Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ quả thể nấm thượng hoàng (phellinus pini) ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ HOA PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ QUẢ THỂ NẤM THƢỢNG HOÀNG (PHELLINUS PINI) Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC VINH, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ HOA PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ QUẢ THỂ NẤM THƢỢNG HOÀNG (PHELLINUS PINI) Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ Mã số: 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN ĐÌNH THẮNG VINH, 2015 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ii DANH MỤC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂULỜI CẢM ƠN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT v MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Đối tƣợng nghiên cứu Mục đích Nhiệm vụ nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Chi Phellinus 1.1.1 Một số hoạt tính phân loại nấm Thượng Hoàng(Phellinus) 1.1.2 Các hợp chất phân lập từ chi Phellinus 1.1.3 Một số hợp chất khác tách từ Phellinus linteus 15 1.2 Đặc điểm loài nấm Phellinus pini (Brot.)Bondartsev & Singer 21 1.2.2 Thành phần hóa học Phellinus pini 22 Chƣơng .24 PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM .24 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.1.1 Phương pháp lấy mẫu 24 2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất .24 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất .24 2.2 Hoá chất, dụng cụ thiết bị 25 2.2.1 Hoá chất 25 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 25 2.3 Nghiên cứu hợp chất 25 2.3.1 Thu mẫu .25 2.3.2 Phân lập hợp chất .25 Chƣơng .29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Phân lập hợp chất A 29 3.4 Xác định hợp chất B .44 KẾT LUẬN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Nấm Phellinus pini (Brot.)Bondartsev & Singer (mặt trƣớc) 21 Hình 1.2 Nấm Phellinus pini (Brot.)Bondartsev & Singer (mặt sau) 21 Hình 3.1: Phổ IR hợp chất A 32 Hình 3.2: Phổ khối lƣợng HR-ESI-MS hợp chất A 33 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR hợp chất A .33 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR hợp chất A .34 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR hợp chất A .34 Hình 3.6: Phổ 13C-NMR hợp chất A 35 Hình 3.7: Phổ 13C-NMR hợp chất A 35 Hình 3.8: Phổ DEPT hợp chất A 36 Hình 3.9: Phổ DEPT hợp chất A 36 Hình 3.10: Phổ HMBC hợp chất A 37 Hình 3.11: Phổ HMBCcủa hợp chất A 38 Hình 3.12: Phổ HMBC hợp chất A 39 Hình 3.13: Phổ HMBC hợp chất A 40 Hình 3.14: Phổ HMBC hợp chất A 41 Hình 3.15: Phổ HSQC hợp chất A 42 Hình 3.16: Phổ HSQC hợp chất A 43 Hình 3.17: Phổ 1H-NMR hợp chất B 46 Hình 3.18: Phổ 1H-NMR hợp chất B 46 Hình 3.19: Phổ 1H-NMR hợp chất B 47 Hình 3.20: Phổ 13C-NMR hợp chất B 47 Hình 3.21: Phổ 13C-NMR hợp chất B 48 Hình 3.22: Phổ DEPT hợp chất B 48 Hình 3.23: Phổ DEPT hợp chất B 49 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Sơ đồ 2.1: Chiết cao metanol thể nấm Phellinus pini (Brot.)Bondartsev & Singer 27 Sơ đồ 2.2: Phân lập hợp chất cao hexan 27 Bảng 3.1: Số liệu phổ NMR hợp chất A 30 Bảng 3.2 Phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT hợp chất B .44 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an LỜI CẢM ƠN Luận văn thực phịng thí nghiệm chun đề Hóa hữu Khoa Hóa học, Trung tâm kiểm định chất lượng an tồn thực phẩm mơi trường Trường Đại Học Vinh, Viện Hàn lâm – Viện khoa học công nghệ Việt Nam Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Trần Đình Thắng, Trường Đại Học Vinh giao đề tài tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hoàng Văn