Kỹ thuật PCR

KỸ THUẬT PCR (Polymerase chain reaction) Nhóm Lời nói đầu PCR cách mạng hóa ngành sinh học nhờ khả lấy lượng DNA cực nhỏ khuếch đại thành số lượng phân tích Trước đây, cách để khuếch đại DNA sử dụng vi khuẩn để tạo nhiều Quá trình tốn nhiều thời gian liên quan đến việc chuyển đoạn DNA vào plasmid vectơ khác, biến đổi DNA kết hợp thành tế bào vi khuẩn, phát triển số lượng lớn vi khuẩn tinh đoạn DNA từ vi khuẩn lần Giới thiệu • 1983 Kerry Mullis phát minh PCR • 1993 K Mullis Michael Smith đạt giải Nobel • Q trình PCR lần miêu tả Kjell Kleppe H Bobind Khorana Nguyên tắc phản ứng • Kerry Mullis Dựa vào đặc tính hoạt động DNA polymerase Michael Smith • Primer bắt cặp đặc hiệu vào hai đầu trình tự DNA khuếch đại forward primer reverse primer 31 “Điều thú vị hóa sinh phát triển với máy tính Nếu máy tính khơng xuất lúc với việc khám phá cấu trúc DNA, khơng có hóa sinh Bạn ln cần máy tính để xử lý thơng tin Khơng có nó, chúng tơi có phịng phịng có đầy nhà sư viết trình tự” Đại diện đồ họa Kary Mullis mơ tả tầm nhìn ơng PCR Thành phần phản ứng PCR Tùy mục đích sử dụng sản phẩm khuếch đại, phản ứng PCR, tích từ 25 – 100 μL, gồm L, gồm thành phần sau: • DNA 0,1 – μL, gồm g • Primer (Forward primer), 0,1- 1μL, gồm M • Primer (reverse primer), 0,1- 1μL, gồm M • Buffer phản ứng (Tris – HCl, pH 8,3) • MgCl2 1,5 mM • dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 0,2 mM/loại • Taq DNA polymerase, unit Primer Chiều primer (The orientation of primers): chiều primer kéo dài tổng hợp DNA Mỗi primer gắn với sợi khuôn Primer xuôi (forward primer): gắn với sợi antisense (-) => tương tự phần trình tự sợi (+) Primer ngược (reverse primer): gắn với sợi sense (+) => tương tự phần trình tự sợi (-) http://www.bioinformatics.nl/ 32 Primer 1.Primer DNA sợi đơn ngắn (15 – 30 bp), bắt cặp bổ sung với hai sợi DNA khuôn mẫu Thiết kế primer cần đảm bảo tính chuyên biệt hiệu phản ứng tuân thủ số nguyên tắc về: • Độ dài • Tm, Tm = [(A + T) x + (G + C) x 4] • Thành phần nucleotide • Tránh hình thành dimer Nhiệt độ bắt cặp (annealing temperature, Ta) thấp Tm primer từ -5oC 33 PCR kỹ thuật tuyệt vời! Nhưng thất bại primer khơng thiết kế xác Các đoạn primer PCR phải đủ dài để liên kết với DNA mục tiêu cụ thể ưu tiên chúng phải liên kết với DNA mục tiêu chúng Các chương trình máy tính phát triển để hỗ trợ thiết kế pimer PCR có sẵn thơng qua nhiều nguồn khác internet Tính đặc hiệu primer PCR đặc điểm quan trọng phần lớn trình tự primer PCR Để đảm bảo gắn đặc hiệu với DNA đích, đoạn primer PCR cần phải có độ dài vừa đủ Các đoạn primer PCR điển hình có chiều dài từ 18 đến 22 nucleotide Xác suất đoạn primer liên kết với trình tự ngẫu nhiên giảm độ dài đoạn mồi tăng lên   Ta ví dụ toán xác suất Đầu tiên, giả sử mẫu DNA gen có lượng G, A, T C nhau, xác suất nucleotide cụ thể A 0,25 Nói cách khác, vị trí gen, có 1/4 khả A Tương tự, vị trí DNA có 1/4 khả C, T G Do đó, GCTA có xác suất (0.25) x(0.25) x(0.25)x(0.25) = 0.0039 tìm thấy theo thứ tự Trong gen người có 3,3 tỷ nucleotide, trình tự GATC xảy 12.870.000 lần Ngược lại, trình tự dài 20 nucleotide có xác suất = 9.09x Khả trình tự 20 nucleotide xuất ngẫu nhiên gen thực 3,3xx 9.09x=0,003, nhỏ => Do đó, đoạn primer gồm 20 nucleotide thiết kế để bổ sung cho vị trí cụ thể gen có khả liên kết với trình tự khác thấp Một đoạn primer gồm 20 nucleotide thiết kế để bổ sung cho vị trí cụ thể gen có khả liên kết với trình tự khác thấp Tất nhiên tập vài giả định Đầu tiên, gen người có nhiều trình tự DNA lặp lặp lại việc thiết kế đoạn primer để liên kết với đoạn lặp có nghĩa liên kết với đoạn lặp khác, có chiều dài 20 nucleotide Ngồi ra, xác suất mà tơi giả định gen có số lượng G, A, T C Trên thực tế, hầu hết gen bị sai lệch có nhiều cặp sở A/T cặp sở G/C ngược lại