0032 ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong kiểm soát chất lượng dược liệu ngô thù du (fructus evodiae) lưu hành trên thị trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ XUÂN ĐÀO ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG KIỂM SỐT CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU NGƠ THÙ DU (FRUCTUS EVODIAE) LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC CẦN THƠ – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ XUÂN ĐÀO ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG KIỂM SỐT CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU NGƠ THÙ DU (FRUCTUS EVODIAE) LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN CẦN THƠ – 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Ts Nguyễn Thị Ngọc Vân, liên môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, trường Đại học Y Dược Cần Thơ, người giúp đỡ, hướng dẫn tận tình chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức vô giá cho em Em xin cảm ơn q thầy liên mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, thầy Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, thầy Ths Lữ Thiện Phúc, cô Ds Nguyễn Thị Tường Vi, cô Trần Thị Thanh Thúy tạo điều kiện cho em hoàn thành nghiên cứu Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô môn Dược liệu đặc biệt cô Ths Nguyễn Ngọc Quỳnh tạo điều kiện giúp em thực đề tài Xin chân thành cảm ơn đến anh chị khóa 35 đặc biệt chị Nguyễn Dư Quỳnh Như chia sẻ kinh nghiệm bạn làm mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất quan tâm giúp đỡ Cảm ơn ba mẹ gia đình bên con, động viên tinh thần để an tâm làm đề tài LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết luận văn trung thực, hồn tồn riêng tơi chưa công bố nghiên cứu Cần Thơ, ngày 11 tháng 06 năm 2015 Nguyễn Thị Xuân Đào i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN Trang MỤC LỤC…………………………………………………………………….i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ SƠ ĐỒ v ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật học Ngô thù du 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Họ Rutaceae 1.1.3 Chi Evodia 1.1.4 Loài Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth et Hook, họ Cam (Rutaceae) 1.1.5 Đặc điểm vi phẫu Ngô thù du (Fructus Evodiae) 1.2 Tồng quan thành phần hóa học Ngơ thù du 1.2.1 Tinh dầu 1.2.2 Limonoid 1.2.3 Alkaloid 1.3 Tổng quan tác dụng dược lý công dụng 11 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 12 1.4.1 Ứng dụng HPLC định tính dược liệu 12 1.4.2 Ứng dụng HPLC định lượng dược liệu 13 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Dung môi – hóa chất 15 2.3 Trang thiết bị 15 2.4 Phương pháp thu mẫu 17 2.5 Phương pháp nghiên cứu 17 2.5.1 Đánh giá tiêu kiểm nghiệm Ngô thù du theo DĐVN IV 17 2.5.2 Xây dựng tiêu định tính, định lượng mẫu dược liệu phương pháp HPLC thẩm định 19 ii Chương 3: KẾT QUẢ 25 3.1 Đánh giá tiêu kiểm nghiệm Ngô thù du theo DĐVN IV 25 3.1.1 Đặc điểm cảm quan 25 3.1.2 Đặc điểm hiển vi 27 3.1.3 Độ ẩm 29 3.1.4 Tạp chất 31 3.1.5 Định tính 32 3.2 Xây dựng tiêu định tính, định lượng mẫu dược liệu phương pháp HPLC thẩm định 34 3.2.1 Định tính 34 3.2.2 Định lượng 35 3.2.3 Mối liên quan tổng hàm lượng evodiamine rutaecarpine với hình dạng 39 Chương 4: BÀN LUẬN 46 4.1 Đánh giá tiêu kiểm nghiệm ngô thù du theo DĐVN IV 46 4.1.1 Đặc điểm cảm quan 46 4.1.2 Đặc điểm hiển vi 46 4.1.3 Độ ẩm 47 4.1.4 Tạp chất 47 4.1.5 Định tính……………………………………………………… 47 4.2 Xây dựng tiêu định tính, định lượng mẫu dược liệu phương pháp HPLC thẩm định 47 4.2.1 Định tính 47 4.2.2 Định lượng 48 4.2.3 Mối liên quan tổng hàm lượng evodiamine rutaecarpine với hình dạng 49 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ tắt, ký hiệu Chữ nguyên Ý nghĩa ACN Acetonitrile DCM Dichloromethan DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV HPLC MeOH Methanol Dung môi methanol PDA Đầu dò dãy diode quang SKĐ Photo Diode Array Sắc ký đồ tR Thời gian lưu tt Thể tích 10 Tp HCM Thành phố Hồ Chí Minh High Performance Sắc ký lỏng hiệu Liquid of cao Chromatography iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin 40 mẫu dược liệu thu mua 14 Bảng 3.1 Kết đặc điểm cảm quan 40 mẫu Ngô thù du 25 Bảng 3.2 Kết tìm cấu tử đặc trưng cho bột Ngô thù du……….27 Bảng 3.3 Kết độ ẩm mẫu Ngô thù du 30 Bảng 3.4 Kết % tạp chất mẫu Ngô thù du 31 Bảng 3.5 Kết định tính evodiamine rutaecarpine số mẫu tiêu biểu Ngô thù du 34 Bảng 3.6 Kết hàm lượng Evodiamine Rutaecarpine có mẫu Ngơ thù du thuộc kênh bán lẻ 36 Bảng 3.7 Kết hàm lượng Evodiamine Rutaecarpine có mẫu Ngơ thù du thuộc kênh phân phối sỉ công ty phân phối dược liệu 37 Bảng 3.8 Kết tổng hàm lượng hai alkaloid với kích thước 39 Bảng 3.9 Kết tổng hàm lượng hai alkaloid với độ bung nang 41 Bảng 3.10 Các mẫu có tổng hàm lượng cao nhất………………………… 45 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cây Ngô thù du Hình 1.2 Quả Ngô thù du khô Hình 2.1 Các thiết bị sử dụng 16 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình chiết mẫu 21 Hình 3.1 Mẫu Ngô thù du thu mua tỉnh Trà Vinh (A01)…………………26 Hình 3.2 Mẫu Ngơ thù du từ cơng ty phân phối dược phẩm (B02) 27 Hình 3.3 Kết định tính phản ứng hóa học 33 Hình 3.4 Kết định tính phản ứng Mayer mẫu Ngơ thù du 33 Hình 3.5 Overlay sắc kí đồ mẫu A03, A04, A18 35 Hình 3.6 Kết kiểm tra độ tương đồng phổ UV chuẩn mẫu B01 evodiamine rutaecarpine 35 Hình 3.7 Biểu đồ cột biểu diễn tổng hàm lượng hai alkaloid 40 mẫu thu mua thị trường 38 Hình 3.8 Biểu đồ thề mối liên quan tổng hàm lượng hai alkaloid kích thước Ngơ thù du………………………………………………… 41 Hình 3.9 Biểu đồ thể mối liên quan tổng hàm lượng hai alkaloid độ bung nang với có kích thước nhỏ……………………………….44 Hình 3.10 Biểu đồ thể mối liên quan tổng hàm lượng hai alkaloid độ bung nang với có kích thước lớn……………………………44 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngơ thù du có tên khoa học Evodia rutaecarpa họ Cam (Rutaceae), dược liệu sử dụng từ lâu nhiều nước giới Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Việt Nam…để dùng cho số trường hợp viêm nhiễm, sốt nóng, đau bụng, đau đầu, chân tay tê mỏi [1,6] … Ở nước ta, mọc nhiều tỉnh Hà Giang, người dân thường gọi Xà lạp hay Ngô thù Hoạt chất Ngơ thù du chứng minh hai alkaloid evodiamine rutaecarpine với nhiều tác dụng: tham gia chế kháng viêm tế bào, ức chế tuyến tụy tiết insulin, ức chế chọn lọc men MAO - B, kháng viêm, chống huyết khối, tác dụng giãn mạch, hạ huyết áp,… Đặc biệt tác dụng diệt tế bào ung thư, có hiệu trường hợp ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư bạch cầu,… [13, 14, 22] Theo khuyến cáo Tổ chức Y tế giới nghiên cứu thuốc từ dược liệu yếu tố hiệu lâm sàng, độ an tồn, nghiên cứu chế tác dụng cần phải có nghiên cứu thành phần hóa học phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu cách khoa học đầy đủ Chỉ tiêu đánh giá chất lượng Ngô thù du quy định Dược Điển Việt Nam IV Tuy nhiên, phần định tính phản ứng hóa học định lượng tinh dầu không phù hợp cho việc đánh giá chất lượng dược liệu Thực tế, việc sử dụng Ngô thù du dựa vào tác dụng dược lý hai alkaloid evodiamine rutaecarpine [12, 19, 24] Nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu đầu vào sản xuất Ngô thù du, sơ xây dựng dấu vân tay cho dược liệu dựa việc định tính chất đánh dấu (2 markers) evodiamine rutaecarpine Ngô thù du, đồng thời định lượng hai alkaloid dược liệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Ngoài ra, PL-5 12 A12 13 A13 14 A14 15 A15 16 A16 17 A17 18 A18 19 B01 20 B02 21 A19 22 A20 23 A21 24 A22 0,259 0,148 0,131 0,143 0,348 0,319 0,332 0,208 0,223 0,226 0,398 0,424 0,373 0,882 0,993 1,006 0,113 0,117 0,116 0,415 0,432 0,432 0,056 0,045 0,051 0,105 0,088 0,090 0,099 0,109 0,103 0,125 0,129 0,129 0,101 0,109 0,109 0,196 0,171 0,141 ± 0,0065 0,333 ± 0,0107 0,219 ± 0,0071 0,398 ± 0,0183 0,960 ± 0,0495 0,115 ± 0,0014 0,427 ± 0,0035 0,050 ± 0,0039 0,094 ± 0,0066 0,103 ± 0,0037 0,128 ± 0,0019 0,107 ± 0,0033 0,172 ± 0,0167 PL-6 25 C01 26 C02 27 C03 28 C04 29 C05 30 C06 31 C07 32 B03 33 C08 34 C09 35 B04 0,150 0,369 0,362 0,349 0,142 0,156 0,169 1,400 1,423 1,587 0,235 0,226 0,228 0,295 0,322 0,281 0,101 0,105 0,107 0,417 0,415 0,413 0,227 0,185 0,248 0,178 0,183 0,179 0,073 0,081 0,082 0,095 0,096 0,091 0,360 ± 0,0072 0,156 ± 0,0097 1,470 ± 0,0744 0,230 ± 0,0035 0,299 ± 0,0153 0,105 ± 0,0023 0,415 ± 0,0014 0,220 ± 0,0234 0,180 ± 0,0020 0,079 ± 0,0037 0,094 ± 0,0019 PL-7 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU A03-1 PL-8 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU A04-1 PL-9 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU A06-1 PL-10 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU A10-1 PL-11 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU A17-1 PHỤ LU6C SẮC KÝ ĐỒ MẪU B01-1 PL-12 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU B01-1 PL-13 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU B04-1 PL-14 PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ MẪU C09-2 PL-15 PHỤ LỤC 11 SƠ BỘ DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG QUẢ NGÔ THÙ DU Yêu cầu kĩ thuật 1.1 Tính chất cảm quan: Quả hình cầu hình cầu dẹt, đường kính lớn mm, mặt ngồi màu lục vàng thẫm đến màu nâu, thơ, xù xì Có nhiều điểm chấm dầu nhơ lên trũng xuống Đỉnh có kẽ nứt hình cánh, chia thành mảnh Gốc cịn sót lại cuống phủ lơng tơ vàng Chất cứng, giịn Mặt cắt ngang thấy rõ ô, ô chứa – hạt màu vàng nhạt Mùi thơm ngát, vị cay, đắng 1.2 Đặc điểm hiển vi: lông che chở đa bào gồm đến tế bào, đường kính 140µm đến 350µm, vách ngồi có mấu bướu rõ rệt Một số khoang tế bào chứa chất màu vàng nâu đến đỏ nâu Lơng tiết có đầu hình bầu dục gồm đến 14 tế bào, thường chứa chất tiết màu vàng, chân có đến tế bào Cụm tinh thể canxi oxalat hình cầu gai hình lăng trụ, đường kính 10µm đến 25 µm Tế bào mơ cứng có thành dày có ống trao đổi rõ thành cụm lớn rời rạc, đường kính 35µm đến 75µm Mảnh mơ mềm có chứa tinh bột, tinh thể canxi oxalat hình cầu gai hình lăng trụ Tinh bột, khối màu, mạch vạch Đơi cịn thấy mảnh vỡ màu vàng khoang dầu 1.3 Độ ẩm: không 5,0% 1.4 Tạp chất: không q 3,0% 1.5 Định tính: + phải có phản ứng hóa học alkaloid: phản ứng Mayer phản ứ ng PDAB + định tính HPLC : thời gian lưu tương đồng phổ UV -Vis với chuẩn evodiamine rutaecarpine PL-16 1.6 Định lượng: tổng hàm lượng evodiamine rutaecarpine khơng 0,15% Phương pháp thử 2.1 Tính chất cảm quan: Nhận xét cảm quan, Ngô thù du đạt yêu cầu nêu 2.2 Đặc điểm hiển vi: quan sát kính hiển vi tìm kiếm cấu tử đặc trưng 2.3 Độ ẩm: Quả khô Ngô thù du phải làm thành mảnh nhỏ đường kính khơng q 3mm; lượng đem thử từ g đến g thực việc xác định độ ẩm sau: Dùng dụng cụ dùng để sấy thủy tinh rộng miệng đáy có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khơ bì thời gian 30 phút theo phương pháp điều kiện quy định chuyên luận cân để xác định khối lượng bì Cân vào bì lượng xác mẫu thử khối lượng quy định chuyên luận với sai số ± 10% Nếu khơng có dẫn đặc biệt lượng mẫu thử dàn mỏng thành lớp có độ dày khoảng mm Nếu mẫu thử có kích thước lớn phải nghiền nhanh tới kích thước mm trước cân Tiến hành làm khô điều kiện quy định chuyên luận Nếu dùng phương pháp sấy nhiệt độ thực cho phép chênh lệch ± 0C so với nhiệt độ quy định Sau sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phịng cân bình hút ẩm silica gel cân Nếu chuyên luận khơng quy định thời gian làm khơ có nghĩa làm khô đến khối lượng không đổi tức chênh lệch khối lượng sau sấy thêm tủ sấy bình hút ẩm so với lần sấy trước khơng q 0,5 mg 2.4 Tạp chất: Cân khoảng 20 gam khô Ngô thù du, dàn mỏng tờ giấy, quan sát mắt thường kính lúp, cần dùng rây để phân tách tạp chất dược liệu Tạp chất lẫn dược liệu bao gồm tất chất ngồi quy PL-17 định dược liệu như: Đất, đá, rơm rạ, cỏ khác, phận khác không quy định làm dược liệu, xác trùng Cân phần tạp chất tính phần trăm sau: p: Khối lượng mẫu thử tính gam a: Khối lượng tạp chất tính gam 2.5 Định tính + Bằng phản ứng hóa học: 0,5 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 10ml dung dịch HCl 1% (TT ), lắc mạnh vài phút, lọc Lấy dịch lọc làm phản ứng sau: - 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, cho từ từ 2ml dd p dimethylaminobenzaldehyde (TT), đun cách thủy, hai lớp dung dịch hình thành vịng nâu đỏ - 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm giọt TT Mayer (TT), lắc đều, có tủa màu trắng ngà + Bằng phương pháp HPLC 2.6 Định lượng Chuẩn bị mẫu chuẩn Dung dịch chuẩn gốc evodiamine: cân xác khoảng mg chuẩn evodiamine cho vào bình định methanol, bổ sung vừa đủ mức 25 ml, hòa tan PL-18 methanol, siêu âm 10 phút Dung dịch thu có nồng độ evodiamine 200µg/ml Dung dịch chuẩn gốc rutaecarpine: cân xác khoảng 0,5 mg chất chuẩn rutaecarpine, cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung vừa đủ methanol, siêu âm 10 phút Ta dung dịch chuẩn gốc rutaecarpine nồng độ 20 µg/ml Chuẩn bị mẫu thử Quả khô Ngô thù du nghiền nhỏ qua rây 0,3 mm thu bột Ngô thù du Cân xác khoảng 0,1000g bột dược liệu cho vào erlen 125ml Cho khoảng 40 ml methanol vào Siêu âm 20 phút, lọc qua giấy lọc thu dịch chiết, siêu âm lần Cô dịch chiết bếp cách thủy 70 0C thu cắn Hòa tan cắn với khoảng 10 ml hỗn hợp Methanol: Dichloromethan (1:10 (tt/tt)) lắc phân bố loại tạp với 10 ml Lắc loại tạp lần Dịch chiết lớp Methanol:Dichloromethan cô đến cắn bếp cách thủy 50 0C Hòa tan cắn methanol bình định mức 10 ml, lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm Dịch lọc tiến hành sắc k ý với điều kiện sắc ký thẩm định sau: Cột sắc ký: Phenomenex Gemini RP- C18 (150 mm x 4.6 mm, 5μm) Hệ thống máy HPLC Hitachi L-2000, DAD- L2500, Bước sóng phát hiện: 225 nm Tốc độ dịng: 1ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 μl Nhiệt độ: nhiệt độ phịng thí nghiệm Pha động: Thời gian (phút) 0-15 15-20 20-30 Tỉ lệ pha động (tt/tt/tt) ACN MeOH 15 45 15 45 100 H2O 40 40 Tốc độ dòng (ml/phút) 1,0 1,2 1,2 PL-19 Xác định nồng độ evodiamine rutaecarpine dung dịch sắc ký dựa vào đường chuẩn Từ tính hàm lượng (g/100g) evodiamine rutaecarpine dược liệu tính theo chế phẩm khơ tính theo cơng thức sau: C: nồng độ evodiamine hay rutaecarpine dung dịch phân tích (µg/ ml) V: thể tích dung dịch mẫu thử (ml) m: khối lượng bột dược liệu sử dụng (g) a: độ ẩm bột dược liệu cao khô dược liệu (%)