Lựu, Đại Học Vinh giúp đỡ bảo tận tình cho tơi hồn thành luận văn Xin cảm ơn TS Ngô Anh, Đại học Khoa học, Đại học Huế, TS Đỗ Ngọc Đài định danh mẫu Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến thầy cơ, cán bộ mơn hóa hữu cơ, khoa hóa học, anh chị nghiên cứu sinh, học viên cao học, bạn sinh viên phịng thí nghiệm chun đề hóa hữu cơ, gia đình người thân giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Vinh, ngày … tháng 10 năm 2015 TÊN HỌC VIÊN Nguyễn Thị Hoa Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CC: Column Chromatography (Sắc kí cột) FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng) EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron) H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: Singlet br s: Singlet tù t: Triplet d: Doublet dd: Doublet doublet dt: Doublet triplet m: Multiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: Dimethylsulfoxide Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam vùng nhiệt đới với địa hình đa dạng, khí hậu phức tạp, hệ thực vật nấm đa dạng đƣợc ghi nhận trung tâm đa dạng sinh học giới Số loài nấm lãnh thổ Việt Nam ƣớc tính gấp lần số lồi thực vật bậc cao, khoảng 80.000 lồi có khoảng 2500 lồi đƣợc xác định định danh [15, 16, 22] Trong có nhiều loại nấm có giá trị dinh dƣỡng đƣợc dùng y học từ lâu nhƣ: nấm Linh Chi, Hoàng Chi, Cổ Chi,… đƣợc sử dụng nhiều y học cổ truyền để điều trị bệnh nhƣ: ho, tăng huyết áp, làm thuốc an thần, bổ gan, dƣỡng tim, tăng cƣờng trí nhớ, làm da tƣơi trẻ, kéo dài tuổi thọ,…[2] Nấm Thƣợng Hồng (Phellinus) có đặc tính giống Linh Chi nhƣ tăng cƣờng khả miễn dịch, điều hòa huyết áp, lọc thận, giúp giảm tình trạng máu nhiễm mỡ, gan nhiễm mỡ Nấm Phellinus đặc biệt đƣợc quan tâm có chất Basidiomycetes có tác dụng phịng chống bệnh ung thƣ, đột quỵ, đặc biệt có hiệu cao chống lại bệnh ung thƣ dày, thực quản phổi [5] Các loài nấm thuộc họ Hymenochaetaceae có giá trị mặt dƣợc liệu có hoạt tính sinh học quý song việc nghiên cứu thành phần hóa học chƣa đƣợc tiến hành nhiều Việt Nam [20] Chính chọn đề tài: “Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất từ thể nấm Thượng Hồng (Phellinus pini) Việt Nam”từ góp phần xác định thành phần hoá học hợp chất tìm nguồn ngun liệu cho ngành hố dƣợc Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu dịch chiết từ thể nấm Phellinus pini Pù Huống – Nghệ An Mục đích - Nghiên cứu thành phần hóa học thể nấm Phellinus pini Nhiệm vụ nghiên cứu Trong luận văn chúng tơi có nhiệm vụ - Chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp chất từ thể nấm Phellinus pini - Sử dụng phƣơng pháp sắc ký kết tinh phân đoạn để phân lập hợp chất - Sử dụng phƣơng pháp phổ để xác định cấu trúc hợp chất thu đƣợc Phƣơng pháp nghiên cứu - Sử dụng sắc kí cột sắc kí mỏng với dung mơi rửa giải phù hợp để tách hợp chất từ Phellinus pini - Sử dụng có phƣơng pháp đo phổ đại nhƣ: phổ hồng ngoại IR, phổ tử ngoại UV, phổ khối lƣợng va chạm eclectron EI – MS, HR-ESIMS phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DETP, phổ Phổ HSQC, HMBC, COSY để xác định cấu trúc hợp chất Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Chi Phellinus 1.1.1 Một số hoạt tính phân loại nấm Thượng Hồng(Phellinus) Năm 1998, Ngơ Anh Lê Thức báo cáo “Dẫn liệu bƣớc đầu họ Hymenochaetaceae Donk Thừa Thiên Huế” với 39 lồi, 10 lồi ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam Các loại nấm thuộc chi Phellinus đƣợc biết đến sử dụng nhiều năm chúng có đặc tính giống Linh Chi có tăng cƣờng khả miễn dịch, điều hịa huyết áp, lọc thận, giúp giảm tình trạng máu nhiễm mỡ, gan nhiễm mỡ Nấm Phellinus đặc biệt đƣợc quan tâm có chứa chất Basidiomycetes