Tổng quan về kỹ thuật PCR

TỔNG QUAN PCR • PCR (Polymerase Chain Reaction) phản ứng nhân trình tự DNA quan tâm test tube • K.Mullis phát minh năm 1985 => năm sau đạt giải Nobel hóa • Thành phấn cần có: DNA polymerase dNTP Primer ( F – R) DNA mẫu ( DNA mục tiêu) Buffer Mg 2+ • Ưu điểm PCR: Nhanh – Nhạy – Đặc hiệu SO SÁNH NHÂN BẢN TỰ NHIÊN VÀ PCR Replication – tái PCR DNA DNA template / RNA Enzyme Ko cần bù lại cần nhiệt độ DNA polymerase DNA polymerase dNTPs dNTPs Mg 2+ Mg 2+ Primer: RNA Primer DNA ( F – R) Ko cần buffer buffer Mỗi chu kì gồm giai đoạn a Biến tính: 94 C – 15s – 1min + Dưới tác động nhiệt độ sợi DNA tách thành sợi đơn b Bắt cặp: 55 -65 độ C – 15s – 1min + Các primer bám vào: F bám vào antisene R bám vào sene + Phụ thuộc vào primer: đặc biêt G + C 40% chiều dài 18 -> 22 nu c Kéo dài: 72 độ C – 30s – 3min + Primer chạy dài tạo sản phẩm + Ko 300 nu + DNA polymerase hoạt động có primer + Kéo dài chiều 5’ – 3’ Tm = (G+C) + 2(A+T) Nhằm tăng tính đặc hiệu sử dụng primer để giới hạn đoạn gene PCR REAL TIME PCR qPCR PCR q PCR Định tính – xác định có đoạn gene hay khơng Xác định số lương gen mục tiêu, bản, bao hàm định tính tính Chất phát huỳnh quang Quan sát gel điện di buồng chụp điên di Thu ảnh thông qua detectior thu nhận tính hiệu ánh sáng Chất phát huỳnh quang – chất nhận lượng luồng ánh sáng tới tích lũy phát lượng bước sống cao  Ethidium bromide – sáng gấp 25 lần  SYBR green – sáng gấp 200 lần • PCR quan sát trực tiếp • Cấu tạo: + Máy luân nhiệt PCR + Máy quang phổ huỳnh + Máy vi tính • Mỗi chu kì gồm trình diễn đồng thời: + PCR - Nhân DNA + Đo độ phát huỳnh quang • Cách nhận biết có tín hiệu +Phẩm nhuộm -> Ghép với sợi DNA => tạo tín hiệu huỳnh quang +Probe đặc hiệu –> gắn với trình tự đích => tạo tín hiệu huỳnh quang Ưu điêm: Định lượng – Nhậy – Đặc hiệu – Hiệu - Nhanh, qui trình đơn giản – Giảm nguy ngọại nhiễm