Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp bacteriocin của bacillus amyloliquefacien báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA Bacillus amyloliquefaciens Mã số đề tài: SV20/1.5 SHTPSV01 Chủ nhiệm đề tài: Võ Thị Cẩm Giang Nguyễn Xuân Trung Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh, 2021 LỜI CẢM ƠN Đề tài “Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp bacteriocin Bacillus amyloliquefacien ” nội dung chúng em chọn để thực đề tài nghiên cứu cấp trường Để thực tốt đề tài nghiên cứu này, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phịng Quản lí Khoa học Hợp tác Quốc tế trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh tạo môi trường học tập nghiên cứu thân thiện hỗ trợ mặt kinh phí để chúng em phát huy khả nghiên cứu khoa học Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo, Phịng Quản lí Phịng thí nghiệm thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm hổ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi sở trang thiết bị cho chúng em trình thực đề tài nghiên cứu Để có thành cơng ngày hơm khơng cơng sức cá nhân mà nhờ vào cố gắng tập thể, bạn bè, anh chị quan trọng hết hỗ trợ tận tình thầy cơ, người đưa đò dẫn lối cho chúng em đường tìm kiếm tri thức Em xin gửi đến quý thầy cô Viện Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm–Trường Đại Học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh tận tình hỗ trợ truyền đạt cho em kiến thức chuyên môn, hành trang quý giá để tơi tự tin bước vào đời cống hiến cho xã hội rời khỏi ghế nhà trường Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Tấn Việt dành thời gian quý báu em buổi trị chuyện, lời khun chân thành lĩnh vực nghiên cứu khoa học Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Bên cạnh tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh TS Nguyễn Ngọc Ẩn đồng hành, tạo điều kiện hỗ trợ em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn bạn bè thành viên Lab Vi Sinh với gia đình ln hỗ trợ, động viên em suốt q trình thực hiện, ln tạo điều kiện thuận lợi để em hồn tất khố luận Mặc dù đề tài không tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp q báu q thầy bạn học giúp khóa luận hồn thiện PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Khảo sát điều kiện sinh tổng họp Bacteriocin Bacillus amyloliquefaciens 1.2 Mã số: SV20/1.5 SHTPSV01 1.3 Danh sách chủ trì, sinh viên tham gia thực đề tài Họ tên TT Đơn vị công tác Vai trị thực đề tài Viện Cơng nghệ sinh Cố vấn khoa học (học hàm, học vị) TS Phạm Tấn Việt học Thực phẩm Võ thị Cẩm Giang DHSH13B, Viện Chủ nhiệm đề tài Công nghệ Sinh học Thực phẩm Nguyễn Xuân Trung DHSH13B, Viện Thành viên Công nghệ Sinh học Thực phẩm 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2020 đến tháng năm 2021 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 11 năm 2021 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2020 đến tháng 11 năm 2021 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Dựa số thay đổi thực tế điều kiện thí nghiệm, chúng tơi có số thay đổi so với thuyết minh sau: Thuyết minh ban đầu Thay đổi Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Vi sinh vật đối Pseudomonas aeruginosa, kháng Staphilococus