với hàm lƣợng cao gấp ba lần, chất có tác dụng phòng chống bệnh ung thƣ, đột quỵ, đặc biệt có hiệu cao việc chống lại bệnh ung thƣ dày, thực quản phổi[5] Theo phân tích nhóm nghên cứu TS Chihara trung tâm nghiên cứu trung ƣơng quốc gia Tokyo Nhật Bản từ năm 1976 cho thấy dịch chiết 27 loài nấm thuộc chi Phellinus cho tỉ lệ ức chế tế bào ung thƣ chuột 87,4% ( nấm Phellinus igniarius) 96,7% (nấm Phellinus linteus), [5] Theo Walder cộng sự, phần dịch chiết nƣớc loài nấm lớn Fomitella supina, Phellnius rhabarius, Trichaptum perottotti Trametes cubensis thể khả kháng vi rút HIV – nhƣng không gây độc tế bào Lympho[41] Theo Mi – Yae Shon cộng Phellinus baumii có khả chống oxi hóa ngăn hoạt động gốc tự [32] Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 41 Hình 3.14: Phổ HMBC hợp chất A Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 42 Hình 3.15: Phổ HSQC hợp chất A Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 43 Hình 3.16: Phổ HSQC hợp chất A Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 44 3.4 Xác định hợp chất B Hợp chất B chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 168 – 1700C Phổ khối lƣợng va chạm electron (EI-MS) cho pic ion phân tử m/z 398 tƣơng ứng với cơng thức phân tử C28H46O Phổ 1H-NMR cho thấy có tín hiệu nhóm metyl  0,55 (3H, s), 0,81 (3H, d, J = 8,0 Hz), 0,84 (3H, d, J = 7,5), 0,92 (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,22 (3H,s) 1,02 (3H, d, J = 7,0 Hz), tín hiệu proton carbinol  3,59 (1H, m) tín hiệu proton olefinic  5,22 (1H, dd, J = 15,0, 7,5 Hz), 5,19 (1H, dd, J = 15,0, 8,0Hz) 5,16 (1H, m) 13 Phổ C-NMR cho thấy tín hiệu 28 nguyên tử cacbon bao gồm cacbon olefinic  118,0, 139,6, 132,1 136,2 tín hiệu cacbon liên kết với oxy  70,3 Bảng 3.2 Phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT hợp chất B Cacbon DEPT 13C-NMR CH2 37,7 37,2 CH2 32,3 31,5 CH 70,3 71,1 CH2 38,9 38,0 CH 40,7 40,3 CH2 30,1 29,7 CH 118,0 117,5 C 139,6 139,6 CH 49,8 49,5 10 C 34,6 34,2 11 CH2 21,8 21,6 12 CH2 39,7 39,5 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 1H-NMR 3,59 (1H, m) 5,16 (1H,m) C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 45 13 C 43,5 43,3 14 CH 55,4 55,1 15 CH2 23,3 22,9 16 CH2 28,5 28,1 17 CH 56,2 56,0 18 CH3 12,3 12,1 0,55 (3H, s) 19 CH3 13,2 13,0 1,22 (3H, s) 20 CH 40,8 40,5 21 CH3 21,4 21,1 1,02 (3H, d, J= 7,0) 22 CH 136,2 135,7 5,22 (1H, dd, J=15,0 ; 7,5) 23 CH 132,1 131,9 5,19 (1H, dd, J=15,0; 8,0) 24 CH 43,1 42,8 25 CH 33,3 33,1 26 CH3 19,9 19,7 0,81 (3H, d, J= 8,0) 27 CH3 20,1 20,0 0,84 (3H, d, J= 7,5) 28 CH3 17,8 17,6 0,92 (3H, d, J= 7,0) Từ số liệu phổ UV, IR, EI-MS, 1H-, 13C-NMR, DEPT so sánh với tài liệu [30] cho phép xác định hợp chất B Ergosta-7,22-dien-3-ol HO Ergosta-7,22-dien-3-ol Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 46 Hình 3.17: Phổ 1H-NMR hợp chất B Hình 3.18: Phổ 1H-NMR hợp chất B Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 47 Hình 3.19: Phổ 1H-NMR hợp chất B Hình 3.20: Phổ 13C-NMR hợp chất B Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 48 Hình 3.21: Phổ 13C-NMR hợp chất B Hình 3.22: Phổ DEPT hợp chất B Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 49 Hình 3.23: Phổ DEPT hợp chất B Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 50 KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần dịch chiết thể nấm Phellinus pini thuộc họ Hymenochaetaceae Việt Nam thu đƣợc số kết nhƣ sau: Mẫu nấm Thƣợng hoàng (Phellinus pini) (5,0 kg) phơi khô, nghiền nhỏ ngâm chiết với metanol (20L x 3) nhiệt độ phòng, thu dịch chiết cất thu hồi dung môi dƣới áp suất thấp đƣợc cao metanol (580,0 g) Phân bố dịch chiết vào nƣớc (1L) chiết hexan (1L x 5), etyl axetat (1L x 5) butanol (1Lx5), sau cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao hexan (54,0 g), cao etyl axetat (170,0 g), cao butanol (89,0 g) dịch nƣớc Từ cao hexan sử dụng phƣơng pháp sắc kí nhƣ: sắc ký cột, sắc ký mỏng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn thu đƣợc chất A (12,7 mg)và chất B (89 mg) Sử dụng phƣơng pháp phổ đại: phổ hồng ngoại IR, phổ tử ngoại (UV), phổ khối lƣợng (EI-MS, HR-ESI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1HNMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC HSQC để xác định cấu trúc hợp chất tách đƣợc Các kết phổ xác định đƣợc: chất A Gilvsin A chất B Ergosta-7,22-dien-3-ol Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Nguyễn Tập, Phạm Văn Hiển, Trần Toàn, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Kim Mãn, Nguyễn Thƣợng Dong, Đoàn Thị Nhu, Phạm Duy Mai, Đỗ Trung Đàm, Bùi Xuân Chƣơng, Đặng Quang Chung (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam – Tập II, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Đỗ Tất Lợi, Lê Duy Thắng Trần Văn Luyến, (1994), Nấm Linh Chi – Nuôi trồng sử dụng, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Ngô Anh (1999), “Nghiên cứu họ nấm Linh Chi (Ganodermataceae Donk) Thừa Thiên Huế”, Báo cáo khoa học – Proceedings Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà Nội, tr 1043 – 1049 Ngô Anh (2003), Nghiên cứu thành phần loài nấm Thừa Thiên Huế, Luận án Tiến sĩ khoa học Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội Ngô Anh, Trần Đình Hùng, Nguyễn Thị Đoan Trang, Nguyễn Thị Bảo Trang, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, (2008), Tạp chí khoa học, Đại học Huế, Số 48 Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) (2003) Danh mục lồi thực vật Việt Nam Nhà xuất Nơng Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thƣợng Dong ngƣời khác (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dƣợc, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Trịnh Tam Kiệt (2012) tập II, Nấm lớn Việt Nam, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 52 Tiếng Anh Alves RRN, Rosa IML., (2007), Biodiversity, traditional medicine and public health: where they meet? J Ethnobiol Ethnomed;3:14-22 10 Bai D Traditional Chinese medicines and new drug development, Pure Appl Chem 1993;65:1103-12 11 Chang HY, Sheu MJ, Yang CH, Lu TC, Chang YS, Peng WH, et al, (2011), Analgesic effects and the mechanisms of anti – inflammation of hispolon in mice, Evid Based Complement Alternat Med, 2011: 478264 12 Cho JY, Kwon YJ, Sohn MJ, Seok SJ, Kim WG, (2011), Phellinstatin, a new inhibitor of enoyl – ACP reductase producted by the medicinal fungus Phellinus linteus, Bioorg Med Chem Lett, 21: 1716 – 13 Donatini B Basics on mycotherapy: preliminary concepts on the medicinal use of mycelia Phytotherapie 2010;8:191e7 in French 14 Fabricant DS, Farnsworth NR, 2001, The value of plants used in traditional medicine for drug discovery, Environ Health Perspect;109:69e75 15 Hawksworth D.L., (2001), The magnitude of fungal deversity, the 1.5 millions species estimate revisited, Myco Res., 105, pp: 1422 – 1432 16 Hawksworth D.L., (2004), Fungal diversity and its implication fo genetic resource collections, Stud Mycol., 50, pp: – 18 17 Huang GJ, Yang CM, Chang YS, Amagaya S, Wang HC, Hou WC, et al, (2010), Hispolon suppresses SK – Hep1 human hepatoma cell metastasis by inhibiting matrix metalloproteinase – 2/9 and urokinase – plasminogen activator through the PI3K/Akt and ERK signaling pathways, J Agric Food Chem, 58: 9468 – 75 18 Jang JS, Lee JS, Lee JH, Kwon DS, Lee KE, Lee SY, et al, (2010) Hispidin produced from Phellinus linteus protects pancreatic b-cells from damageby hydrogenperoxide, ArchPharm Res;33:853-61 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 53 19 Jung JY, Lee IK, Seok SJ, Lee HJ, Kim YH, Yun BS, (2008), Antioxidant polyphenols from the mycelia culture of the medicinal fungy Inonotus xeranticus and Phellinus linteus, J Appl Micribiol; 104: 1824 – 32 20 Jang JS, Lee JS, Lee JH, Kwon DS, Lee KE, Lee SY, et al, (2010), Hispidin produced from Phellius linteus protects panceratic β- cells from damage by hydrogen peroxide, Arch Pharm Res; 33:853 – 61 21 Kang HS, Choi JH, Cho WK, Park JC, Choi JS, (2004), A sphingolipid and tryrosinase inhibitors from the fruiting body of Phellius linteus, Arch Pharm Res, 27: 742 – 50 22 Kirk P M., Cannon P F., David J.C, Stalpers J A., (2001), Anisworth and Bisby’s Dictionary of Fungy, 9th edn, CABI, Walling fird, UK, pp: 1-655 23 Kojima K, Ohno T, Inoue M, Mizukami H, Nagatsu A, (2008), Phellifruropyranone A, a new furopyranone compound isolated from fruit bodies of wild Phellinus linteus, Chem Pharm Bull, 56: 173 – 24 11 Lee IK, Yun BS, (2007), Highly oxygenated and unsaturated metabolites providing a diversity of hispidin chass antioxidants in the medicinal mushroom Inonotus and Phellinus, Bioor Med Chem, 15: 3309 – 14 25 Lee IK, Yun BS., (2011), Styrylpyrone-class compounds from medicinal fungi Phellinus and Inonotus spp., and their medicinal importance, J Antibiot;64:349-59 26 Lee IK, Yun BS, (2011), Styrylpurone – class compounds from medicinal fungi Inonotus spp and Phellinus and their medicinal importance, J antibiot, 64: 349 - 59 27 Lee YS, Kang YH, Jung JY, Kang IJ, Han SN, Chung JS, et al, (2008), Inhibitory constituents of aldose reductase in the fruiting body of Phellinus lintes, Biol Pharm Bull, 31: 765 – Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 54 28 Lee YS, Yang YH, Jung JY, Lee S, Ohuchi K, Shin KH, et al, (2008), Protein glycation inhibitors from the fruiting body of Phellinus linteus, Boil Pharm Bull; 31: 1968 – 72 29 Lu Tl, Huang GJ, Lu TJ, Wu JB, Wu CH, Yang Tc, et al, (2009), Hispolon from Phellinus linteus has antiproliferative effects via MDM2 – recruited ERK ½ activity in breast and bladder cancer cells, Food Chem Toxicol, 47: 2013 – 21 30 Lu, W.; Adachi, I.; Kano, K.; Yasuta, A.; Toriizuka, K.; Ueno, M.; Horikoshi, I., (1985), Platelet aggregation potentiators from Cho-Rei Chem Pharm Bull 33, 5083–5087 31 16 Min BS, Yun BS, Lee HK, Jung HJ, Jung HA, Choi JS, (2006), Two novel furan derivatuves from Phellinus linteus with anticomplement activity, Bioorf Med Chem Lett; 16: 3255 – 32 Mi – Yae Shon, Tae – Hun Kim, Nak – Ju Sung, (2003), Antioxidants and free radical scaveging activity of Phellius baumii (Phellius of Hymenochaetaceace) extracts, Food Chemistry, pp: 593 – 597 33 Nagatsu A, Itah S, Tanaka R, Kato S, Haruma M, Kishimoto K, et al, (2004), Identification of novel substituted fused aromatic compounds, meshimakobnol A and B from natural Phellius linteus fruit body, Tetrahedron Lett; 45: 5931 – 34 Park IH, Jeon SY, Lee HJ, Kim SI, Song KS, (2004), A β-secretase (BACE1) inhibitor hispidin from the mycelia cultures of Phellinus linteus, Planta Med; 70: 143 – 35 Pei – Wei Hsieh, Jin – Bin Wu, Yang – Chang Wu, (2013), Chemistry and biology of Phellinus linteus, Biomedicine 3, pp: 106 – 113 36 Ramberg JE, Nelson ED, Sinnott RA, (2010), Immunomodulatory dietary polysaccharides: a systematic review of the literature, Nutr J;9:54-75 37 Rathee S, Rathee D, Rathee D, Vikash K, Rathee P., (2012), Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn