng thànhcôngtrongviệcphântíchbiến thể trên 181 người bệnh loạn dưỡng cơ Becker/Duchenne Trong số 181 trườnghợp, các biến thể mất hoặc lặp một hoặc nhiều exon lần lượt là 58% (105 trườnghợp) và 6,6% (12 trường hợp) Các biến thể mất exon ở vùng ngoại biên chiếm tỷ lệ14,3% và vùng trung tâm chiếm 72,4% Biến thể mất đoạn tổng thể chiếm 14% vàcác biến thể nằm ngoài vùng phổ biến chỉ chiếm 1,2% Các biến thể mất đoạn đượcchia thành 48 loại khác nhau trong đó biến thể mất exon 48 - 50 và 45 - 50 là phổbiến nhất Biến thể mất 01 exon được phát hiện ở 14 trường hợp chiếm tỷ lệ 13%[125] Nhóm tác giả Nguyễn Thị Mai Hương (2015) tiến hành khảo sát và xác địnhphổ biến thểtrên genDMDở 546ngườimắc bệnh loạnd ư ỡ n g c ơ

D u c h e n n e t ừ 2005 đến 2015 Kết quả cho thấy tỷ lệ mang biến thể là 28,7%

(162 người) trong đóbiếnthểm ấ t đ oạn nằ m trêncác vùngp h ổ b iế nnhất( c h i ế m 27,7%).Hầuhế t, cá c biến thể nằm trên genDMD, cụ thể trên exon 45-60 (chiếm 54,4%), trên exon 01 - 19(chiếm28,4%)vàcácexoncònlại(chiếm14,3%)[126].

Lê Thị Phương và cộng sự (2019) [127] sử dụng kỹ thuật microsatellite - DNA để sàng lọc trên 05 người mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne không có mốiquan hệ huyết thống, xác định được biến thể genDMDở 38 thành viên nữ (mẹ, bàngoại,c h ị e m g á i , c h ị e m h ọ , b á c g á i , d ì ) c ó c ù n g h u y ế t t h ố n g b ê n n g o ạ i K ế t quả đã phát hiện được 5/5 người mẹ và 16/33 thành viên nữ trong phả hệ0 5 g i a đìnhl à n g ư ờ i l à n h m a n g g e n b ệ n h N ă m 2 0 1 9 , 0 1 b i ế n t h ể t h a y t h ếden o v o c.1964T>C (p.L655P) và 01 biến thểt r ư ợ t g e n ( c 3 5 5 6 - 1 3 T > A ) t r ê n g e nL A M A 2 đã được xác định là nguyên nhân gây bệnh loạn dưỡng cơ bẩm sinh thiếu merosinkiểu 1A (MDC1A) ở 01 bé trai bằng công nghệ giải mã toàn bộ vùng gen mã hóa(WES).Cả02biếnthểđượcpháthiệnđềuởtrạngtháidịhợptử[128].

Côngnghệgiảitrìnhtựgenthếhệmới(NGS)

Giải trình tự gen là kỹ thuật xác định thứ tự các nucleotide gắn kết với nhaudọc theo chiều dài của sợi DNA Phương pháp giải trình tự thế hệ đầu tiên, Sanger,đã thu được nhiều thành tựu quan trọng trong đó nổi bật nhất là việc hoàn thành dựán hệ gen người vào năm 2001 Tuy nhiên, phương pháp này cần chi phí cao vàlượng thời gian lớn để hoàn thành Sự ra đời của công nghệ giải trình tự gen thế hệmới vào năm 2005 là một bước ngoặt lớn, mở ra một kỷ nguyên mới trong lĩnh vựcgiảitrìnhtự gen.

Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) còn được gọi là giải trình tựdung lượng cao hoặc giải trình tự song song, cho phép giải trình tự hàng nghìn đếnhàng tỷ đoạn DNA đồng thời và độc lập với nhau Cùng với các bước tiến của khoahọc kỹ thuật, các công nghệ NGS không ngừng phát triển như tăng lưu lượng xử lýlên 100 - 1000 lần, tăng độ dài đoạn trình tự đọc, giảm giá thành Nhờ đó, việc giảitrình tự khôngchỉ giới hạn trong các nghiêncứu cơ bảnmà cònđ ư ợ c ứ n g d ụ n g rộng rãi vào công tác lâm sàng Đến nay, nhiều công nghệ NGS khác nhau đã đượcpháttriểnnhư:giảitrìnhtựRoche454(pyrosequencing454),giảitrìnhtựProton/ PGM (Ion Torrent sequencing), giải trình tự Illumina (Solexa), giải trình tựABISOLiD…

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới tuân theo hai nguyên lý chính: (1)Đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS); (2) Đọc trình tự gắn nối(sequencing by ligation, SBL) Nguyên lý thứ nhất thường được các thế hệ máyRoche 454, Ion Torrent và Illumina sử dụng Nguyên lý này sử dụng một hỗn hợpcác dNTP bổ sung tự nhiên và các dNTP bổ sung có đánh dấu huỳnh quang Quátrìnhxácđịnh trình tựsẽ diễn ratương tựnhưp h ả n ứ n g P C R t h ô n g t h ư ờ n g Đ ầ u tiên một đoạn trình tự mồi nằm trên đoạn adapter sẽ được gắn vào phần cuối củađoạn gDNA khuôn cần đọc trình tự Sau đó, việc xác định trình tự được thực hiệnbằng cách gắn lần lượt từng dNTP bổ sung có đánh dấu huỳnh quang vào phần cuốicủatrìnhtựmồi.Nguyênlýthứhai,đọctrìnhtựgắnnối(sequencingbyliga tion,

SBL) được được phát minh bởi George Church và áp dụng ở máy SOLiD. Nguyênlýnà ylàm ộ t ch ut rì nh tu ần h o à n gồ mcác b ư ớ c :

( 1 ) Đ ư a và ocác m ồ i n e o đư ợc thiết kế trình tự bổ sung với trình tự trên adapter; (2) Lai các nonamer ngẫu nhiênvới nhau (Mỗi hỗn hợp nonamer gồm có 4 loại nonamer, mỗi loại có các base và vịtrí đã được xác định Các chất phát quang khác nhau được gắn ở cuối của mỗi loạinonamer cho phép xác định nucleotide trên nonamer); (3) Các nonamer lai với cácmồi neo (thiết bị ghi hình và phần mềm sẽ xác định nucleotide ở vị trí query); (4)Mồi neo, phức hệ nonamer được đọc bằng phóng xạ và quá trình được lặp lại chocácvị tríquerytrong hỗn hợp nonamer.

Bước 1:Chuẩn bị các đoạn DNA và gắn lên các giá bám Đầu tiên, sợi

DNAđược cắt nhỏ thành các đoạn DNA ngắn, sau đó 02 đầu các đoạn DNA ngắn nàyđượcgắn02đoạnadapterđặchiệu.TổhợpDNA- adaptersẽđượcgắnlêngiábámlà các hạt nano (Roche 454, SOLiD hay Ion Torrent) hoặc các vi bản (Illumina) nhờcácđoạn dòđặc hiệuadapter đãgắn sẵn.

Bước 2:Sử dụng cặp mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại các đoạn DNA trêngiá bám Trong trường hợp giá bám là vi bản thì các thành phần tham gia phản ứngPCR được bơm trải lên vi bản, nhờ đó từng cụm sản phẩm khuếch đại được gắn trênnhững vị trí tách rời nhau Nếu giá bám là các vi hạt thì phải nhũ hoác á c t h à n h phần tham gia phản ứng PCR để các giọt nhũ chỉ chứa một vi hạt Bằng cách này,mỗi vi hạt chỉ chứa một loại sản phẩm khuếch đại. Tiếp đó, các vi hạt được loại bỏnhũ dịch và bơm vào một vi chip có chứa hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn giếngkíchthướcnano(nanowell).Vìthế,mỗi giếngchỉchứamột vihạt.

Bước3 : Đ ọ ct r ì n h t ự t h e o n g u y ê n l ý t ổ n g h ợ p h o ặ c g ắ n n ố i K h á c v ớ i nguyên tắc của phương pháp pyrosequencing, giải trình tự gen thế hệ mới có một sốđiểm khác biệt như sau: (1) Các nucleotide dư thừa ở phản ứng trước sẽ không bịloại bỏ mà được thu hồi lại khi thu được tín hiệu và bơm các nucleotide mới; (2) Tínhiệu thu được sau mỗi lần bơm các thành phần tham gia vào có thể là tín hiệu phátquang đối với hệ thống sử dụng luciferinluciferase (Roche 454), tín hiệu điện dothay đổi pH (Ion‐Torrent), tín hiệu huỳnh quang đối với hệ thống sử dụng cácnucleotide cóđánh dấu huỳnh quang (Illumina) hoặc có thể là tín hiệu huỳnh quangđượcgắnlênprobe(SOLiD);

(3)Việctổnghợpsợibổsungdựavàosợikhuôncó thể được thực hiện theo từng nucleotide một và với mỗi nucleotide được kéo dài thìsẽ cómột tín hiệu phát quang (Roche454),h u ỳ n h q u a n g ( I l l u m i n a ) h o ặ c s ự t h a y đổi pH (ion Torrent) được ghi nhận Đối với hệ thống SOLiD, đầu 3’ của mạch bổsung mỗi lần được kéo dài 2 nucleotide nhờ đoạn dò được nối vào theo nguyên tắcbắt cặp bổ sung với sợi khuôn vàhệ thống sẽ thu đượcm ộ t t í n h i ệ u h u ỳ n h q u a n g khi02nucleotidemớiđượctổnghợp.

Đốitượngnghiên cứu

Các bệnh nhi và thành viên trong gia đình được khám lâm sàng, xét nghiệmsinhhóa,chẩnđoánxirôniệu(04ngườibệnh),rốiloạnchutrìnhchuyể nhóaurê(03 người bệnh), loạn dưỡng cơ (02 người bệnh), đang điều trị và theo dõi tại KhoaNộitiết-Chuyển hóa- Ditruyền,Bệnhviện NhiTrungương(HàNội)(Bảng2.1).

Bétrai Bố,Mẹ,Anh,Chị

Bétrai Bố,Mẹ,Anh,Chị

Bégái Bố,Mẹ,Anh,Chị

Trong số 08 gia đình tham gia nghiên cứu, chỉ khai thác được thông tin vềphảhệ03 thếhệ của giađìnhn g ư ờ i b ệ n h R 0 5 C ụ t h ể , b à n g o ạ i c ủ a n g ư ờ i b ệ n h mấtd o đ ộ t q u ỵ n ă m 3 5 t u ổ i , d ì m ấ t n ă m

2 1 t u ổ i s a u k h i x u ấ t h i ệ n t r i ệ u c h ứ n g hôn mê, cậu mất tại thời điểm 02 ngày tuổi sau sinhd o h ô n m ê , k h ó t h ở H a i a n h traimấtlúc05ngàytuổidohônmê,khóthở,01thainhi08tuầntuổibịsẩy,e mhọmấtngaysaukhisinh.

Tiêuchuẩnlựa chọnvàloạitrừ ngườibệnh

+Ketonniệu,nồngđộcácaminoacidmạchnhánhtrongmáu(leucine,isoleucine, alloisoleucine, valine) tăng so với ngưỡng bình thường (leucine: 57,16 -246,95μmol/L, m o l / L , i s o l e u c i n e : 3 6 , 2 -

1 1 2 , 5 μmol/L,valine: μmol/L, m o l / L , v a l i n e : 4 6 , 1 6 – 2 3 1 , 7 0 μmol/L, m o l / L àmol/L)[129].

- Loại trừ người bệnh mắc bệnh rối loạn chuyển hóa amino acid mạch nhánhkhác bao gồm axit propionic máu, axit isovaleric máu, methylmalonic máu (đượcxácđịnhbằngchẩn đoánphântử)với cáctriệuchứngtươngtự;

+Khóchịu, búkém,bỏbú,buồn nôn,cáukỉnh, mấtngủ;

- Loại trừ người bệnh mắc các rối loạn liên quan đến chu trình chuyển hóa urêkhácbaogồmkhôngdungnạpproteinlysinuric,tăngornithinemáu,t ă n g ammoniacm á u v à h o m o c i t r u l l i n e m á u , h ộ i c h ứ n g t ă n g i n s u l i n - t ă n g a m m o n i a c máu(đượcxácđịnhbằngchẩnđoánphântử)vớicáctriệuchứngtươngtự.

Thờigianvàđịađiểmnghiêncứu

2.3.1 Thờigian nghiêncứu:Từ tháng 10năm2018đếntháng 8năm2020

2.3.2 Địađiểmnghiêncứu Địa điểm thu thập mẫu: Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh việnNhiTrung ương (HàNội). Địa điểm phân tích mẫu: Phòng Hệ gen chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen -ViệnHànlâm KhoahọcvàCôngnghệViệt Nam.

Đạođứctrongnghiêncứu

Nghiên cứu được sự đồng ý chấp thuận của gia đình người bệnh, Khoa Ditruyền - Chuyển hoá - Nội tiết, Bệnh viện Nhi Trung ương và Viện Nghiên cứu hệgen Tất cả các thông tin liên quan đến người bệnh và các thành viên trong gia đìnhthamgianghiêncứuđềuđược bảomật.

Nghiên cứu tuân thủ đúng y đức theo tiêu chuẩn tuyên bố Helsinki của Hộiđồng Y khoa thế giới và Hội đồng Y đức trong nghiên cứu y sinh của Viện Nghiêncứuhệgen(theoQuyếtđịnhsố16/QĐ-NCHGngày22/3/2018).

Hóachất,thiết bịvàdụngcụ

Kit tách chiết DNA tổng số (Qiagen, Đức), các hóa chất dùng cho PCR baogồm:dNTPs(Fermentas,Mỹ),TaqDNApolymerase(Sigma,Mỹ),đệm10X(Ferment as,Mỹ), nước cất tiêm (Việt Nam),a g a r o s e ( T h e r m o S c i e n t i f i c TM , Mỹ),hóa chất pha đệm chạy điện di DNA (TAE): Tris base (Merck, Đức), acetic acid(Merck, Đức), EDTA (Merck, Đức), DNA chuẩn 1kb(Thermo ScientificTM, Mỹ),các bộ kit sử dụng trong giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (Illumina, Mỹ):BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing, bộ kit Truseq DNA nano (350 và 550),Truseq DNA PCR-free (350bp insert và 550 bp insert), SureSelect XT Library Prep.Thiếtbị

Máy spindown (Wealtec, Mỹ), máy vortex (Dragon, Trung Quốc), lò vi sóng(Sharp, Nhật Bản), cân kĩ thuật (Metller Toledo, Thụy Sỹ), tủ lạnh - 20°C, - 80°C(Sanyo, Nhật Bản), pipet các loại (Gilson, Pháp),m á y l y t â m ( E p p e n d o r f , Đ ứ c ) , máyquangphổBiospectrometer(Eppendorf,Đức),máyPCR(EppendorfA G , Đức); máy điện di (Bio-Rad), máy chụp ảnh gel (Amersham BioSciences), máy giảitrình tự gen thế hệ mới (Illumina, Mỹ), máy giải trình tự gen ABI 3500 GeneticAnalyzer(ThermoFisherScientific,Mỹ).

Dụngcụ Ống chứa máu EDTA-K2 (Việt Nam), ống Eppendorf đựng mẫu thể tích1,5ml (Corning,Mỹ),ốngEppendorf0,2ml(QSP),đầucôncácloại(Eppendorf,Đức).

Phương phápnghiêncứu

Quy trình nghiên cứu bao gồm các bước chính: Tách chiết DNA, giải trình tựWES, phân tích số liệu tìm các biến thể trong toàn bộ vùng gen mã hóa của ngườibệnh, lọc tìm các biến thể gây bệnh trên các gen có khả năng liên quan đến bệnh,kiểm chứng lại biến thể gây bệnh, phân tích các biến thể bằng các phần mềm tinsinh,xácđịnhbiếnthểcó tiềmnănggâybệnh(Hình2.1).

Hình2.1 Sơđồquytrìnhnghiêncứu 2.6.1 Táchchiết DNA tổngsố

Máu ngoại vi (2-3 ml) của người bệnh và người nhà được thu vào các ốngmáu chứa chất chống đông EDTA, lưu giữ ở -20 0 C cho đến khi sử dụng Các mẫusau khi tiếp nhận được mã hóa và sử dụng để tách chiết DNA tổng số bằng QIAampDNA Blood Mini Kit (Qiagen, Đức) DNA thu được kiểm tra bằng điện di trên gelagarose 1,0% Nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch DNA được đo bằng máyquang phổ Biospectrometer (Eppendorf) và được xác định bằng giá trị trung bìnhcủa3 lầnđo.CácmẫuDNAchưasử dụngđượclưutrữ ở-20 o C.

Hệ thống Illumina áp dụng công nghệ giải trình tự tổng hợp (Sequencingbysynthesis)đểtạodữliệutoànbộvùngmãhóa.Côngnghệnàysửdụngcácdeox ynucloside triphosphate (dNTP) đánh dấu huỳnh quang để bổ sung vào chuỗiacidn u c l e i c C á c g ố c h u ỳ n h q u a n g g i ữ v a i t r ò n h ư m ộ t k h ó a d ừ n g p h ả n ứ n g polymer hóa Do đó, khi mỗi dNTP gắn vào, tín hiệu huỳnh quang được ghi lại đểxácđịnhnucleotidevàsauđóbịloạibỏđểtổnghợpnucleotidetiếptheo.Dựavào cường độ tín hiệu đo được trong mỗi chu trình, trình tự sẽ được đọc từng nucleotidemộtvớiđộchínhxáccao,giảmthiểusaisốsovớicáccôngnghệkhác.

Quy trình giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa gồm các bước: Tạo thư việngen,tạocụmđặchiệu,giảitrìnhtựvàphântíchsốliệu.

Bộ kit Agilent SureSelect Target Enrichment Kit được sử dụng để tạo thưviện gen với các bước như sau: ( 1) Cắt DNA hệ gen thành các đoạn ngắn 100- 200bp;(2) Gắn adaptor đặc hiệu cho từng đoạn DNA;(3) Lai các đoạn DNA đặchiệu với các đoạn RNA được biotin hóa; (4) Các đoạn DNA không liên kết, RNA,beads dư thừa bị loại bỏ Sử dụng các hạt từ phủ streptavidin để thu các đoạn exonđãliênkếtđặc hiệu;

Nền tảng Illumina sử dụng phản ứng khuếch đại “bắc cầu” xảy ra trên bề mặtmột tấm kính có các giếng (Flow cell) phủ đầy các mồi bổ sung đã cố định đầu 5′trên mặt giếng DNA được biến tính thành các sợi đơn bằng NaOH, sau đó thả vàocác giếng để tạo liên kết bổ sung với các mồi Mỗi mạch đơn DNA được nhân bảnthành hàng triệu bản bằng kỹ thuật PCR, tạo thành các cụm trình tự đặc hiệu Mộttấmkínhchứa hàngtriệucáccụmđặc hiệuthíchhợpđểđưavàomáyđọc trìnhtự.

Kỹ thuật giải trình tự tổng hợp sử dụng 04 loại nucleotide được đánh dấuhuỳnhquang.Mỗichutrìnhđọctrìnhtựđềucósựthamgiacủacả04loạinucleotide, đảm bảo độ chính xác cao hơn phương pháp chỉ có 01 loại nucleotidetham gia trong cùng một thời điểm Chu trình này lặp đi lặp lại nhiều lần, cho mộthình ảnh kết quả duy nhất tại mỗi cụm đặc hiệu Quy trình giải trình tự trên máyIllumina như sau: (1) Chuẩn bị và kiểm tra chất phản ứng reagent cartridge và flowcell;(2)Chuyểnmẫuvàomáyvàchạymáy; (3)Thudữliệutừmáygiảitrìnhtự.

Kết quả thu được sau khi kết thúc quá trình chạy là dữ liệu định dạng dướifile FASTQ Đây làmột định dạng kiểu vănb ả n đ ể l ư u t r ữ c á c t r ì n h t ự n u c l e o t i d e và các điểm chất lượng tương ứng Độ chính xác của mỗi lệnh gọi tên nucleotideđược ghi lại dưới dạng điểm chất lượng (Phred quality score), đo khả năng mộtnucleotideđược gọitênkhôngchínhxác.

Xác suấtlệnhgọi nucleotide khôngchínhxác Độchính xáccủa lệnhgọi

30(Q30) 1trong1000 99,9% Điểm chất lượng (Q) của một nucleotide nhất định được xác định bằngphương trình: Q=-10 log10(e), trong đó e là xác suất ước tính của lệnh gọi sai tênnucleotide Vì vậy, điểm chất lượng càng cao, xác suất gọi tên sai càng thấp (Bảng2.2).Điểmchấtlượngphảiđạtcácyêucầusau:Q10-độchínhxácgọit ê n nucleotide là 90%, Q20-độ chính xác gọi tên nucleotide là 99%, Q30-độ chính xácgọitênnucleotidelà99,9%.TỷlệQ30phảiđềutrên80%.

Quátrìnhphântíchvàchúgiảicácbiếnthểgồmcácbước:(1)Giónghàngvớihệ gen tham chiếu GRCh37; (2) Loại bỏ trình tự lặp; (3) Gióng hàng trình tự xungquanhIndel; (4)Chuẩnhóachấtlượngtrìnhtựđọc;(5)Gọitênbiếnthể;(6)chúgiảibiếnthể(Hình2.2).

Dữ liệu được gióng hàng với hệ gen tham chiếu GRCh37/hg19 sử dụng phầnmềm BWA (Burrows-Wheeler Aligner) BWA là một chương trình phần mềm liênkết trình tự các đoạn gen nhỏ khác nhau, với một bộ gen tham khảo lớn (gen người).Chương trình này bao gồm 3 thuật toán BWA-backtrack, BWA-SW và BWA- MEM.ThuậttoánđầutiênBWA- backtrackđượcthiếtkếchoviệcđọcchuỗitrìnhtự Illumina lên tới 100 bp, trong khi 2 thuật toán kia dùng cho các trình tự có khảnăngđọccaohơn,daođộngtừ 70bpđến1Mb.

CácphântửcósựtrùnglặpđượcloạibỏthôngquacôngcụPicard(http:// broadinstitute.github.io/picard/) Picardlà bộ công cụ đượcx â y d ự n g t r ê n nền tảng Java nhằm thao tác trên tập tin định dạng SAM và BAM Công cụ PicardMarkDuplicates sẽ kiểm tra việc sắp xếp dữ liệu trong tập SAM và BAM qua đócungcấpvịtrícácphântử trùnglặp.

Gióng hàng lại đoạn trình tự xung quanh indel, chuẩn hóa lại nucleotide, gọitên biến thể và lọc biến thể bằng công cụ GATK Đây là một công cụ được thiết kếđểp h â n tí ch d ữ l i ệ u t rì nh tự c ó d u n g l ư ợ n g c a o B ộc ô n g cụg ồ m n h i ề u cô n gc ụ khác nhau với trọng tâm chính là phát hiện các biến thể và kiểu gen đồng thời tậptrungvàoviệc đảmbảochấtlượngdữliệu.

Phânchiacácbiếnthểthànhcácnhómtheomứcđộảnhhưởngđếnchứcnăngcủa biến thể bằng phần mềm SnpEff Đây là công cụ chú thích và dự báo ảnh hưởngcủa các biến thể gen (thay đổi amino acid) Dữ liệu đầu vào của công cụ này là cácbiến thể đã được dự đoán (SNP, chèn, xóa và MNP), kết quả của giải trình tự và cóđịnh dạng VCF (Variant Call Format) Trong dữ liệu đầu ra, SnpEff phân tích cácbiến thể đầu vào để chú giải và tính toán các tác động mà các biến thể có thể tạo ratrên gen SnpEff đưa ra các kết quả như sau: kiểu gen và các điểm bị ảnh hưởng bởibiến thể, vị trí của các biến thể, cách thức các biến thể ảnh hưởng đến quá trình tổnghợpprotein,sosánhvớicácdữliệukhácđểtìmcácbiếnthểđãbiết.

2.6.3 Sànglọccácbiếnthểtrên cácgenchứabiếnthểliênquan Để xác định các biến thể có tiềm năng gây bệnh xirô niệu, rối loạn chu trìnhchuyển hóa urê, loạn dưỡng cơ, quá trình sàng lọc biến thể được thực hiện theo quytrìnhnhưsau:

(1)LọccácbiếnthểdựatrêntầnsốallenMAFG, p.E330G; c.1103C>T, p.P368L, thể dị hợp tử đơn trên genBCKDHBcótầnsốallen˂0,01,vớichỉsốSIFTtươngứnglà0,003và0,001,chỉs ố PolyPhen-2 lần lượtlà 1,0 và 0,999 Hai biến thể này xảy ra ở exon 9 và 10 củagenBCKDHB, được dự đoán gây ra sự thay thế glutamine (E) bằng glycine (G) ở vịtrí 330 và proline (P) bằng leucine (L) ở vị trí 368 Trong đó, biến thể c.989A>G(p.E330G) đã được báo cáo trong cơ sở dữ liệu gnomAD với tần số allen 3,98.10 -6 vàkhôngđượctìmthấy trongCSDLClinVar.Biếnthểc.1103C>T( p P 3 6 8 L ) không được phát hiện trong CSDL ExAC cũng như gnomAD và ClinVar Do đó, cảhaibiếnthểnàyđềulàbiếnthểmới.

Kết quả giải trình tự WES đã phát hiện được 108.544 biến thể ở người bệnhR02 Sàng lọc trên các gen có liên quan đến bệnh xirô niệu, phát hiện được 02 biếnthể trên genBCKDHA, 02 biến thể trên genBCKDHB, 03 biến thể trên genDBTvà05 biến thể trên genDLD(Phụ lục 6) Hai biến thể c.1016C>T, p.S339L trênBCKDHBvàc.1210-10_1210-

6/11 Thaythế Dịhợptử c.704G>A p.C235Y Mới đó, chỉ có biến thể c.1016C>T (p.S339L) có chỉ số SIFT và PolyPhen-2 (0,001 và0,987), nằm trong ngưỡng “gây hại” Biến thể c.1016C>T, p.S339L nằm trên NSTsố6,exon9củagenBCKDHB,dẫnđếnsựthaythếserine(S)bằngleucine(L)tại vị trí 399 trên chuỗi polypeptide Biến thể c.1016C>T(p.S339L) đã được công bốtrêncơ sở dữ l i ệ u g n o m A D v ới t ầ n số a l l e n 3 , 5 3 4 1 0 -

6,đ ư ợ c bá o c á o là biế nt h ể “gâybệnh”vớimãsốrs398124561 trongCSDL ClinVar.

Bảy biến thể trên genBCKDHA, 09 biến thể trên genBCKDHB, 05 biến thểtrênDBTvà 06 trên genDLDđược phát hiện trong tổng số 93.074 biến thể từ kếtquả giải trình tự WES ở người bệnh R03 (Phụ lục 6) Bốn biến thể gồm c.1A>T,p.M1L;c 7 0 4 G > A , p C 2 3 5 T ; c 7 4 3 - 2 8 d e l T t r ê n g e nB C K D H B, c.1281+156_1281+157delTT trên genDBT,có tần số allen ˂0 , 0 1 T r o n g s ố đ ó , biến thểc.1A>T,p.M1L trên genBCKDHBxảy ra tại exon0 1 , n u c l e o t i d e 0 1 , c ủ a bộ ba mở đầu ATG, dẫn đến sự biến đổi amino acid mở đầu methione (M) thànhleucine (L), có tiềm năng gây bệnh cao do nhiều bằng chứng cho thấy biến thể tại vịtrí này có liên quan đến nhiều loại bệnh [132] Biến thể này được báo cáo trongCSDL gnomAD với tần số allen 1,29.10 -5 , ClinVar với mã sốrs1005542482nhưngkhôngđượctìmthấytrongExAC.Biếnthểc.704G>A(p.C235Y)t rêng e nBCKDHBv ớ iđ i ể m S I F T v à P o l y P h e n -

2 đ ư ợ c đ á n h g i á l à n g u y hạ i ( đ i ể m t ư ơ n g ứng 0,001 và 1,0) Biến thể này xảy ra tại nucleotide 704, exon

6, được dự đoán sẽgây ra sự thay thế cystein (C) bằng tyrosine (T) ở vị trí 235 trên trình tự của chuỗipolypeptide Thông tin trong 03 CSDL bao gồm ExAC, gnomAD và ClinVar khôngtìmthấybiếnthểc.704G>A(p.C235Y).

Kết quả giải trình tự WES phát hiện được 93.967 biến thể ở người bệnh R04trong đó có 10 biến thểBCKDHA, 07 biến thể trên genDBT, 04 biến thể trên genDLD(Phụ lục 6) Trong số đó, 03 biến thể c.1282-19_1282- 10delTTTTTTTTTT,c.1210-4delA, c.263_265delAAG trên genDBTcó tần số allen ˂ 0,01 Tuy nhiên,biến thể c.1210-4delA, được CSDL ClinVarđánh giá là “lành tính” Chỉ biến thểc.263_265delAAG trên genDBT,có tương tác giả định (putative impact) trung bìnhđượclựachọn.Biếnthểnàyxảyratrênexon4trêngenDBT,gâyrasựxóabỏbộba mã hóa cho amino acid glutamine (E) tại vị trí 88 (p.E88del) Biến thể này đượcghi nhậntrong CSDLClinVarvớim ã s ố r s 1 2 1 7 0 5 0 8 4 9 , n h ư n g k h ô n g đ ư ợ c t ì m thấytrongCSDLExACvàgnomAD.

Người bệnh R01 mang 02 biến thể, dị hợp tử phức đơn trên genBCKDHBc.989A>G, p.E330G và c.1103C>T, p.P368L Sự phân ly của các biến thể di truyềnở người bệnh và các thành viên trong gia đình người bệnh R01

(bố, mẹ, chị) đượckiểm chứng lại bằng phương pháp giải trìnhtự Sanger.K ế t q u ả g i ả i t r ì n h t ự c h o thấy biến thể c.989A>G, p.E330G trên exon 9 ở người bệnh được di truyền từ ngườimẹ trongkhibiếnthểc.1103C>T,p.P368Lcónguồngốctừngườibố(Hình3.2).

(a) VịtrícủabiếnthểtrêngenBCKDHB;(b)Sơđồphảhệgiađìnhngườibệnhvàkếtquả giải trình tự Sanger phát hiện biến thể c.989A>G, p.E330G và c.1103C>T, p.P368L ởcácthànhviêntronggiađình.Biểutượngmộtnửahìnhđen:NgườikiểuhìnhlànhmanggenbệnhtrênNSTt hường;Hìnhmàuđen:Ngườibiểu hiệnbệnh,Hìnhkhôngmàu:Ngườibìnhthường;Hình vuông: Nam;Hìnhtròn: Nữ, Mũi tên:Người bệnh.

Cặp mồi BCK-9F và BCK-9R được thiết kế để khuếch đại đoạn gen có kíchthước 314 bp trên exon 9,genBCKDHBbằng kỹ thuậtPCR.K ế t q u ả k i ể m c h ứ n g và phân tích di truyền ở người bệnh và các thành viên trong gia đình bao gồm bố,mẹ, anh trai và chị gái bằng phương pháp giải trình tự Sanger cho thấy người bệnhmang biến thể đồng hợp tử dạng thay thế c.1016C>T, p.S339L Biến thể xảy ra trênexon 9, C được thay thế bằng T ở vị trí 1.016 trên trình tự polynucleotide Sự thaythế này dẫn đến sự biến đổi serine (S) thành leucine (L) tại vị trí 339 trên chuỗipolypeptide của protein BCKDHB Đặc biệt, bố, mẹ, anh và chị gái người bệnh đềulà những người mang biến thể dạng dị hợp tử nhưng không biểu hiện triệu chứngbệnh Như vậy, người bệnh nhận 01 allen biến thể từ bố và 01 allen biến thể từ mẹ(Hình3.3).

(a) Vị trí của biến thể c.1016C>T (p.S339L) trên genBCKDHB, (b) Sơ đồ phả hệgia đình người bệnh và kết quả giải trình tự Sanger phát hiện biến thể c.1016C>T, p.S339Lở các thành viên trong gia đình Biểu tượng một nửa hình đen: Người kiểu hình lành manggen bệnh trên NST thường; Hình màu đen: Người biểu hiện bệnh, Hình không màu: Ngườibìnhthường; Hình vuông: Nam;Hình tròn: Nữ, Mũi tên:Người bệnh.

Bệnhrốiloạn chutrìnhchuyển hóaurê(UCD)

Trêncơsởcácthôngtinvềlâmsàng,sinhhóavàtiềnsửgiađình,03ngườibệnhđượcc hẩn đoánrốiloạn chutrình chuyểnhóaurêbởicácbácsỹKhoaNộitiết

D i t r u y ề n, BệnhviệnN h i T ru ng ương, đ ư ợ c t r ì n h b à y chit i ế t tạ iBảng3.7vàPhụlục2,cụthể:

Giới tính Tuổi Kếtquả lâmsàng Kếtquảcậnlâmsàng

3.2.2 TáchchiếtDNA tổngsố Đểt h ự c h i ệ n n g h i ê n c ứ u , m ẫ u D N A t ổ n g s ố c ủ a n g ư ờ i b ệ n h v à c ác t hà nh viên trong 03 gia đình có người mắc bệnh UCD được tách bằng bộ kit QIAampDNA Blood Mini Kit -QIAGEN, sau đó được kiểm tra bằng phương pháp điện diDNA trên gel agarose1% (Hình 3.9) Các băng DNA tổng số đều hiện vạch rõ ràng,khôngbịđứtgãyvànhiễmRNA.

Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% của người bệnhR05,R06,R07vàcácthànhviêntronggiađình.

R05, R06, R07: Người bệnh UCD; B: Bố người bệnh; M: Mẹ người bệnh; C: Chị ngườibệnh;A: Anh người bệnh.

MẫuDNAtổngsốsauđóđượcđoODởbướcsóng260nmvà280nmđểxác định nồng độ vàkiểm tra độ tinh sạch.Các giá trị thu nhậnđ ư ợ c l à k ế t q u ả trung bình của 03 lần đo Mẫu DNA tổng số có tỷ số A260 nm/A280 nm nằm trongkhoảng 1,83 - 1,93 (Phụ lục 6), chứng tỏ mẫu DNA của người bệnh và các thànhviêntronggiađìnhcóđộtinhsạnhcaovàphùhợpđểsửdụngchophảnứngPCR vàgiảitrìnhtự genthếhệmới.

Dữ liệu giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa được tạo ra từ máy giải trình tựthếhệmới(Illumina)của03ngườibệnhlầnlượtlà7,2;11,4và8,1Gb,tổngsốđoạnđọclà49.094. 014;76.972.420;55.118.778(Bảng3.8).

≥ 93,1% Sau khi giải trình tự trên máy Illumina, kiểm tra chất lượng đọc bằng phầnmềm FastQC, dữ liệu trình tự được sắp xếp và so sánh với ngân hàng gen người(hg19)bằngphầnmềmBWA0.7.1(Bảng3.8).

Sốtrìnhtực òn lại saukhi loại bỏcác đoạntrùngl ặp

Sốđoạntrìnhtựđư ợcgiónghàngth uộcvùng gen quantâm

Trung vịđộs â u bao phủvùng quantâm(x )

Kết quả xác định và chú giải biến thế cho thấy số lượng biến thể thay thế mộtnucleotide và biến thể thêm/mất nucleotide được phát hiện trong dữ liệu WES lầnlượtởngườibệnhR05là94.706,13.103;ngườibệnhR06là97.840,13.811vàngườibệnh R07 là 95.064, 13.212 Các biến thể được phân chia thành 07 nhóm bao gồmbiến thể đồng nghĩa, biến thể thay thế, thêm bộ ba kết thúc, mất bộ ba kết thúc, biếnthể dịch khung, thêm đoạn ngắn, mất đoạn ngắn theo mức độ ảnh hưởng chức năngcủabiếnthểbằngphầnmềmSnpEff(chitiếttạiBảng3.9).

Kết quả sàng lọc trên 8 gen liên quan đến bệnh UCD bao gồmCPS1,

OTC,ASS,ASL, ARG1, NAGS,SLC25A13,SLC25A15ở03ngườibệnhchothấy:

Người bệnh R05 mang 13 biến thể trên genCPS1, 11 biến thể trên genASS1,04 biến thể trên genOTC, 02 biến thể trên genASL, 02 biến thể trênARG, 02 biếnthể trên genNAGS, 05 biến thể trên genSLC25A13, 04 biến thể trên genSLC25A15(Phụ lục 7) Trong đó, 10 biến thể có tần số allen ˂ 0,01 nhưng chỉ có 02 biến thểc.717+1G>A trên genOTCvà c.1048A>G, p.T350A trên genC P S 1có tương tácgiảđịnh(putativeimpact)caovàtrungbình.Tuynhiên,cácchỉsốSIFTvàPolyphen-2 của biến thể c.1048A>G, p.T350A cho thấy đây là biến thể “lành tính”.Ngoài ra, CSDL ClinVar cũng xác nhận c.1048A>G, p.T350A trên genC P S 1làbiếnt h ể “ c ó t h ể l à n h t í n h ” D o đ ó , b i ế n t h ể c ò n l ạ i , I V S 7 + 1 G >

A t r ê n g e nO T C,đượcxemxétlàbiếnthểcó tiềmnănggâybệnh ởngườibệnhR05(Bảng3.10).

Người bệnh R06 xuất hiện 12 biến thể trên genCPS1, 04 biến thể trên genOTC, 08 biến thể trên genASS1, 10 biến thể trên genASL, 01 biến thể trênARG, 05biến thể trên genSLC25A13, 03 biến thể trên genSLC25A15(Phụ lục 7) Kết quảsàng lọc trên cơ sở tần suất allen ˂ 0,01 cho thấy, 10 biến thể thỏa mãn tiêu chí này.Hai trong số đó, c.365A>T, p.G122V trên genOTCvà c.1048A>G, p.T350A trêngenCPS1có tương tác giả định (Putative impact) trung bình, với chỉ số SIFT,Polyphen-2 tương ứng là 0; 1,0 và 0,067; 0,01 Cơ sở dữ liệu ClinVar xác nhận biếnthể c.1048A>G, p.T350A trên genCPS1là “có thể lành tính” Do đó, biến thểc.365A>T, p.G122V trên genOTCđược lựa chọn là biến thể có tiềm năng gây bệnhởngườibệnh R06(Bảng 3.10).

Mười hai biến thể trên genCPS1, 04 biến thể trên genOTC, 11 biến thể trêngenASS1, 10 biến thể trên genASL, 01 biến thể trênARG1, 06 biến thể trên genSLC25A13, 04 biến thể trên genSLC25A15được phát hiện ở Người bệnh R07 (Phụlục 7) Trong số đó, 08 biến thể có tần số allen < 0,01, 05 biến thể trong vùng intronbị loại bỏ Còn lại 03 biến thể dạng dị hợp tử bao gồm c.1048A> G trên genCPS1,c.1065A> G trên genOTCvà c.656-5C> A trên genASL Tuy nhiên, 02 biến thểc.1048A> G trên genCPS1và c.656-5C> A trên genASLđã được xác định là “lànhtính” trong CSDL ClinVar Chính vì vậy, biến thể c.1065A> G trên genOTCđượcxácđịnhlàbiếnthểcótiềmnănggâybệnhởngườibệnhR07(Bảng3.10).

Người bệnh Gen Kiểub iếnthể

R07 Mấtbộba kếtthúc Dịhợptử c.1065A>G p.*355Wext*14 HGMDID

Như vậy, cả 03 người bệnh mắc bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê đềuxuất hiện biến thể trên genOTCmã hóa cho ornithine carbamylase Cụ thể, ngườibệnh R05 mang biến thể trượt gen IVS7+1G>A, G bị thay thế thành A tại vị trí đầutiên của intron 7, đã được công bố là biến thể “gây bệnh” trên cơ sở dữ liệu ClinVar(RCV000083542.1,r s 6 6 5 0 0 0 2 7 ) N g ư ờ i b ệ n h R 0 6 m a n g b i ế n t h ể t h a y t h ế , c h ư a được công bố c.365A>T (p.E122V) Biến thể làm amino acid glutamine (E) tại vị trí122 bị biến đổi thành valine (V) Biến thểc 3 6 5 A > T c h ư a đ ư ợ c b á o c á o t r o n g CSDL 1.000 bộ gen người, CSDL vùng mã hóa, CSDL tổng hợp hệ gen và CSDLWES người Việt Nam (n = 54) Do đó, đây là một biến thể mới trên genOTC.Người bệnh R07mang biến thể A>G tại vịt r í 1 0 6 5 t r ê n e x o n

1 0 c ủ a g e n OTC.Biến thể này gây ra sự thay thế của bộ ba kết thúc (TGA) thành tryptophan (W)(TGG) ở vị trí 355 (p.*355Wext*14) trên chuỗi polypeptide.

Bộ ba kết thúc mớiđược dự đoán nằm xuôi dòng cách vị trí bộ ba kết thúc ban đầu

42 nucleotide vàvùng đầu C trong cấu trúc bậc 1 của protein OTC được kéo dài thêm 14 amino acid.Biến thể c.1065A>G không được tìm thấy trong các CSDL như 1.000 hệ gen người,vùng mã hóa, CSDLClinVar và CSDLWES người Việt Nam.B i ế n t h ể n à y đ ã được báo cáo là một biến thể gây bệnh trong CSDL biến thể gen người với mã sốHGMDIDCM973235.

Phương pháp giải trình tự Sanger được sử dụng để kiểm chứng biến thểIVS7+1G>A ở người bệnh và các thành viên trong gia đình (bố, mẹ và chị) Cụ thể,đoạngenOTCcókíchthướclýthuyết314bp,mangbiếnthểIVS7+1G>Acủangườibệnh, bố, mẹ và chị gái được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR Sản phẩm khuếch đạiđược sử dụng để giải trình tự Sanger.Kết quả giải trình tự Sanger cho thấy, biến thểIVS7+1G>A trên genOTCở người bệnh R05 được di truyền từ mẹ trong khi bố vàchịgáikhôngxuấthiệnbiếnthể(Hình3.10).

(a)VịtrícủacácbiếnthểtrêngenOTC(b)Sơđồphảhệgiađìnhngườibệnhvàkếtquảgiảitrình tự Sanger phát hiện biến thể IVS7+1G>A ở các thành viên trong gia đình Biểu tượngvới chấm đen ở giữa: Người kiểu hình lành mang gen bệnh trên NST giới tính; Hình màuđen: Người biểu hiện bệnh, Hình không màu: Người bình thường; Hình vuông: Nam; Hìnhtròn:Nữ,Mũitên:Ngườibệnh;Hìnhgạchchéo:Đãmất;Hìnhtrònnhỏ:Sẩythai.

NgườibệnhR06mangbiếnthểc.365A>T,p.E122VtrêngenOTCdẫnđến sự thay thế acid glutamic (E) thành valine (V) tại vị trí 122 trên trình tự chuỗipolypeptide củaprotein OTC.ĐoạngenOTCdài447bpmangbiến thểđ ư ợ c khuếch đại thành công ở người bệnh và các thành viên trong gia đình được sử dụngđểgiảitrìnhtự Sanger,kiểmchứngbiếnthể.

Kết quả giải trình tự Sanger xác nhận biến thể c.365A>T, p.E122V trên genOTCở người bệnh R06 được di truyền từ người mẹ trong khi bố của người bệnhkhông mang biếnthể(Hình3.11).

(a) VịtrícủacácbiếnthểtrêngenOTC(b)Sơđồphảhệgiađìnhngườibệnhvàkếtquả giải trình tự Sanger phát hiện biến thể c.365A>T, p.E122V ở các thành viên trong giađình Biểu tượng với chấm đen ở giữa: Người kiểu hình lành mang gen bệnh trên NST giớitính; Hình màu đen: Người biểu hiện bệnh, Hình không màu: Người bình thường; Hìnhvuông:Nam; Hình tròn:Nữ,Mũi tên: Người bệnh;Hình gạch chéo: Đãmất.

CácđiềukiệnphảnứngPCRđượctốiưuhóađểkhuếchđạiđoạngen605b pthuộc exon 10 của genO T C.K ế t q u ả đ i ệ n d i t r ê n g e l a g a r o s e

1 , 5 % c h o t h ấ y các sản phẩm PCR hoàn toàn đặc hiệu và có kích thước phù hợp với tính toán lýthuyếtkhithiếtkếmồi.

Kết quả giải trình tự Sanger cho thấy các thành viên gia đình gồm bố mẹ vàanh trai đềum a n g k i ể u g e n b ì n h t h ư ờ n g , k h ô n g m a n g b i ế n t h ể ( H ì n h 3 1 2 ) N h ư vậy,người bệnh R07m a n g b i ế n t h ể c 1 0 6 5 A > G , p * 3 5 5 W e x t * 1 4 ở t r ạ n g t h á i d ị hợptử làbiến thểmớiphátsinh(denovo).

(a) VịtrícủacácbiếnthểtrêngenOTC(b)Sơ đồphảhệgiađìnhngườibệnhvàkếtquả giải trình tự Sanger phát hiện biến thể c.1065A>G, p.*355Wext*14 ở các thành viêntrong gia đình Hình màu đen: Người biểu hiện bệnh; Hình không màu: Bình thường; Hìnhvuông:Nam; Hình tròn:Nữ.

Cơ sở dữ liệu ClinVar ghi nhận biến thểIVS7+1G>Alà 01 biến thể gây bệnhvới mã số RCV000083542.1, rs66500027 Biến thể này đươc dự đoán là “gây bệnh”bằngphầnmềmMustationTaster và“gâyhại”bằngcôngcụCADD.

Sử dụng phần mềm MaxEntScan::score5ss để phân tích biến thểIVS7+1G>Atại vị trí ghép nối giữa exon và intron thông qua điểm số MaxENT, MDD,

MM,WMM Các giá trị này càng cao, độ liên kết của vị trí ghép nối tương ứng càng lớn.Kết quả phân tích cho thấy biến thểIVS7+1G>Acóc á c c h ỉ s ố

M D D , MM,WMMthấphơnnhiềusovớiđốichứng(Bảng3.11).Dođó,biếnthểIVS7+1G

Bệnhloạndưỡngcơ (MD)

Hai anh em ruột trong một gia đình người Xinh Mun được chẩn đoán loạndưỡng cơ bởi các bác sỹ Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện NhiTrung ương, với các triệu chứng về lâm sàng và sinh hóanhư sau( B ả n g

Giới tính Tuổi Kếtquảlâmsàng Kếtquảcậnlâmsàng

Giới tính Tuổi Kếtquảlâmsàng Kếtquảcậnlâmsàng

- Không có dấu hiệu phì đại cơlưỡihoặccơ bắpchân.

3.3.2 TáchchiếtDNA tổngsố Để thực hiện phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa, mẫu DNA tổngsố của người bệnh R08, R09 và bố mẹ được tách bằng bộ kit QIAamp DNA BloodMini Kit - QIAGEN Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 1% chothấy,D N A t ổ n g s ố c ủ a t ừ n g t h à n h v i ê n t r o n g g i a đ ì n h h i ệ n b ă n g v ạ c h r õ r à n g , khôngbịđứtgãy,khôngbiểuhiệnnhiễmRNA (Hình3.14).

R08,R09vàBốMẹ R08,R09: Ngườibệnh;Bố:Bốngườibệnh;Mẹ:Mẹngườibệnh.

Sau đó, mẫu DNA tổng số được xác định nồng độ DNA và kiểm tra độ tinhsạch bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm Kết quả cho thấymẫu DNA tổng số cótỷ số A260 nm/A280n m n ằ m t r o n g k h o ả n g

Do sự đa dạng di truyền gen lặn/trội của các gen liên quan bệnh loạn dưỡngcơ, bốn thành viên trong gia đình gồm bố, mẹ, người bệnh R08, R09 được giải trìnhtựtoànbộvùngmãhóa.Sốliệuthốngkêchấtlượnggiảitrìnhtự02ngườibệnhvà bố mẹ được thể hiện ở Bảng 3.15 Cụ thể, dữ liệu trình tự ở người bệnh R08, R09 vàbố, mẹ lần lượt là 9,2; 11,2; 11,3 và 10,7 Gb; tổng số đoạn đọc từ 62.355.218-76.051.830 (Bảng 3.15) Điểm chất điểm chất lượng Phred trên 30 (Q30) cao ≥93,0% Tỷ lệ gióng hàng thành công ở cả bốn mẫu đều ≥ 99,8% Để xử lý dữ liệusau khi gióng hàng thành công, phần mềm Picard được sử dụng để loại bỏ các phântử trùng lặp Số trình tự còn lại sau khi loại bỏ các phân tử trùng lặp chiếm tỷ lệ caotừ 85,2 - 91,2% Các đoạn trình tự được đối chiếu vào vùng mã hóa Kết quả đốichiếu cho tỷ lệ thànhcông ≥ 64,7%.Trungvị độ sâub a o p h ủ v ù n g q u a n t â m c ủ a cácmẫunằmtrongkhoảng80,9-107,7X.Tỷlệphầntrăm(%)vớiđộsâubaophủ

>30X của các mẫu cao từ 86,6 - 93,7% Các kết quả trên cho thấy các trình tự thuđược là đángtincậy(Bảng3.15).

Số trình tựcòn lại saukhi loại bỏcácđoạn trùnglặp

Sốđoạntrìnht ựđượcgióngh àngthuộcvùng genquan tâm

Kết quả xác định và chú giải biến thế cho thấy số lượng biến thể thay thế mộtnucleotide và biến thể thêm/mất nucleotide được phát hiện trong dữ liệu WES lầnlượt ở người bệnh R08 là 95.859, 13.626; người bệnh R09 là 97.062, 13.626; ở bố là96.300, 14.100 và ở mẹ là 96.629, 13.762 Dựa vào mức độ ảnh hưởng chức năng,các biến thể được phân chia làm 07 nhóm bao gồm biến thể đồng nghĩa, biến thểthay thế, thêm bộ ba kết thúc, mất bộ ba kết thúc, biến thể dịch khung, thêm đoạnngắn,mấtđoạnngắn(Bảng3.16).

Các biến thể sau khi được phân loại, được tiếp tục sàng lọc theo các tiêu chísau: tần số xuất hiện biến thể, ảnh hưởng của các biến thể, gen ưu tiên, cơ sở dữ liệunội bộ và kiểu di truyền Các biến thể trên 578 gen có liên quan đến bệnh rối loạnthầnkinhcơđượcsànglọc[110].Tầnsốxuấthiệnbiếnthểđãđượckiểmtratrênc ơ sở dữ liệu 1000 genome (http://browser.1000genomes.org) Các biến thể hiếm(tần số allen

T(p.H260Y)vàc.2987G>A (p.C996Y) ở cả hai người bệnh được lựa chọn Biến thể c.778C>T gâyra sự thay thế histidine thành tyrosine (Y) tại vị trí 260; Biến thể c.2987G>A làmcysteine (C) tại vị trí 996 bị biến đổi thành tyrosine (Y) (Bảng 3.17) Hai biến thểnày cũng được phát hiện ở bố và mẹ, ở trạng thái dị hợp tử nhưng không biểu hiệntriệuchứngbệnh.

Bảng 3.17.Kết quả sàng lọc biến thể có tiềm năng gây bệnh loạn dưỡng cơởngườibệnhR08,R09

Người bệnh Gen Kiểub iếnthể

Kết quả giải trình tự của 02 người bệnh R08, R09 và bố mẹ được phân tích,so sánh với trình tự genLAMA2trên cơ sở dữ liệu NCBI (NM_000426.3) ghi nhậnhai người bệnh đều mang 02 biến thể, trạng thái đồng hợp tử trên genLAMA2baogồm c.778C>T, p.H260Y và c.2987G> A, p.C996Y Hai biến thể này ở trạng thái dịhợp tử cũng được phát hiện ở bố và mẹ (Hình 3.15) Như vậy, cả hai người bệnh ditruyền01allenmangbệnhtừmẹvà01allenmangbệnhtừ bố.

Biến thể c.778C>T dẫn đến sự thay thế histidine (H) ở vị trí amino acid 260thành tyrosine(Y) (p.H260Y).Biến thể c.2987G>Achuyển cysteine (C)thànhtyrosine (Y) tại vị trí amino acid 996 Biến thể c.778C>T (p.H260Y) không phải làmột biến thể mới đã được CSDL công bố với mã số rs780568352, nhưng là biến thểrất hiếm ở trạng tháidị hợp tửv ớ i t ầ n s ố a l l e n r ấ t t h ấ p

4 / 2 5 0 6 4 4 e x o m e t r o n g CSDLtổnghợphệgen(gnomAD)và3/120.950exometrongCSDLExomeAggr egation Consortium (ExAC) Những người mang biến thể này ở trạng thái dịhợptửlànhữngngườikiểuhìnhlànhmanggenbệnh.Biếnthểc.2987G>A

(a)VịtrícủacácbiếnthểtrêngenLAMA2(b)Sơđồphảhệgiađìnhngườibệnhvàkếtquảgiảitrìn htựSangerpháthiệnbiếnthểc.778C>T,p.H260Yvàc.2987G>A,p.C996Y ở các thành viên trong gia đình F8 Biểu tượng nửa đen: Người kiểu hình lànhmanggenbệnhtrênNSTthường.Màu đen:Ngườibiểuhiệnbệnh;Hình vuông: Nam; Hìnhtròn:Nữ; Mũi tên:Ngườibệnh.

Kết quả phân tích 02 biến thể thay thế c.778C>T, p.H260Y và c.2987G>A,p.C996Y trên genLAMA2bằng các công cụ tin sinh cho thấy, biến thể c.778C>T(p.H260Y) được dự đoán “có thể gây hại” hoặc “gây bệnh” bởi các phần mềm trựctuyếnnhưPolyPhen-2,MutationTaster,PANTHER,Align- GVGD,MutPred,UDM-Predictor, CADD và PROVEAN, nhưng “dung nạp” hoặc

“trung tính” bởiSIFT, Fathmm, SNP & GO, PhD-SNP và SNAP, PON-P2 và Mutation Assessor.Biến thể c.2987G>A (p.C996Y) được dự đoán là có “ảnh hưởng cao”, “gây hại” và“gâybệnh”bởi15côngcụtinsinhvớiđiểmsốcao (Bảng3.18).

Bảng 3.18.Phân tích ảnh hưởng của 02 biến thể c.778C>T (p.H260Y) vàc.2987G>A (p.C996Y) trêngenLAMA2bằng mộtsốcôngcụtin sinh

CADD(Phred-scaledscore) Cókhảnănggâyhại(24,1) Cókhảnănggâyhại(29,7)

PhD-SNP Trungtính(RI6) Gâybệnh(RI7)

SNP&GO Trungtính(RI5) Gâybệnh(RI9)

Biến thể p.H260Y nằm ở cuối domain laminin N tương ứng với amino acid33–285 trong khi biến thể p.C996Y nằm trong vùng laminin-EGF 10 tương ứng vớiaminoacid967-

1013củaproteinLAMA2(Hình3.16a).Biếnthểc.778C>T(p.H260Y)cóthểlàmthayđ ổiđộlớnvàđộphâncựccủamộtsốaminoacidgầnđó, do đó ảnh hưởng cấu trúc cục bộ cũng như sự gấp khúc của protein Đặc biệt,vùng laminin N của chuỗi laminin-α2 rất quan trọng đối với quá trình trùng hợplaminin-211,dođó,biếnthểp.H260Ycóthểthayđổiquátrìnhnày.

(a) Vị trí của hai biến thể trên protein LAMA2 LAMA2 bao gồm đầu laminin N(LN), 17 vùng giống yếu tố tăng trưởng biểu bì laminin-EGF (EGF), 2 laminin B (LB),laminin I (I), laminin II (II) và 5 laminin globar (LG) Gióng hàng acid amin xung quanh vịtrí biến thể của protein LAMA2 của người với một số loài động vậtkhác cho thấy tính bảotoàn cao tại hai vị trí xảy ra biến thể Vị trí amino acid thay đổi được đánh dấu trong khungkẻđỏ.

Bệnh xirôniệu(MUSD)

Xirô niệu là một bệnh di truyền gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường.Người bệnh không thể chuyển hóa được các amino acid mạch nhánh (leucine,isoleucine và valine) khiến cho các sản phẩm của BCAA tích tụ trong máu, nướctiểuvàd ịc hnã o tủy M ặ c dùq uy luậtditruyền của bệ nh xi rô ni ệu tuânt he om ô hình di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, các biến thể trên từng gen cụ thểđã được chứng minh là nguyên nhân gây ra bệnh xirô niệu Đến năm 2019, 265 biếnthể trên các gen liên quan đến bệnh xirô niệu đã được ghi nhận trong đó 88 biến thểtrên genBCKDHA, 85 biến thểBCKDHB, 71 biến thể trên genDBTvà 21 biến thểtrên genDLD[129] Tuy nhiên, đến nay (9/2021) theo CSDL ClinVar, con sốn à y đã tăng lên 1.588 biến thể trong đó 375 biến thể trên genBCKDHA(chiếm 23%),433 biến thể trên genBCKDHB(chiếm 27%), 457 biến thể trên genDBT(chiếm28%) và 323 biến thểtrên genDLD(chiếm 20%) Sựg i a t ă n g m ộ t c á c h n h a n h chóngphổbiếnthểtrêncácgenliênquanđếnMUSDchothấymứcđộqu antâmcủacác bác sỹ,cácnhànghiêncứuđốivớiloạibệnhnày.

Các biến thể trên genBCKDHBhoặcDBTdẫn đến sự sai hỏng trong chứcnăngcủathànhphầnE1βketoacidhoặcE3,làmsuygiảmhoạtđộngcủaphứchợpBCK D,có thể dẫn đến sự tích tụ các BCAA và BCKA và là nguyên nhân gây bệnh MUSD.Sựs u y g i ả m c h ứ c n ă n g c ủ a p h ứ c h ợ p B C K D l à m t ă n g n ồ n g đ ộ c á c a m i n o a c i d mạch nhánh, đặc biệt là leucine, có thể cạnh tranh với các amino acid khác để vậnchuyển qua hàng rào máu - não, khiến cho quá trình sinh tổng hợp protein và loại bỏmyelin( d e m y e l i n a t i o n ) t r o n g n ã o b ị s u y giảm T h ê m v à o đ ó , s ự t í c h t ụ c á c k e t o acidmạchnhánhcóthểứcchếhoạtđộngcủapyruvatedehydrogenasevàα- ketogutaratedehydrogenase, từ đó làm rối loạn chức năng chu trình Krebs, dẫn đếnhiện tượng tăng tích tụ nước trong tế bào và phù não Ngoài ra, dưới tác động củacác tác nhân stress oxi hóa, leucine có thể là các chất chuyển hóa chính gây tổnthươngcáctếbàonãoởngườibệnhMUSD.

Người bệnhR01, R02,R03và R04 xuấthiện các triệu chứngb ệ n h t ạ i c á c thời điểm lần lượt 02, 05, 13 và 06 ngày tuổi như suy hô hấp, keton niệu, nồng độleucine/isoleucine trong máu tăng cao, MRI não bất thường (người bệnh R04).Ngoài ra, khi được điều trị bằng các phương pháp dành cho người mắc bệnh xirôniệun h ư t r u y ề n g l u c o s e , n g ư n g b ú , l ọ c m á u , n g ư ờ i b ệ n h t r ở l ạ i t r ạ n g t h á i b ì n h thường Dựa vào triệu chứng lâm sàng, trên cơ sở đề xuất của Blackburn và cộng sự(2017),nhữngngườinàyđược xếpvàonhómbệnhMUSD,thểcổđiển[4].

Trên cơ sở mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình, người bệnh R01, R02và R03 xuất hiện các biến thể trên genBCKDHBnên thuộc nhóm bệnh MUSD kiểuE1b, trong khi người bệnh R04 thuộc nhóm bệnh MUSD kiểu E2 do mang biến thểtrêngenDBT.

Người bệnh R01 mang 02 biến thể, thể dị hợp tử c.989A>G, p.E330G vàc.1130A>T, p.P368L trên genBCKDHB, biểu hiện các triệu chứng lâm sàng củabệnh.Tuynhiên,bốmẹcủangườibệnh,mỗingườimangmộtbiếnthể,thểdịhợpt ử (bố - c.989A>G, p.E330G; mẹ - c.1103C>T, p.P368L), nhưng không xuất hiệntriệu chứng Như vậy, sự kết hợp của 02 biến thể trên genBCKDHBcó thể lànguyên nhân gây ra kiểu hình ở người bệnh Vị trí xuất hiện biến thể E330 trongnghiên cứu này tương tự với một số nghiên cứu đã được công bố trước đó Cụ thể,biến thể thay thế c.988G>A, p.E330K trên gen BCKDHB đã được phát hiện ở 01 bégái 03 tuổi, trong một gia đình Iran có hôn nhân cận huyết [123] và 03 bé trai (9ngày, 15 ngày và 4 tháng tuổi) và 01 bé gái 14 ngày tuổi người Iran [134] Cơ sở dữliệu ClinVar xác nhận c.988G>A, p.E330K là một biến thể “gây bệnh” Trong khiđó, tại vị trí P368 trên genBCKDHBđến nay chưa phát hiện được bất kỳ biến thểnào.

Biến thể thứ nhất ở người bệnh R01, c.1130C>T, p.P368L xuất hiện tại exon10 genBCKDHB Biến thể p.P368L gây ra sự thay thế proline (với cấu trúc cứngnhắc) thành leucine (cấu trúc mạch nhánh mở, có thể làm tăng tính linh hoạt củaprotein) từ đó làm rối loạn quá trình gấp khúc, tác động bất lợi đến quá trình đónggói, độ ổn định cũng như chức năng tổng thể của protein Ngoài ra, P368 nằm tạivùng đầu C ở giao diện của tiểu đơn vị βketoacid và α’ Do đó, sự thay đổi P368 có thể làmthay đổi độ ổn định của tiểu phần E1βketoacid, gây rối loạn hoạt động của phức hợp BCKD.Giả thiết về sự thay đổi độ ổn định cũng như cấu trúc của tiểu phần E1βketoacid tương đồngvới các quan niệm của các nhà nghiên cứu trước đây về biến thể trên exon 10, genBCKDHB. Đến nay, các biến thể thay thế amino acid tại exon 10 của genBCKDBít khiđược phát hiện Trong tổng số 115 biến thể thay thế trên genBCKDHBđượcCSDLClinVarcôngbố,chỉcó18biếnthểxuấthiệntạiexon10(chiếm15,6%)và3/18biến thểđượcCSDLeurofinsxácnhậnlà“gâybệnh”(Bảng4.1).

Bảng4.1.Cácbiến thể thaythếđãđượccôngbốtạiexon10của genBCKDHB

Co cứng chi dưới, bú kém, nônmửa, MRI bất thường, khuyết tậttrítuệkhôngthểphụchồi.

Suy hô hấp, tràn dịch màng phổi,ketonniệu,nồngđộleucine(28 87μmol/L,mol/L,nồngđộisoleucin(56μmol/L,mo l/L).

- Hoạttính BCKD ˂0,1% [166] Đángchúý,cácbiếnthểnàyđềuxuấthiệnởnhữngngườibệnh,khởiphátngaytrong giai đoạn sơ sinh Cụ thể, biến thể c.1076 G>A, p.R359K tại exon 10 của genBCKDHBđã được phát hiện ở 01 bé trai

11 ngày tuổi mắc bệnh MUSD trong mộtgia đình người Trung Quốc, bố mẹ không có quan hệ hôn nhân cận huyết Các triệuchứng lâm sàng bao gồm co cứng chi dưới, bú kém, nôn mửa, nồng độ leucine,valine cao vượt ngưỡng, hình ảnh MRI bất thường [135] Người bệnh được chẩnđoán, điều trị bệnh xirô niệu, đến thời điểm 06 tháng tuổi với các chỉ số phát triểnbìnht hư ờn g và k h ô n g k h u y ế t t ậ t v ề t r í t uệ Đ ặ c bi ệt, c h ị g á i c ủ a n g ư ờ i bệ n h, 1 0tuổi,cũngđãxuấthiện nhữngtriệuchứng tương tựngaytronggiaiđoạns ơsinh.Tuy nhiên, do không được chẩn đoán sớm và điều trị phù hợp, chị gái bị khuyết tậttrí tuệ, không thể phục hồi Tại thời điểm 10 tuổi, trí tuệ của trường hợp này chỉtương đương với trẻ 03 tuổi, với chỉ số phát triển (DQ) ˂40 [135] Nghiên cứu củaImtiaz và cộng sự (2017) ghi nhận biến thể c.1145 T˃C, p.C382S tại exon 10 củagenBCKDHBgây bệnhMUSD thể cổ điểnở 0 1 n g ư ờ i Ả R ậ p S a u d i [ 136] Mộtbiến thể khác tại exon 10, c.1149T>A, Y383X được ghi nhận là nguyên nhân gâybệnh ở 02 người bệnh MUSD thể cổ điển (người Thổ Nhĩ Kỳ), trong đó, 01 ngườibệnhkhôngxácđịnhđượchoạttínhcủaenzymevàgiátrịnàyởngườibệnhcònlại ˂0,1%[137].

Ngoàira,dạngbiếnthểC>TtrêngenBCKDHBdẫnđếnsựthaythếproline (P) bằng leucine (L) được phát hiện ở những người bệnh mắc xirô niệu trước đây.Cụ thể, nhóm nghiên cứu của Gupta (2015) báo cáo biến thể c.554C>T, p.P185L ởmột bé trai sơ sinh được chẩn đoán mắc bệnh xirô niệu thể cổ điển [138]. Ngườibệnh xuất hiện những triệu chứng của bệnh não sơ sinh, hôn mê và mất ở thời điểm10 tháng sau sinh Cơ sở dữ liệu ClinVar xác nhận c.554C>T, p.P185L là một biếnthể “gây bệnh” Biến thể c.995C>T, p.P332L được ghi nhận ở một người bệnh nhi(người Lebanon), mắc bệnh xirô niệu với các triệu chứng điển hình như keton niệu,nhiễm toan acid lactic, nồng độ valine, leucine, isoleucine máu tăng cao [139].Trong 30 người mắc xirô niệu (người Digan ở Bồ Đào Nha), ghi nhận được biến thểc.1067C>T, p.P356L ở người bệnh 13 ngày tuổi cú nồng độ leucine tăng cao (3283àmol/l) [140] Như vậy, triệu chứng lâm sàng xuất hiện các người bệnh R01, R02,R03, R04 trong nghiên cứu này, khá tương đồng với những người mang kiểu biếnthể P˃L Do đó, có thể giả thiết rằng dạng biến thể thay thế P˃L trên genBCKDHBcómốiquanhệchặtchẽtrongcơchếgâybệnhxirôniệu.

Biến thể thứ hai ở người bệnh R01, c.989A>G, p.E330G xuất hiện trên exon9, genBCKDHB, gây ra sự thay đổi glutamate (E) thành glycine (G) tại vị trí 330trên chuỗi polypeptide Glutamate (E) là amino acid tích điện âm bị thay đổi thànhglycine (G) không phân cực, kỵ nước Sự thay đổi này không chỉ ảnh hưởng đếntương tác tĩnh điện cục bộ mà còn ảnh hưởng đến các liên kết hydro trong cấu trúccủa protein Liên kết hydro giữa glutamate 330 (E330) và cystein 188 (C188) trongcấu trúc 3D của phân tử protein bị loại bỏ, có thể dẫn đến rối loạn độ ổn định củatiểu phần E1βketoacid [134] Thêm vào đó, biến thể p.E330G xảy ra tại vị trí gần cuối vòngxoắn alpha (α) và các phiến gấp beta (βketoacid) trong cấu trúc bậc hai của tiểu đơn vị βketoacid củaphức hợp BCKD Đây là vị trí tham gia vào quá trình phân phối lại các amino acidliền kề gần các giao diện của hai tiểu phần βketoacid-βketoacid' khi chưa xuất hiện biến thể [134] Vìvậy, sự thay thế này có thể thay đổi giao diện sắp xếp βketoacid'-βketoacid khiến cho quá trình tươngtác, đóng gói hai tiểu đơn vị này bị cản trở Đây có thể là nguyên nhân làm thay đổicấutrúccũngnhư chứcnăngcủaproteinBCKDHB.

NgườibệnhR02mangbiếnthểthaythế,thểđồnghợptửc.1016C>T,p.S339L,t ạ i e x o n 9 c ủ a g e nB C K D H B.B ố m ẹ , a n h t r a i , c h ị g á i c ủ a n g ư ờ i b ệ n h cũng mang biến thể này, nhưng ở trạng thái dị hợp tử và không biểu hiện các triệuchứng bệnh Đặc biệt, 02 chị gái của người bệnh được chẩn đoán mắc MUSD và đãmất tại thời điểm 27, 23 ngày sau sinh Dựa trên cơ sở di truyền, có thể giả thiết 02chị gái của người bệnh cũng mang biến thể c.1016C>T, p.S339L, dạng đồng hợp tử.Đến nay, các nghiên cứu đều xác nhận mức độ nguy hiểm của biến thể trên gen liênquan đến bệnh MUSD ở nam và nữ là tương đương nhau Vì thế, việc chẩn đoán vàđiềutrịkịp thờicókhảnăngđãmanglạicơhộisốngchongườibệnh.

Biến thể c.1016C>T,p.S339L đã được nhóm nghiên cứu của Gorzelany(2009) phát hiện ở người bệnh xirô niệu 18 ngày tuổi (người Thổ Nhĩ Kỳ) [15] Sauđó, biến thể này được ghi nhận trên nhiều người mắc bệnh MUSD như: bé gái 01tháng tuổi ở Ấn Độ [141] và 01 bé gái 6 ngày tuổi và 01 bé trai 7 ngày tuổi ởMalaysia [142] Biến thể c.1016C>T, p.S339L gây ra sự thay thế serine

339 (S339)thành leucine 339 (L339) Biến thể xảy ra đã nên một liên kết hydro giữa S339 vàG336 bịmất đi.Ngoài ra,S339nằm trên chuỗi xoắnα11, thamgia tạo liênk ế t hydro với S339 của một tiểu đơn vị E1b khác Liên kết này cần thiết cho quá trìnhtrùng hợp giữa hai tiểu đơn vị βketoacid và βketoacid', vì vậy, sự thay thế amino acid phân cực (S)thành không phân cực (L) có thể phá vỡ liên kết hydro, từ đó làm thay đổi giao diệnsắpxếphaitiểuphầnβketoacidvàβketoacid'cũngnhưsự tươngtác giữahai tiểuphần. Đến nay, khoảng 08 biến thể thay thế tại exon 9 của genBCKDHBđược ghinhận ở những người mắc bệnh xirô niệu (Bảng 4.2) Hầu hết, những người mangbiến thể đều khởi phát bệnh ở giai đoạn sơ sinh (6/7 biến thể) Cụ thể, biến thểc.964A>G,p T 3 2 2 A đ ã đ ư ợ c p h á t h i ệ n ở b é t r a i 6 t h á n g m ắ c b ệ n h M U S

D k i ể u trunggianvớicácbiểuhiệnlâmsàngnhưchậm pháttriển,nồngđộleucine,isoleucine,v a l i n e v ư ợ t n g ư ỡ n g [ 138].T u y n h i ê n , b i ế n t h ể c 9 6 4 A > G , p T 3 2 2 A cũng đã được nhóm nghiên cứu của Bashyam (2012) phát hiện ở bé trai mắc MUSDkhởi phát sơ sinh; biến thể c.970C>T p.R324X được phát hiện ở 01 bé gái, 25 ngàytuổi [141] Imtiaz và cộng sự (2017) sàng lọc được 02 biến thể p.G335D, p.G336Sdẫn đến biến đổi glycine (G) thành aspartat (D) và serine (S) tại vị trí 335, 336 (gầnvớivịtríE330)ởhaingườibệnhMUSDthểcổđiểnngườiẢrậpSaudi[136].Cảhaigốc biến thể G335 và G336 đều nằm tại vị trí vòng xoắn (coil) nên sự biến đổi nàyđều làm thay đổi sự ổn định của cấu trúc trong đó biến thể p.G335D khiến cho cácgốcthamgiatạoliênkếthydro(H)hoặctươngtácvanderWaalsvớicácprote in hoặccácgốckhácbịxáotrộn;biếnthểp.G336Slàmthay thếchuỗibên,dẫnđếnsựxungđộtvớicácgốcxungquanh,ngăncảnquátrìnhcuộnxoắncủaprotei n[136].

Chậmpháttriển,n ồ n g độle ucine + isoleucine: 519 àmol/

Suy hô hấp, tràn dịch màngphổi,ketonniệu,nồngđộ leucine(2887μmol/L,mol/L,nồn gđộisoleucin(56μmol/L,mol/L).

Bétrai Đợt tím tái ngắn xuất hiệnxenkẽnhau;Nồngđộleuci ne:2 3 2 3 μmol/L, m o l / L , isoleucine:74,9μmol/L,mol/L.

Co giật, giảm trương lực cơ,MRIbấtthường,nồngđộle ucine:4 , 2 5 5 μmol/L, m o l / L ; isoleucine:421μmol/L,mol/L; valine:623μmol/L,mol/L.

Biến thể p.G336S được nhóm nghiên cứu của Campanholi (2019) [143] pháthiện ở 01 người mắc bệnh MUSD người Chi Lê Ngoài ra, biến thể c.1013C>T,p.T338Iđ ư ợ c p h á t h i ệ n t r o n g n g h i ê n c ứ u n à y ở n g ư ờ i b ệ n h M U

BCKDHBở một bé trai 07 ngày tuổi (người Trung Quốc) với các triệu chứng điểnhình của bệnh MUSD thể cổ điển [143] Biến thể p.Q346R mặc dù không phá vỡliên kết hydro, nhưng dẫn đến sự thay thế glutamine (Q), amino acid có chuỗi bênngắn, bằng arginine (R), có chuỗi bên dài nhưng không mang nguyên tử oxy(O),làm thay đổi đáng kể cấu trúc không gian của Q346-βketoacid với P356-βketoacid′ hoặc I357-βketoacid′ vàgópphầnvàosựtươngtáckhôngổnđịnhgiữahaitiểuphầnβketoacid-βketoacid′[144].Nhưvậy, sựthaythếcácaminoacidtạiexon9củagenBCKDHBcóthểđãlàmthayđổiđộổn định cũng như cấu trúc và chức năng chung của protein BCKDHB và là nguyênnhângâybệnhMUSD.

NgườibệnhR03manghaibiếnthể,thểdịhợptửc.1A>T,p.M1Lvàc.704G>A,p.C2 35YđềutrêngenBCKDHB,biểuhiệncáctriệuchứnglâmsàngcủabệnhMUSD.Bốcủangườib ệnhmangbiếnthể,c.1A>T,p.M1L,thểdịhợptử,trongkhi đó, mẹ và chị gái người bệnh mang biến thể, dị hợp tử, c.704G>A, p.C235Y.Đáng chú ý, cả 03 thành viên này trong gia đình điều không xuất hiện triệu chứngbệnh, hay nói cách khác, đây là những người lành, mang gen bệnh. Như vậy, sự kếthợp của 02 biến thể c.1A>T, p.M1L và c.704G>A, p.C235Y chịu trách nhiệm chokiểuhìnhởngườibệnhR03.

Bệnhrốiloạn chutrìnhchuyển hóaurê(UCD)

Rốiloạnchutrìnhchuyểnhóaurêgâyrasựdưthừaamoniac,mộtchấtđộcđốivới hệ thống thần kinh, dẫn đến các triệu chứng chính của bệnh như nôn mửa, mấtđiều hòa, thờ ơ, lú lẫn, cáu kỉnh, hôn mê… Người bệnh R05, R06 và R07 xuất hiệnnhững triệu chứng trên ngay trong giai đoạn thơ ấu Ngoài ra, kết quả phân tích hóasinh ở 03 người bệnh cho thấy nồng độ amoniac, glutamine và orotic acid tăng cao,thờigianđôngmáubịrốiloạn.Trêncơsởkếtquảlâmsàng,ngườibệnhR05,R06vàR07 được chẩn đoán mắc rối loạn chu trình chuyển hóa urê nhưng chưa được phânloạinhómbệnh.

KếtquảgiảitrìnhtựWESvàSangerđãpháthiệnđược03biếnthểIVS7+1G>A, c.365A>T, p.E122V; c.1065A>G, p.*355Wext*14 trên genOTClầnlượtởngườibệnhR05,R06vàR07.Thêmvàođó,03trườnghợpđềuxuấthiệnởcácbé gáivớicáctriệuchứnglâmsàngkhởipháttronggianđoạntừ12-24thángtuổi,vìvậy, theo Hediger và cộng sự (2018) [157], những người bệnh này được chẩn đoánmắcbệnhthiếuOTCkhởiphátmuộn.Đâylàrốiloạnphổbiếnnhấttrongcácrốiloạnchu trình chuyển hóa urê [158] Ngoài ra, kết quả phân tích lâm sàng ở người bệnhR05 và R06 cho thấy, ngoài những biểu hiện điển hình của bệnh OTC, người bệnhcònxuấthiệncáctriệuchứngtổnthươngnão(phùnãovàchuỗixungT1Wnãobất thường).C á c t r i ệ u c h ứ n g b ấ t t h ư ờ n g v ề n ã o t h ư ờ n g đ ư ợ c q u a n s á t t h ấ y ởn h ữ n g ngườimắcbệnhthiếu OTC khởiphátmuộnvàcókiểuhìnhnghiêmtrọng[159].

Kếtquảnghiêncứuchothấy,ngườibệnhR05vàR06ditruyềnbiếnthểdịhợpt ửtừmẹ,biểuhiệnrakiểuhình,trongkhingườimẹkhôngbiểuhiệnbấtkỳtriệuchứng nào Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là do sự bất hoạt ngẫu nhiên củanhiễm sắcthể X [161].NgườibệnhR05vàR06mangbiếnthể,thểdịhợptửvới01allenbiếnthểvà01allenbì nhthường.TrongquátrìnhbấthoạtnhiễmsắcthểXởgiaiđoạnpháttriểnsớmcủabàoth ai,cóthểnhiễmsắcthểXmangallenOTCbìnhthườngđãbịbấthoạtvàNSTXcònlạima ngallenbiếnthể.Nếutrườnghợpnàyxảyra,hoạttínhcủaenzymeOTCởgansẽsu ygiảmdocảhainhiễmsắcthểXởngườibệnhđềusaihỏng.Triệuchứngtổnthươngga nđượcquansátthấyởcảhaingười bệnh R05, R06 với mức ALT tương ứng là 69 UI/L và 119 UI/L (bình thường7- 59UI/L)làcơsởcủngcốchogiảthiếtnày.SựtươngquangiữacácbiếnthểtrêngenOTCvà cácmứcđộtổnthươngganđãđượcquansátthấyởnhữngngườimắcbệnhOTCDtrong nghiêncứucủaCaldovicvàcộngsự(2015) [162].TrườnghợpngượclạixảyraởngườimẹnênhoạttínhcủaenzymeOTCkhông bịảnhhưởng.Vìvậy,mẹ củangườibệnhR05,R06mặcdùmangbiếnthể,thểdịhợ ptửnhưngkhôngbiểuhiệnkiểuhình.Tuynhiên,nguycơmắcOTCDở02trườnghợpnàyr ấtcao,cầnđượctheodõiđịnhkỳđểcóphươngánxửlýthíchhợp.NhómnghiêncứucủaT o r k z a b a n ( 2 0 1 9 ) đ ã b á o c á o r ằ n g n ế u n g ư ờ i b ệ n h O T C D đ ư ợ c c h ẩ n đ o á n trướckhimangthaithìtỷlệmắcbệnhvàtửvongcủangườimẹvàtrẻsaukhisinhsẽg i ả m xuống so v ới k h i chẩ nđ oán t r o n g t hờ i k ỳ mangt h a i [ 163].C ụt h ể , 3 1 % (5/16)ng ườimẹkhôngđượcsànglọctrướckhimangthaiđãmấttrongkhitrườnghợp này không xuất hiện ở nhóm được chẩn đoán OTCD trước khi mang thai [163].Kếtquảnghiêncứucủaluậnánphùhợpv ớ i k ế t q u ả n g h i ê n c ứ u L i c h t e r

- Koneckivàcộngsự(2013) [160],đólàkhoảng80%ngườibệnhnữmangbiếnthể,dịhợptửnhưngkhôngbiểuhiệnbấtkỳtriệuch ứngnàocủabệnh,20%cònlạixuấthiệncáctriệuchứnglâmsàngởgiaiđoạnkhởiphátmuộnkh igặpcácyếutốstress(chếđộănnhiềuprotein, mắcbệnhcấptính,chấnthương,m angthai,sinhnở hoặcsử dụngcorticosteroid).

Ngườib ệ n h R 0 5 m a n g b i ế n t h ể v ị t r í g h é p n ố i I V S 7 + 1 G > A x u ấ t h i ệ n t ạ i nucleotideđầutiêncủaintron7trêngenOTC.Cácbiếnthểtạivịtríghépnốicóthể làmthayđổihoặcloạibỏmốinốitạivịtríghépnối.Loạibiếnthểnàychiếmkhoảng15% tổng số các biến thể gây bệnh vàkhoảng 8,6% tổng số các biến thể gây bệnhthiếu OTC [164] Biến thể IVS7+1G>A làm thay đổi 2 nucleotide GT tại vị trí ghépnối có thể gây ra sự “loại bỏ” exon, mất một phần exon, giữ lại intron, kích hoạt mộtvịtríghépnốikhácởvùnglâncậntrongđósự“loạibỏ”exonxuấthiệnphổbiếnnhất[165] Biến thể xảy ra làm kích thước của exon 7 và intron 7 bị ngắn đi 54 và 80nucleotide và quá trình “loại bỏ” exon 7 có thể xảy ra Điều này khiến cho chuỗimRNAbịcắtngắnvàquátrìnhdịchmãtạoproteinbịảnhhưởng.BiếnthểIVS7+1G>A cũng đã được phát hiện ở bé trai mắc bệnh thiếu OTC (OTCD) khởiphátngaygiaiđoạnsơsinh[166].

Người bệnh R05 là trường hợp thứ hai phát hiện được biến thể này Ngoại trừbiến thể IVS2+1G>A gây ra sự khởi phát muộn ở bé trai 05 tháng tuổi [167], cácbiếnthểcódạng+1G>AthườngxuấthiệnởcácbétraimắcOTCDkhởiphátsơsinhhoặc các bé gái khởi phát muộn trong đó loại khởi phát sơ sinh xuất hiện phổ biếnhơn Xu hướng khởi phát sơ sinh ở các bé trai và khởi phát muộn ở các bé gái mắcOTCD thể hiện rõ ngay trong gia đình người bệnh R05, biểu hiện 03 kiểu hình khácnhau ở ba thế hệ: không xuất hiện triệu chứng (ở người mẹ), nữ giới chết ngay khixuất hiện triệu chứng đầu tiên (bà ngoại và dì) và nam giới chết ngay tuần đầu tiênsausinh(bác,anhhọvàcácanhtrai).Cáckếtquảphântíchphảhệvàditruyềnlàcơ sở để đưa ra kết luận các trường hợp đã mất trong gia đình có thể là do bệnhOTCD.

Ngoài ra, kiểu biến thể thay thế tại nucleotide số 1 trên intron cũng đã đượcbáo cáo ở một bé trai mắc OTCD, khởi phát sơ sinh [168] Người bệnh mang biếnthể IVS8+1G>C trên genOTC, được di truyền từ mẹ Đặc biệt, tiền sử gia đình ghinhận bà ngoại của người bệnh đã sinh được 03 bé trai và 02 bé gái, trong đó 02 bétrai mất sau sinh Sau khi phát hiện được biến thể, người mẹ (đang trong giai đoạnthaikỳtuầnthứ16)đượctiếnhànhphântíchditruyềnnướcối.Kếtquảchothấythainhi là nam và mang biến thể tương tự người mẹ, do đó đã thực hiện đình chỉ thai kỳ[168] Như vậy, trong trường hợp này, phân tích di truyền đã tránh được việc xuấthiệnthêmmộtngườibệnhmắc bệnhditruyềnhiếmgặp.

Người bệnh R06 mang biến thể thay thế (c.365A>T; p.E122V) dẫn đến sựthayt h ế g l u t a m a t e ( E ) t h à n h v a l i n e ( V ) t ạ i v ị t r í 1 2 2 t r ê n c h u ỗ i p o l y p e p t i d e c ủ a protein OTC Người bệnh biểu hiện những triệu chứng điển hình của bệnh rối loạnchu trình chuyển hóa urê Sự biến đổi một amino acid ưa nước (E), tích điện âmthànhaminoacidkỵnước(V)trongchuỗipolypeptide,khiếnchocácaminoacidtậphợp lại với nhau và làm thay đổi cấu trúc của protein Theo báo cáo của Shi và cộngsự(2000) [169],vịtrícủaE122nằmtạivòngliênkếtgiữaphiếngấpβketoacid3vàvòngxoắnα3 Vị trí này duy trì sự ổn định của trung gian cacbon tứ diện thông qua liên kết vớigốc arginine 92 (R92) Do đó, biến thể p.E122V có thể thay đổi hình dạng của vònglặp từ đó phá vỡ cấu trúc protein OTC, làm suy giảm hoạt tính của enzyme và lànguyênnhângâybệnhthiếuOTCởngườibệnhR06.

Khai thác tiền sử gia đình cho thấy anh trai mất do hôn mê và khó thở ngaysaukhisinh.Dođó,cóthểanhtraimangbiếnthểp.E122VvàmắcbệnhMUSDkhởiphát sơ sinh. Kết quả này phù hợp với báo cáo của Arranz và cộng sự (2007) [170]xác nhận biến thể tại vị trí E122 làm mất liên kết ion giữa các tiểu phần, thay đổi độổn định, dẫn đến suy giảm một phần hoạt tính enzyme OTC và được xác định lànguyên nhân gây bệnh OTCD khởi phát muộn ở 01 bé trai 13 tháng tuổi (người

TâyBanNha).Vìvậy,sựxuấthiệncủabiếnthểtạivịtríE122gâybệnhthiếuOTC,khởiphát sơ sinh ở anh trai người bệnh trong nghiên cứu này có thể là căn cứ để chứngminhchomứcđộnghiêmtrọngcủabiếnthể.Đặcbiệt,tạivịtrígầnvớiE122,02biếnthểthaythế p.T125M[171]vàp.D126G[172]đượcpháthiện ở02bétrai,khởiphátsơ sinh với hoạt tính enzyme ˂ 1,0% Như vậy, vị trí xuất hiện của biến thể có thể làmộttrongnhữngyếutốquantrọngtácđộngđếnsựthayđổivềcấutrúcvàđộổnđịnhcủaprotein,từđ óquyếtđịnhđếnmứcđộnghiêmtrọngcủabiếnthể.

Xét về kiểu biến thể c.A>T, p.E˃V trên genOTCở người bệnh R06 đượcYamaguchi và cộng sự (2006) [174] phát hiện ở người bệnh mắc bệnh thiếu OTC.Cụ thể, biến thể làm biến đổi A>T tại vị trí 716 trên chuỗi polynucleotide, dẫn đếnsự thay thế E˃V tại vị trí 239 trên chuỗi polypeptide Biến thể này đã được CSDLClinVarcôngbốlà“gâybệnh”vớimãsốrs67283833. Đến nay, 16 biến thể thay thế tại exon 4 của genOTCđã được ghi nhận ởngười mắc bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (Bảng 4.4) Các biến thể này đềulàm giảm hoạt tính của enzyme OTC, trong đó 14/16 biến thể (chiếm 87,5%) khởiphát muộn ở cả bé trai và bé gái, 03 biến thể còn lại xuất hiện ở các bé trai ngay giaiđoạnsơsinh.

Bétrai Orotic acid niệu;Enzymegiảmhoạttí nh.

Nôn trớ, bú kém vàhônmê Nồng độamoniac:259μmol/L,g/dL,ALT:69UI/L,AST:5 3UI/L, glutamine:579μmol/L,mol/L.Rốiloạn thờigianđôngmáu(33%).

Cáctriệuchứngtâmthần,rốiloạnhànhvi, tăngamoniacmáunhẹ,tăngglutaminemáuliê ntục,oroticacidniệu.

Người bệnh R07 mang biến thể c.1065A>G tại exon 10 của genOTC, dẫnđến việc thay thế bộ ba kết thúc bằng amino acid tryptophan (p.*355Wext*14),khiến cho quá trình dịch mã không thể dừng lại mà tiếp tục kéo dài đến vị trí bộ bakếtthúctiếptheo.Kếtquảlàtạoramộtkhungđọcmởmớigồm369aminoacidso với 355 amino acid ở khung đọccũ, củaprotein OTC không mang biến thể.B i ế n thể này đã được pháthiện ở một bé trai 02 tuổi mắc bệnh thiếuO T C k h ở i p h á t muộn[183].

Trong gia đình, người bệnh là thành viên duy nhất, mang biến thể và biểuhiện các triệu chứng lâm sàng Như vậy, biến thể c.1065A>G là biến thể mới phátsinh (de novo) Theo Veltman & Brunne (2012) [184], các biến thểde novođại diệncho dạng biến thể hiếm gặp nhất và có mức gây hại cao hơn so với các biến thể ditruyền do phải chịu sự chọn lọc tiến hóa ít nghiêm ngặt hơn Chính vì vậy, các biếnthểdenovotrởthànhnguyênnhânchínhgâybệnhditruyền,trongtrườnghợpnà ylàbệnhrốiloạnchutrìnhchuyểnhóaurêởngườibệnhR07.

Sự xuất hiện của kiểu biến thểde novoở người bệnh R07 trong nghiên cứucủa đề tài luận án phù hợp với nghiên cứu Tuchman và cộng sự (2002) [185] xácđịnh tần số biến thểde novocao ở người bệnh nữ mắc bệnh thiếu OTC Biến thểdenovolà những biến thể ở các tế bào dòng mầm và phát sinh ở thế hệ tiếp theo, đượcgiải thích bằng nhiều giả thiết khác nhau Sự xuất hiện biến thểde novoở nam giớicó thể được giải thích bằng 02 cách: (1) Biến thể hình thành trong quá trình phátsinh giao tử ở người mẹ; (2) Biến thể thể khảm (mosaic mutation) xuất hiện trong tếbào mầm của người mẹ [186] Trong khi đó, các quan niệm giải thích cho sự xuấthiện biến thểde novoở người bệnh nữ chưa thực sự rõ ràng Đại đa số các nhànghiêncứuchấpnhậnbiếnthểđượcphátsinhtừcáctếbàomầmcủangườibốdos ố lượng các bản sao DNA trong quá trình sinh tinh (spermatogenesis) nhiều hơn sovớiquátrìnhsinhnoãn(oogenesis)

[187].Mộtsốýkiếnchorằng,tuổicủangườibố lày ế u t ố q u a n t r ọ n g q u y ế t đ ị n h đ ế n s ố l ư ợ n g b i ế n t h ể de novocao ở nữ, trongkhiđộtuổi củangườimẹcó tácđộngkhông đángkểđốivớihiệntượngnày[188].

Bêncạnhnhữngtriệuchứngđiểnhìnhcủabệnhrốiloạnchutrìnhchuyểnhóaurê, người bệnh R07 còn xuất hiện thêm triệu chứng liệt nửa người bên phải, là triệuchứng điển hình của đột quỵ Thông qua việc sàng lọc các biến thể gây bệnh trên 13gen liên quan đến bệnh đột quỵ (ADA2, ATP1A2, ATP1A3, CACNA1A,

COL4A1,COL4A2,GLA,NOTCH3,OTC,POLG,SCN1A,SCN5AvàSLC2A1

(https://www.fulgentgenetics.com/hemiplegia- stroke),chỉpháthiệnđượcmộtbiếnthểdịhợptửcótiềmnănggâybệnhc.1065A>GtrêngenOTC.Kếtquảnàycủngcốthêmgiảthiết“cáckhiếmkhuyếttrongchutrìnhchuyểnhóaurênênđư ợccoilànguyên nhânđộtquỵtrongchẩnđoánphânbiệtliệtnửangườicấptínhởtrẻem”[189].

Do OTCD là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X nên trongtrường hợp người bố mang biến thể, tỷ lệ con trai mang gen bệnh là 0%, trong khi100% con gái sẽ mang biến thể có thể tiến triển thành các triệu chứng lâm sàng liênquan đến bệnh Nếu người mẹ mang biến thể thể dị hợp tử, đối với mỗi lần mangthai, khả năng truyền gen bệnh cho người con là 50% Các con trai mang allen biếnthểsẽb i ể u h iệ nk i ể u h ì n h trong k hi cácc o n gá im an gge nb ện hcó thểb i ể u h i ệ n hoặc không biểu hiện các triệu chứng liên quan đến bệnh Vì vậy, việc thực hiện cácxét nghiệm di truyền để xác định khả năng mang gen bệnh ở người mẹ có nguy cơmang biến thể thể dị hợp tử trong gia đình xuất hiện người mắc bệnh OTCD là thựcsự cần thiết Ngoài ra, xét nghiệm di truyền còn cung cấp câu trả lời về tiền sử giađình của người bệnh và sẽ có những khuyến cáo hữu ích cho bố mẹ đối với nhữnglần mang thai tiếp theo Đặc biệt, bất kỳ người con nào của người mang gen bệnhcần phải thực hiện xét nghiệm di truyền để xác định trạng thái của các allen OTC,nhằm tư vấn di truyền cũng như có những can thiệp y tế kịp thời Trên cơ sở đó,người bệnh sẽ được xử lý phù hợp, chẳng hạn như điều trị bằng các loại thuốc làmgiảm nồng độ amoniac trong máu (natri benzoat, arginine, hoặc citrulline, sử dụngchế độ ăn hạn chế aprotein hoặc lên kế hoạch cho việc thực hiện ghép gan trongtrường hợp nghiêm trọng) Qua đó cho thấy, các xét nghiệm di truyền, đặc biệt làgiải trình tựgen thế hệ mới, làm ộ t t r o n g n h ữ n g p h ư ơ n g p h á p h ữ u h i ệ u đ ư ợ c s ử dụngtrongnghiên cứulâmsàngvềbệnhrốiloạnchutrìnhchuyển hóaurê.

Bệnhloạndưỡngcơ

Loạn dưỡng cơ là một nhóm các rối loạn thoái hóa di truyền về cơ, với cácđặc điểm lâm sàng chung như yếu cơ tiến triển và biểu hiện bệnh lý loạn dưỡng cơ.Các bệnh loạn dưỡng cơ có thể được phân loại dựa vào tuổi khởi phát, các cơ bị tácđộng và tốc độ tiến triển của bệnh Một số dạng bệnh loạn dưỡng cơ biểu hiện cáctriệu chứng lâm sàng ngay ở giai đoạn thơ ấu, sau đó tiến triển nhanh chóng và gâytử vong cho người bệnh ở giai đoạn khoảng 20 tuổi Một số dạng bệnh khác có khởiphát muộn hơn, ở giai đoạn trưởng thành với tốc độ tiến triển bệnh chậm và thờigian sống của người bệnh gần như bình thường Bên cạnh đó, một số bệnh loạndưỡngcơthườngđikèmvớibệnhtimvàthiểunăngtrítuệ.Điềunàychothấyc óthể có một cơ chế sinh bệnh loạn dưỡng cơ khác Đặc biệt, một số dạng bệnh loạndưỡng cơ và các khuyết tật di truyền có các biểu hiện lâm sàng tương tự nhau Tínhđến thời điểm hiện tại, chưa có một phương thức điều trị nào cho người mắc bệnhloạn dưỡng cơ Chính vì vậy, bệnh cần được chẩn đoán sớm và chính xác để manglạihyvọngsốngcũngnhư nângcaochấtlượngcuộcsốngchongườibệnh.

Người bệnh R08 và R09 là trường hợp thú vị trong nghiên cứu bệnh di truyềnhiếm gặp nói chung và bệnh loạn dưỡng cơ nói riêng do vừa có thể là 01 phả hệtrong một gia đình vừa có thể là 02 người bệnh riêng biệt Nếu xét về hướng nghiêncứu phân tích phả hệ, so sánh hệ gen, phát hiện biến thể trong một gia đình thì nếumột trường hợp là người bệnh, trường hợp còn lại là thành viên trong gia đình Tuynhiên, trong quá trình thu thập mẫu, hai người bệnh này là hai cá thể độc lập đếnđiều trị và có phác đồ điều trị ở hai thời điểm khác nhau tại Bệnh viện Nhi Trungương, nên cũng có thểxem xét là02 ngườibệnh Trong nghiênc ứ u c ủ a l u ậ n á n , R08 và R09 được xác định là 2 người bệnh độc lập Nhận định này tương đồng vớimột số nghiên cứu phát hiện đột biến xuất hiện trên các gen liên quan đến bệnh loạndưỡng cơở02 anh/chịemtrongcùngmộtgiađình,như:Sirisenavàcộng sự(2021)

[190] phát hiện được 01 biến thể mới trên genCOL6A1gây bệnh loạn dưỡng cơbẩm sinh Ullrich ở 02 anh em ruột trong một gia đình người Sri Lanka có quan hệhôn nhân cận huyết Hai trường hợp này đã được nhóm nghiên cứu xác định là 02ngườibệnhriêngbiệt;M.Aminvàcộngsự(2018)

[191]pháthiệnđượcđộtbiến p.R148W trên genLAMA 2ở hai anh em ruột trong một gia đình người Sudan vàxácđịnhlà02ngườibệnh.

Kết quả kiểm tra lâm sàng cho thấy hai người bệnh R08 và R09 có các triệuchứng của bệnh loạn dưỡng cơ như teo cơ, bệnh cơ xương mặt, corút vùng ngóntay, tư thế đứng rộng, chậm vận động, đi bằng đầu ngón chân, tăng creatine kinasevà bất thường chất trắng trong não Tuy nhiên, do sự chồng chéo về kiểu hình củacác nhóm bệnh loạn dưỡng cơ, kết quả lâm sàng và sinh hóa chưa đủ dữ liệu để đưara chẩn đoán bệnh một cách chính xác Để loại trừ khả năng mắc các kiểu bệnh cơkhác, hai người bệnh (R08 và R09) được xét nghiệm genDMD, SMNvàGAA, kếtquảkhôngxácđịnhđược bấtkỳbiếnthểnào.

Bằng phương pháp giải trình tự WES và kiểm chứng lại bằng Sanger 02 biếnthể, trạng thái đồng hợp tử trên genLAMA2,c.778C>T, p.H260Y và c.2987G>A,p.C996Yđãđượcphát hiệnởcả02ngườibệnhR08vàR09.

GenLAMA2mã hóa cho tiểu đơn vị laminin α-2, là một phần của proteinlaminin-211 (cấu thành từ tiểu đơn vị α-2, βketoacid-1 và γ-1) liên kết với protein laminin-221 (tạo thành từ tiểu đơn vị α-2, βketoacid-2 và γ-1) hoặc với các protein khác như laminin,nidogen và argin khác trong chất nền ngoại bào và trong màng tế bào cơ để duy trìsự ổn định của sợi cơ. Laminin-211 và laminin-221 trong cơ xương có hai thụ thểchính là α-dystroglycan và α7βketoacid1 intergrin Các biến thể trên genLAMA2có thểkhiến cho tiểu đơn vị laminin α-2 không được biểu hiện hoặc được biểu hiện nhưngsuy giảm chức năng, dẫn đến thiếu laminin-211 và laminin-221, do đó làm giảm sứcmạnhvàsựổnđịnhcủamôcơxương.CácbiếnthểxảyratrêngenLAMA2được ghi nhận là nguyên nhân gây bệnh loạn dưỡng cơ liên quan đếnLAMA2khởi phátsớm (còn gọi là loạn dưỡng cơ bẩm sinh thiếu merosin kiểu 1A - MDC1A) hoặcbệnh loạn dưỡng cơ liên quan đếnLAMA2khởi phát muộn [106] Đây là một bệnhhiếm gặp, di truyền gen lặn trên NST thường Đến tháng 9/2021, CSDL biến thể mởLeiden (LPVD) đã cập nhật 701 biến thể trên genLAMA2, trong đó 375 biến thểđược xác nhận là gây bệnh (chiếm 53,5%) Các biến thể này chiếm 30% người bệnhloạn dưỡng cơ bẩm sinh ở châu Âu [99], 28% ở Đan Mạch

[102], 36,4% ở TrungQuốc [96] và 48,5% ở vùng Vịnh và Trung Đông [103] Ở Việt Nam, tỷ lệ này chưađượcthốngkêchínhthức.

NgườibệnhR08vàR09xuấthiện02biếnthể,trạngtháiđồnghợptửtrên genLAMA2,c.778C>T, p.H260Y và c.2987G>A, p.C996Y Trong khi bố mẹ củahai người bệnh mang 02 biến thể này nhưng ở trạng thái dị hợp tử và không biểuhiện bất kỳ triệu chứng nào của bệnh Quy luật xuất hiện kiểu hình ở 02 trường hợpnày có sự sai khác so với 02 người mắc bệnh xirô niệu R01 và R03 (bệnh di truyềngen lặn trên NST thường) mang 2 biến thể, dị hợp tử phức đơn trên genBCKDHBnhưng xuất hiện triệu chứng của bệnh Kết quả nghiên cứu của luận án phù hợp vớinghiên cứu của A Khorrami và cộng sự (2021) [192] ở một bé trai 35 tháng tuổixuấth i ệ n t r i ệ u c h ứ n g l o ạ n d ư ỡ n g c ơ ( t r o n g m ộ t g i a đ ì n h n g ư ờ i I r a n ) c ó b ố m ẹ không biểu hiện bệnh Theo phân tích của nhóm nghiên cứu A Khorrami khi thựchiện giải trình tự WES và kiểm chứng bằng Sanger xác nhận người bệnh mang 02biếnthể,trạngtháiđồnghợptửtrêngenLAMA2(c.7681G>A,p.G2561Svàc.4840A>G, p.N1614D) trong khi bố mẹ cũng mang hai biến thể này nhưng ở trạngtháidịhợp.

Hiện tượng không biểu hiện triệu chứng bệnh ở bố mẹ người bệnh R08 vàR09 có thể là do một phần protein laminin-2 vẫn hoạt động bình thường Giả thiếtnày tương đồng với nghiên cứu thống kê của Oliveira và cộng sự (2018) [196] về sựkhác biệt giữa kiểu gen và kiểu hình ở những người thiếu hoàn toàn và những ngườibị thiếu một phần laminin-α2 Nghiên cứu của Oliveira và cộng sự xác nhận, sựthiếu hụt một phần laminin-α2 thường liên quan đến các biến thể thay thế, trượt genhoặcmấtyếutốkhởiđầu,phùhợpvới kiểuhìnhởbốmẹngườibệnh R08vàR09.

Bằng việc sử dụng phương pháp WES đã hỗ trợ để chẩn đoán 02 người bệnhR08 và R09 mắc bệnh loạn dưỡng cơ liên quan đếnLAMA2 Hơn thế nữa,

WES cònđược thực hiện ở cả gia đình người bệnh, giúp tiết kiệm thời gian, công sức cho việclựa chọn và xác nhận các biến thể gây bệnh có thể xảy ra Cụ thể, hai anh em ngườibệnh mang các biến thể được dự đoán gây bệnh ở trạng thái dị hợp tử ở gen lặn củaNST thường như genTTNhoặc trạng thái dị hợp tử ở các gen trội của NST thườngnhưBAG3,CACNA1G,DMPK,FAT2,KCNA5,NEFH,ORAI1vàSYNE1, trongkhi bố mẹ cũng mang gen bệnh nhưng không biểu hiện triệu chứng (Phụ lục 8) Do đó,nhữngbiếnthểnàyđãbịloạitrừ trongquátrìnhsànglọcbiếnthể.

Người bệnh R08 và R09 vẫn có khả năng đi lại độc lập cho thấy đây là bệnhloạnd ư ỡ n g c ơ l i ê n q u a n đ ế nL A M A 2 k h ở ip h á t m u ộ n N g o à i r a , h a i n g ư ờ i b ệ n h cũngbiểuhiệncáctriệuchứngđiểnhìnhkháccủachứngloạndưỡngcơli ênquan đếnLAMA2giai đoạnmuộn nhưyếu cơ vùng gốc chi (dấu hiệuG o w e r s d ư ơ n g tính), chậm phát triển vận động, nồng độ creatine kinase tăng, chất trắng bất thường,chức năng hô hấp, hệ tiêu hóa bình thường, không xuất hiện triệu chứng liên quanđến tim Đáng chú ý, hai người bệnh này đều có biểu hiện đi bằng các đầu ngónchân Nelson và cộng sự

(2015) [194] quan sát thấy các triệu chứng trên ởm ộ t người bệnh nhi nam 10 tuổi (người Thổ Nhĩ Kỳ), ban đầu được chẩn đoán mắc bệnhcơBe th le mh oặc l o ạ n d ư ỡ n g c ơ E m e r y -

D r e i f u s s C ác ge nl i ê n q uan đế n 0 2 b ệ n h này được sàng lọc, nhưng không phát hiện được bất kỳ biến thể nào Tuy nhiên, khigiải trình tự 46 gen liên quan đến bệnh cơ tim đã phát hiện được 01 biến thể vônghĩac.4936G>T(p.E1646X)trêngenLAMA2.Trongnghiêncứucủađềtà iluậnán, thông qua sử dụng WES, 02 biến thể thay thế trên genLAMA2được phát hiện ởngười bệnh R08 và R09 Như vậy, những người bệnh mang biến thể trên genLAMA2cóthểcótriệuchứngđibằngđầungónchân.Tuynhiên,ngườibệnhR 08có biểu hiện lâm sàng nặng hơn (yếu dần cơ và không thể đi lại từ năm 09 tuổi) sovớingườibệnh ởnghiêncứucủaNelsonvàcộngsự (2015).

Biến thể c.778C>T gây ra sự thay thế tyrosine (Y) cho histidine (H) ở vị trí260 tại vùng đầu N của protein laminin Biến thể p.H260Y có thể làm thay đổi độlớn và độ phân cực của một số amino acid gần đó, ảnh hưởng đến cấu trúc cục bộ vàsự cuộn xoắn của protein Vùng đầu N của protein laminin của chuỗi laminin-α2 giữvai trò quan trọng trong quá trình trùng hợp laminin-211 Do đó, sự thay thế H choY có thể ảnh hưởng và làm thay đổi quá trình trùng hợp. Cho đến nay,m ớ i c h ỉ c ó 03 biến thể thay thế gây bệnh hoặc có khả năng gây bệnh tại exon 5 của genLAMA2được công bố trên cơ sở dữ liệu biến thể mở Leiden, gồm c.713C>A

(p.A238D),c.728T>C(p.L243P)vàc.812C>T(p.T271I).Mặcdù,biếnt h ể c 7 7 8 C > T ( p.H260Y) đã được công bố (rs780568352), nhưng là một biến thể rất hiếm đượcquan sát thấy ở trạng thái dị hợp tử với tần số allen 4/250.644 exome trong cơ sở dữliệu tổng hợp genome (gnomAD) và 3/120.950 exome trong cơ sở dữ liệu tổng hợpexome (ExAC) Đây có thể là những người mang biến thể nhưng không biểu hiệntriệuchứng.

Biến thể c.2987G>A, p.C996Y dẫn đến sự thay thế codon TGT của cysteinethànhcodonTATmãhóachotyrosineởvịtrí996trênlamininEGF- likedomain

10 Biếnthểp.C996Ygâyảnhhưởngđángkểđếnđộlớnvàtínhkỵnước,cóthể làm thay đổi cấu trúc cục bộ của protein, sự cuộn xoắn của các chuỗi bên và độ ổnđịnh của protein Đặc biệt, biến thể này cũng làm phá vỡ các liên kết disulfide giữaC987 và C996, dẫn đến sự cuộn xoắn bất thường của domain hoặc liên kết disulfidebất thường với các domain khác Kết quả nghiên cứu của luận án phù hợp với kếtquả của Nissinen và cộng sự (1996) [195] đã phát hiện 01 biến thể tại vị trí C996khác là nguyên nhân của sự thay thế cysteine thành arginine ở một người bệnh (ThổNhĩ Kỳ) có biểu hiện thiếu hụtmột phần laminin α-2 khi phân tích hóamôm i ễ n dịchcủamẫusinhthiếtcơ.

Một số nghiên cứu cũng đã phát hiện các biến thể thay thế dạng đồng hợp tửtrên genLAMA2là nguyên nhân gây bệnh loạn dưỡng cơ ở một số người bệnh như:Hai biến thể, thể đồng hợp tử c.850G>A, p.G284R và c.454T>G, p T152G trên genLAMA2được phát hiện ở 02 người bệnh nữ đã được chẩn đoán mắc loạn dưỡng cơvùnggốcchi(LMGD)

[193].Mộtđiểmthúvịlàngườibệnhmangbiếnthểc.850G>A,p G 2 8 4 R k h ở i p h á t b ệ n h n g a y t r o n g n h ữ n g n ă m đ ầ u đ ờ i ( 1 4 t h á n g ) trong khi người bệnhmang biến thể c.454T>G, p.T152Gl ạ i b i ể u h i ệ n k i ể u h ì n h (khó khăn khi leo cầu thang) khi tuổi tương đối cao (59 tuổi) [196] Xiong và cộngsự( 2 0 1 5 ) [ 197]đ ã t h ự c h i ệ n n g h i ê n c ứ u t r ê n 4 3 n g ư ờ i b ệ n h l o ạ n d ư ỡ n g c ơ s i n h sống ở Trung Quốc và phát hiện được 01 biến thể thay thế, ở trạng thái đồng hợp tử,c.2462C>T (p.T821M) đã được phát hiện ở 02 bé trai là anh em ruột trong một giađình (gốc Ả Rập), có bố mẹ cùng huyết thống Hai biến thể dạng thể đồng hợp tửc.2882G>A(p.A961T)vàc.4406G>A(p.C1469Y)đượcpháthiệnở01n g ư ờ i Trung Quốc có các biểu hiện như co giật, các cơ vùng gốc chi yếu nhẹ, suy giảmnhận thức, tình trạng bệnh não nặng