aureus, Escherichia coli, Bacillus sutillis Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Shigella flexnenri, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus pH muôi trường nuôi cấy 6,0; 6,5;7,0; 7,5; 8,0 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 Bên cạnh thay đổi bổ sung thêm thí nghiệm sau: Nội dung thay đổi STT Khảo sát độ bền nhiệt hợp chất kháng khuẩn có dịch ni cấy Ảnh hưởng proteinase K đến hoạt tính kháng khuẩn có dịch ni cấy 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 05 triệu đồng (bằng chữ: Năm triệu đồng) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm vấn đề quan tâm cần thiết, tiếp cận với thực phẩm an toàn nhu cầu người Ngộ độc thực phẩm bệnh thực phẩm gây không ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người mà gây thiệt hại kinh tế xã hội Yếu tố gây ngộ độc thực phẩm bao gồm độc tố tự nhiên, chất độc hóa học, vi sinh vật gây bệnh độc tố chúng Trong số đó, vi sinh vật gây bệnh độc tố chúng thường tác nhân gây ngộ độc thực phẩm tức thời Theo nghiên cứu Phạm Thị Ngọc Lan cộng (2012) mẫu thực phẩm kiểm tra có 19,9% mẫu khơng đạt tiêu Coliforms, 24,8% mẫu không đạt tiêu E coli Đối với mẫu bàn tay vật dụng có 21,7% khơng đạt tiêu E coli, có 9,1% khơng đạt tiêu [1] Theo nghiên cứu Trần Thị Thùy Giang cộng (2014), tỉ lệ nhiễm khuẩn E coli thực phẩm 14,1%, tỉ lệ kháng với kháng sinh 76,7%, tỉ lệ kháng từ kháng sinh trở lên 65% có 63,3% số chủng sản xuất men β-lactamase [2] Trong nghiên cứu khác Nguyễn Xuân Hòa (2015) cho thấy rằng, 11,76% mẫu thịt lợn công ty xuất 47,06% mẫu lị mổ khơng đạt tiêu E coli Số mẫu không đạt tiêu Staphylococcus aureus công ty xuất nhập 8,82% lò mổ tiêu thụ nội địa 41,18% Tỷ lệ nhiễm Salmonella thịt lợn xuất 2,94% lò mổ tiêu thụ nội địa 20,59% [3] Phạm Thị Thanh Thảo cộng (2018) thực khảo sát tỷ lệ nhiễn khuẩn mẫu thịt lợn chợ tập trung chợ nhỏ lẻ Kết cho thấy tỷ lệ nhiễm E coli chợ tập trung chợ nhỏ lẻ 11,11% 66,67%, tỷ lệ nhiễm Salmonella mẫu chợ nhỏ lẻ 27,27% không phát nhiễm Salmonella chợ tập trung Tỷ lệ mẫu nước sử dụng chợ tập trung chợ nhỏ lẻ nhiễm Coliforms vượt ngưỡng cho phép 77,27% 81,48% [4] Một nghiên cứu khác Trần Thị Hằng cộng (2020) cho thấy 100% mẫu thịt lợn bị nhiễm Salmonella spp E coli [5] Khi phân tích mẫu thu thập siêu thị chợ khắp EU, Listeria monocytogenes tìm thấy 10,3% sản phẩm thủy sản, 2,1% mẫu thịt qua xử lí nhiệt, 0,5 % mẫu phomat mềm nửa mềm [6] Việc sử dụng hóa chất tổng hợp việc kiểm sốt vi sinh vật gây hại lại đặt mối quan ngại việc đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng Do đó, cần tìm kiếm sản xuất hợp chất kháng khuẩn hiệu an toàn nhằm giảm phụ thuộc vào chất kiểm sốt vi sinh vật có chất hóa học cần thiết Bacteriocin chất giống bacteriocin (BLIS) số Bacteriocin peptide hay protein có tác dụng ức chế tiêu diệt vi sinh vật vi khuẩn sinh Trong năm gần đây, nghiên cứu bacteriocin BLIS tiến hành rộng rãi chuyên sâu để đáp ứng nhu cầu xác định hợp chất kháng khuẩn nhằm thay kháng sinh chất kiểm sốt vi sinh vật có chất hóa học Thấy tiềm khả ứng dụng hợp chất kháng khuẩn vào nhiều lĩnh vực khác nên định thực đề tài:”Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp Bacteriocin Bacillus amyloliquefaciens” Mục tiêu nghiên cứu Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn, ảnh hưởng nhiệt độ proteinase K lên hoạt tính kháng khuẩn dịch nuôi cấy B amyloliquefaciens D19 Với mục tiêu đề tài gồm nội dung nghiên cứu sau: ‐ Khảo sát khả đối kháng dịch nuôi cấy B amyloliquefaciens D19 chủng vi khuẩn chị thị ‐ Khảo sát mơi trường ni cấy thích hợp để B amyloliquefaciens D19 sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính cao ‐ Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn B amyloliquefaciens D19 ‐ Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn B amyloliquefaciens D19 ‐ Khảo sát độ bền nhiệt hợp chất kháng khuẩn ảnh hưởng proteinase K đến hợp chất kháng khuẩn dịch ni cấy ‐ Xác định hoạt tính dịch ni cấy C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phương pháp nghiên cứu 3.1 Kiểm tra giống Bacillus amyloliquefaciens D19 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc: Hình thái đại thể quan sát cách cấy ria chủng B amyloliquefaciens D19 từ ống giống lên môi trường MHA Đặc điểm đại thể quan sát ghi nhận dựa yếu tố chủ yếu: độ lớn, màu sắc, độ khô/ướt độ nhăn/trơn bề mặt, đặc điểm bờ/rìa/trung tâm khuẩn lạc Quan sát đặc điểm vi thể: chủng Bacillus amyloliquefaciens D19 nuôi cấy môi trường MHA Sử dụng phương pháp nhuộm Gram, nhuộm bào tử quan sát kính hiển vi độ phóng đại 1000X để xác định đặc điểm vi thể chủng 3.2 Khảo sát khả sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn B amyloliquefaciens D19 lên vi khuẩn thị Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy: B amyloliquefaciens D19 nuôi tăng sinh môi trường BHI broth với tốc độ lắc 150 rpm 24 Dịch huyền phù chia nhỏ vào eppendorf 1,5 ml, tiến hành ly tâm 13000 rpm 15 phút thu dịch Phần dịch sau ly tâm lọc qua lọc 0,22 µm điều kiện vơ trùng để loại bỏ tế bào cịn sót lại Phương pháp khuếch tán giếng thạch: Các chủng vi khuẩn thị nuôi cấy qua đêm môi trường BHI broth, sau dịch vi khuẩn pha lỗng tương đương với giá trị McFarland 0,5 (≈1,5x108 CFU/ml) để sử dụng làm đối kháng Chuẩn bị đĩa petri chứa 12 ml môi trường MHA, sử dụng tăm vô trùng thấm dịch nuôi cấy vi khuẩn thị trải bề mặt đĩa khơ Tiến hành đục giếng thạch với đường kính mm đĩa thạch Hút 50 µl dịch cho vào giếng: giếng 1: dung dịch NaCl 0,9%, giếng 2, 3, 4: dịch nuôi cấy [7] Bảo quản đĩa 4℃ giúp dịch nuôi cấy vi khuẩn khuếch tán hồn tồn vào thạch Sau đó, đĩa đủ 37℃ đọc kết sau 12 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Khả kháng khuẩn dịch nuôi cấy xác định diện vịng vơ khuẩn xung quanh giếng thạch, đường kính vịng kháng khuẩn tính cơng thức [7]: H = D-d Trong đó: (2-1) H: độ lớn vịng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch (mm) D: độ lớn vòng ức chế (bao gồm đường kính lỗ) (mm) d: đường kính lỗ thạch (mm) 3.3 Chuẩn bị giống B amyloliquefaciens D19 từ ống giống cấy ria đĩa môi trường MHA 37℃ 36 Sau thời gian ủ, dùng que cấy trịn lấy trọn khuẩn lạc cho vào bình ml môi trường BHI broth nuôi lắc 150 rpm, 30℃, từ 12-14 Dùng micropipet hút 1% giống cho vào bình chứa 10 ml mơi trường BHI broth tiếp tục lắc 150 rpm 30℃ đến đạt giá trị OD 600 nm 0,9 Dịch ni cấy sử dụng làm giống cho thí nghiệm 3.4 Khảo sát mơi trường ni cấy thích hợp để Bacillus amyloliquefaciens D19 sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính cao Dùng micropipet hút 300 µl dịch nuôi cấy chuẩn bị cho vào bình chứa 30 ml loại mơi trường khác nhau: LB, TY, CTPT, MRS, BHI Các bình ni lắc 150 rpm, 30℃ Tiến hành thu dịch sau 12 nuôi cấy đánh giá khả kháng khuẩn dịch nuôi cấy thu phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn môi trường thích hợp cho thí nghiệm sau 3.5 Khảo sát nhiệt độ ni cấy thích hợp để Bacillus amyloliquefaciens D19 sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính cao Tiến hành mơi trường lựa chọn thí nghiệm trước, dùng micropipet hút 300 µl dịch nuôi cấy chuẩn bị cho vào cách bình chứa 30 ml mơi trường ni cấy lắc 150 rpm nhiệt độ khác nhau: 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tiến hành thu dịch sau 12 nuôi cấy đánh giá khả kháng khuẩn dịch nuôi cấy thu phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho thí nghiệm sau 3.6 Khảo sát pH mơi trường ni cấy thích hợp để Bacillus amyloliquefaciens D19 sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính cao Thí nghiệm tiến hành mơi trường lựa chọn thí nghiệm trước, dùng micropipet hút 300 µl dịch nuôi cấy chuẩn bị cho vào bình chứa 30 ml mơi trường điều chỉnh với giá trị pH khác nhau: 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 Các bình ni lắc 150 rpm, nhiệt độ lựa chọn thí nghiệm trước Sau 12 nuôi cấy, tiến hành thu dịch đánh giá khả kháng khuẩn phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn giá trị pH ban đầu thích hợp 3.7 Khảo sát độ bền nhiệt hợp chất kháng khuẩn ảnh hưởng proteinase K đến hoạt tính kháng khuẩn dịch ni cấy Tiến hành nuôi cấy chủng B amyloliquefaciens D19 môi trường, nhiệt độ, pH thích hợp lựa chọn thí nghiệm trước, sau thu dịch xử lí Khảo sát độ bền nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn dịch ni cấy: Thí nghiệm thực cách hút ml dịch nuôi cấy vô bào, sau ủ mốc nhiệt độ khác nhau: 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃, 100℃, 121℃ 30 phút Kiểm tra hoạt tính phương pháp khuếch tán giếng thạch Khảo sát ảnh hưởng proteinase K đến hoạt tính kháng khuẩn dịch ni cấy: Thí nghiệm tiến hành cách ủ dịch với proteinase K với nồng độ mg/ml mg/ml 37℃ kiểm tra hoạt tính phương pháp khuếch tán giếng thạch [8] Độ bền nhiệt ảnh hưởng proteinase K đến hoạt tính kháng khuẩn dịch nuôi cấy xác định hiện vịng vơ khuẩn lơ thí nghiệm so với đối chứng 3.8 Phương pháp xác định hoạt tính dịch nuôi cấy Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 10 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 36 - 48 * -4.0 1.05012 36 - 60 * 1.13333 1.05012 48 - 60 * 5.13333 1.05012 * denotes a statistically significant difference Phụ luc 16: Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả kháng Listeria monocytogenes dịch nuôi cấy 90 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an pH Thời gian 7.5 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 12 3,67±0,33 3±0,58 3,67±0,33 3±0 0,67±0,67 24 7,67±0,67 3,67±0,88 10,67±0,67 5±1,15 36 10,33±0,88 4,67±0,88 12±0,58 4,33±0,33 3,33±0,33 48 11,67±0,33 3±0,58 1,67±0,88 0,67±0,67 60 9±0,58 15±0,58 3,67±0,33 2,67±0,33 10,33±0,88 2,33±0,33 1,67±0,88 Phụ lục 17: Hình ảnh kháng Listeria monocytogenes dịch ni cấy theo pH môi trường ban đầu thời gian 1: NaCl, 2: pH 6,0, 3: pH 7,0, 4: pH 7,5, 5: pH 8,0, 6: pH 9,0 91 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ lục 18: Kết phân tích ANOVA khả kháng Listeria monocytogenes dịch nuôi cấy theo pH môi trường ban đầu thời gian Theo pH môi trường ban đầu Multifactor ANOVA - DK_VONG_KHANG_KHUAN_LISTERIA Dependent variable: DK_VONG_KHANG_KHUAN_LISTERIA Factors: pH THOI_GIAN Number of complete cases: 90 Analysis of Variance for DK_VONG_KHANG_KHUAN_LISTERIA - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:pH 672.622 168.156 32.62 0.0000 B:THOI_GIAN 536.889 107.378 20.83 0.0000 RESIDUAL 412.444 80 5.15556 TOTAL 1621.96 89 MAIN EFFECTS (CORRECTED) All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for DK_VONG_KHANG_KHUAN_LISTERIA by pH Method: 95.0 percent LSD 92 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an pH Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 18 9.66667 0.535182 X 18 10.7222 0.535182 X 18 10.8333 0.535182 X 18 15.0556 0.535182 X 7.5 18 16.6111 0.535182 X Contrast Sig Difference +/- Limits 6-7 * 4.22222 1.50621 - 7.5 * -1.55556 1.50621 6-8 * 4.33333 1.50621 6-9 * 5.38889 1.50621 - 7.5 * -5.77778 1.50621 7-8 0.111111 1.50621 7-9 1.16667 1.50621 7.5 - * 5.88889 1.50621 7.5 - * 6.94444 1.50621 93 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 8-9 1.05556 1.50621 * denotes a statistically significant difference Theo thời gian: Multifactor ANOVA - DK_VONG_KHANG_KHUAN_LISTERIA Dependent variable: DK_VONG_KHANG_KHUAN_LISTERIA Factors: THOI_GIAN pH Number of complete cases: 90 Analysis of Variance for DK_VONG_KHANG_KHUAN_LISTERIA - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean Squares F- P- Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:THOI_GIAN 536.889 107.378 20.83 0.0000 B:pH 672.622 168.156 32.62 0.0000 RESIDUAL 412.444 80 5.15556 TOTAL 1621.96 89 (CORRECTED) All F-ratios are based on the residual mean square error 94 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Multiple Range Tests for DK_VONG_KHANG_KHUAN_LISTERIA by THOI_GIAN Method: 95.0 percent LSD THOI_GIAN Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 15 8.0 0.586262 X 12 15 10.8 0.586262 X 60 15 13.2 0.586262 24 15 14.1333 0.586262 XX 48 15 14.4 XX 36 15 14.9333 0.586262 0.586262 X X Contrast Sig Difference +/- Limits - 12 * -2.8 1.64997 - 24 * -6.13333 1.64997 - 36 * -6.93333 1.64997 - 48 * -6.4 1.64997 - 60 * -5.2 1.64997 95 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 12 - 24 * -3.33333 1.64997 12 - 36 * -4.13333 1.64997 12 - 48 * -3.6 1.64997 12 - 60 * -2.4 1.64997 24 - 36 -0.8 1.64997 24 - 48 -0.266667 1.64997 24 - 60 0.933333 1.64997 36 - 48 0.533333 1.64997 1.73333 1.64997 1.2 1.64997 36 - 60 48 - 60 * * denotes a statistically significant difference Phụ lục 19: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính kháng Shigella flexneri dịch ni cấy Nhiệt độ (℃) Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Đối chứng + 7±0 50 6,67±0,33 60 5,33±0,33 70 4,67±0,33 80 2,33±0,33 96 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 90 2,33±0,33 100 2±0 121 0±0 Phụ lục 20: Hình ảnh kháng Shigella flexneri dịch ni cấy theo nhiệt độ Phụ lục 21: Kết phân tích ANOVA khả kháng Shigella flexneri dịch nuôi cấy theo nhiệt độ One-Way ANOVA - DK_VONG_KHANG_KHUAN by NHIET_DO Dependent variable: DK_VONG_KHANG_KHUAN Factor: NHIET_DO Number of observations: 21 Number of levels: ANOVA Table for DK_VONG_KHANG_KHUAN by NHIET_DO 97 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Source of Df Mean Square F-Ratio Sum P-Value Squares Between 95.3333 15.8889 3.33333 14 0.238095 66.73 0.0000 groups Within groups Total (Corr.) 98.6667 20 Multiple Range Tests for DK_VONG_KHANG_KHUAN by NHIET_DO Method: 95.0 percent LSD NHIET_DO Count Mean Homogeneous Groups 121 0.0 X 100 2.0 X 80 2.33333 X 90 2.33333 X 70 4.66667 X 60 5.33333 X 50 6.66667 X Contrast Sig Difference +/- Limits 98 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 50 - 60 * 1.33333 0.854505 50 - 70 * 2.0 0.854505 50 - 80 * 4.33333 0.854505 50 - 90 * 4.33333 0.854505 50 - 100 * 4.66667 0.854505 50 - 121 * 6.66667 0.854505 0.666667 0.854505 60 - 70 60 - 80 * 3.0 0.854505 60 - 90 * 3.0 0.854505 60 - 100 * 3.33333 0.854505 60 - 121 * 5.33333 0.854505 70 - 80 * 2.33333 0.854505 70 - 90 * 2.33333 0.854505 70 - 100 * 2.66667 0.854505 70 - 121 * 4.66667 0.854505 80 - 90 0.0 0.854505 80 - 100 0.333333 0.854505 99 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 80 - 121 * 90 - 100 2.33333 0.854505 0.333333 0.854505 90 - 121 * 2.33333 0.854505 100 - 121 * 2.0 0.854505 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 22: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính kháng Listeria monocytogenes dịch ni cấy Đường kính vịng kháng khuẩn NHIỆT ĐỘ (mm) ĐC + 12±0 50 11,67±0,33 60 10,67±0,88 70 8,33±0,88 80 5,67±0,33 90 5±0,58 100 4,67±0,33 121 3±0,58 Phụ lục 23: Hình ảnh kháng Listeria monocytogenes dịch nuôi cấy theo nhiệt độ 100 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ lục 24: Kết phân tích ANOVA khả kháng Listeria monocytogenes dịch nuôi cấy theo nhiệt độ One-Way ANOVA - DK_VONG_KHANG_LISTERIA by B.NHIET_DO Dependent variable: DK_VONG_KHANG_LISTERIA Factor: B.NHIET_DO Number of observations: 21 Number of levels: ANOVA Table for DK_VONG_KHANG_LISTERIA by B.NHIET_DO Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 192.667 32.1111 0.0000 15.3333 14 1.09524 29.32 groups Within groups 101 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Total (Corr.) 208.0 20 Multiple Range Tests for DK_VONG_KHANG_LISTERIA by B.NHIET_DO Method: 95.0 percent LSD B.NHIET_DO Count Mean Homogeneous Groups 121 3.0 X 100 4.6666 XX 90 5.0 X 80 5.6666 X 70 8.3333 X 60 10.666 X 50 11.666 X Contrast Sig Difference +/- Limits 50 - 60 50 - 70 * 1.0 1.83271 3.33333 1.83271 102 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 50 - 80 * 6.0 1.83271 50 - 90 * 6.66667 1.83271 50 - 100 * 7.0 1.83271 50 - 121 * 8.66667 1.83271 60 - 70 * 2.33333 1.83271 60 - 80 * 5.0 1.83271 60 - 90 * 5.66667 1.83271 60 - 100 * 6.0 1.83271 60 - 121 * 7.66667 1.83271 70 - 80 * 2.66667 1.83271 70 - 90 * 3.33333 1.83271 70 - 100 * 3.66667 1.83271 70 - 121 * 5.33333 1.83271 80 - 90 0.666667 1.83271 80 - 100 1.0 1.83271 2.66667 1.83271 0.333333 1.83271 80 - 121 90 - 100 * 103 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn