đặt vấn đề Hiện nớc ta, việc nghiên cứu sinh dợc học dợc động học thuốc lĩnh vực tơng đối mới, ngày đợc quan tâm Trong đó, nớc khác, tiêu chí bắt buộc hÃng Dợc phẩm phải làm muốn đa thuốc thị trờng Một vấn đề đánh giá sinh dợc học thuốc mức độ hấp thu thuốc nồng độ thuốc đạt đợc huyết tơng Các phơng pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc huyết tơng (dịch sinh vật) sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC ), sắc ký khí (GC), sắc ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện di mao quản Trong đó, HPLC đặc biệt HPLC pha đảo với detector UV phơng pháp hayđợc dùng cả, tinh u việt trội độ nhạy, tính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế Để có qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc dịch sinh vật, khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp nh cột; dung môi pha động; lu lợng dòng; bớc sóng quy trình xử lý mẫu, khoản nồng độ khảo sát Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - lµ thuèc chống viêm phi steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế trình tổng hợp prostaglandin leukotrien; Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng ức chế kết dính tiểu cầu đợc dùng nhiều điều trị thấp khớp mÃn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp nặng Ketoprofen thuốc đợc đa vào sản xuất ë níc ta vµ cha cã tµi liƯu níc đánh giá định lợng ketoprofen huyết tơng Do thực đề tài Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng với mục tiêu: -Khảo sát lựa chọn dung môi chiÕt ketoprofen hut t¬ng cho hiƯu xt chiÕt cao -Khảo sát tìm điều kiện sắc ký thích hợp để định lợng ketoprofen huyết tơng -Xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng HPLC -áp dụng định lợng ketoprofen huyết tơng ngời sau uống thuốc theo dõi độ ổn định ketoprofen theo thời gian bảo quản Phần i: tổng quan 1.1 Đại cơng Ketoprofen 1.1.1 Công thức tính chÊt lý ho¸[1] [ 5] CH3 CH – COOH Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơngC O - Phân tử lợng : 254.29 - Tªn khoa häc :acid ( - benzoyl phenyl ) propionic - Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi Thực tế không tan nớc 200C, tan hoàn toàn kiềm mạnh, ethanol 960, aceton cloroform ether pKa =5,94 hỗn hợp methanol - nớc (3 : 1) Cực đại hấp thụ methanol bớc sóng 255 nm Nhiệt độ nóng chảy khoảng 950C 1.1.2 Tác dụng dợc lý dợc động học [5] [6] Ketoprofen thuốc chống viêm phi steroid, thuộc dẫn chất acid aryl propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm Ketoprofen ức chế trình tổng hợp prostaglandin ức chế kết tập tiểu cầu Ketoprofen đợc hấp thu nhanh vào máu , đạt nồng độ tối đa sau 45 - 60 phút đặt hậu môn 60- 90 phút sau uống Liên kết với protein huyết tơng 99%, thời gian bán thải 1,5-2,5 giê Sau uèng giê nång ®é ketoprofen bao hoạt dịch cao máu Thuốc qua đợc hàng rào thai Một phần nhỏ chuyển hoá cách hydroxyl hoá, phần lớn liên hợp với acid glucuronic Thải trừ chủ Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng yếu qua níc tiĨu (75- 90%), mét Ýt qua ph©n( 1-8% ) nớc tiểu ( 65-75%) dạng glucuronyl, 1% dạng cha biến đổi Sau uống ketoprofen bị thải trừ 50% qua thận 1.1.3 Chỉ định [5] [6]: Ketoprofen đợc định điều trị dài hạn triệu chứng trong: - Viêm thấp khớp mÃn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, viêm cứng khớp cột sống - Bệnh cứng khớp gây đau tàn phế Điều trị ngắn hạn triệu chứng cấp tính bệnh: - Bệnh thấp khớp khớp (đau vai cấp tính, viêm gân ) - Viêm khớp vi tinh thể - Thoái hoá khớp - Dạng viên nang dùng để giảm đau: ®au lng, ®au rƠ thÇn kinh 1.1.4 Chèng chØ định [6]: - Dị ứng với ketoprofen, aspirin, thuốc chống viêm phi steroid loại - Loét dày-tá tràng tiến triển - Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng - Phụ nữ có thai( tháng cuối) cho bú Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng 1.1.5 Tác dụng không mong muốn [6] - Tác dụng phụ đờng tiêu hoá: khó chịu vùng dàyruột, đau dày, buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng loét dày, xuất huyết tiêu hoá, thủng ruột - Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ - Phản ứng mẫn da( ban, mề đay, ngứa) đờng hô hấp (suyễn, ngời dị ứng với aspirin kháng viêm không steroid khác) - Giảm nhẹ hồng cầu ngời bị thiếu máu, vài trờng hợp giảm bạch cầu nhẹ đà đợc ghi nhận 1.1.6 Liều dùng: Liều khởi đầu: 300 mg chia làm lần, uống no Liều trì: 150-200mg nạp ngày 1-2 viên thuốc đạn Tiêm bắp ngày100-200mg chia lần Không nên phối hợp Ketoprofen với thuốc chống đông máu đờng uống kháng viêm không steroid khác (kể salicylat liều cao) làm tăng nguy loét xuất huyết tiêu hoá 1.1.7 Dạng bào chế [5] [6] - Viên nang 25mg, 50mg, 75mg - Viªn nÐn 100mg, 150mg - ViÕn bao tan ë ruột 50mg - Viên bao tác dụng kéo dài 200mg, viên nang tác dụng kéo dài 100mg, 150mg, 200mg - Thuốc tiêm 100mg Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng - Thuốc mỡ 2,5% BiƯt dỵc: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron… 1.1.8 Các phơng pháp định lợng A Phơng pháp acid- bazơ: Định lợng ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tơng đơng thị đỏ phenol [18] phơng pháp ®o ®iƯn thÕ [ 10] [18] TiÕn hµnh: Hoµ tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân xác) vào 25ml alcol Thêm 25ml nớc vài giọt đỏ phenol Chuẩn độ với NaOH 0,1N Song song làm mẫu trắng điều kiện 1ml NaOH 0,1N tơng đơng với 25,43mg C16H14O3 - Hoặc: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân xác) vào 25ml alcol Thêm 25ml nớc Chuẩn độ với NaOH 0,1N, xác định điểm tơng đơng bớc nhảy ®iƯn thÕ 1ml NaOH 0,1N t¬ng ®¬ng víi 25,43mg C16H14O3 B Phơng pháp quang phổ [7] [8][10]: Dùng để định lợng ketoprofen chế phẩm Hoà lợng chế phẩm có chứa khoảng 50 mg ketoprofen (cân xác) 300 ml methanol 75 %, lắc 10 phút, thêm methanol 75 % võa ®đ 500 ml Läc LÊy ml dịch lọc pha loÃng thành 100 ml với methanol 75 % đem đo độ hấp thụ dung dich bớc sóng 258nm; Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng cuvet thạch anh có chiều dày cm với mẫu trắng methanol 75% Tính kết dựa vào A (1%, 1cm) bớc sóng 258 nm 662 C Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC ) Dùng để định lợng ketoprofen huyết tơng xác định tạp chất nguyên liệu st tài pha động t liƯu [10] [18] §Ưm phosphat pH 3,5 - ACN - H2O (2:43:55) [10] NH4CH3COO 1% MeOH - ACN (55:30:15) [13] §Ưm phosphat pH 3,2 - ACN (60:40) [12] [11] [16] cét C18 5m 150*4,6 mm C18 5m 200*4,6 mm C18 2m 250*4,6 mm NH4CH3COO 20 C18 m mM - MeOH; ®iỊu chØnh pH 7,0 ACN : AcOH 1% C18 10m ( 38 : 62 ) 3,9*300 mm mÉu thư Nguyªn liƯu Nguyªn liệu Huyết tơng Huyết tơng Huyết tơng Đệm Phosphat C18 m HuyÕt t¬ng 0,05M pH : 4,6*250m ACN (90 : 10 ) m D Phơng pháp điện di mao quản: Định lợng ketoprofen huyết tơng [14] tách đồng phân ketoprofen [17] 1.2 Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC ) Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng Sắc ký lỏng hiệu cao ( High Performance Liquid Chromatography ) gọi sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng đại đời vào năm cuối 1960 Nó đợc xây dựng phát triển không ngừng ngày thể rõ tính u việt, đặc biệt lĩnh vực nghiên cứu sinh dợc học thuốc Phân loại phơng pháp sắc ký [ 2]: - Sắc ký phân bố : + sắc ký lỏng- lỏng +sắc ký phân bố pha liên kết - Sắc ký hấp phụ hiệu cao - Sắc ký trao đổi ion hiệu cao - Sắc ký lỏng hiệu cao gel ( sắc ký theo loại cỡ ) Trong phân tích sinh dợc học kiểm nghiệm, ngời ta hay sử dụng phơng pháp sắc ký lỏng phân bố pha liên kết (Bonded Phase Chromatography ) Đặc điểm phơng pháp [2]: Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh đợc gắn hoá học (liên kết ) với chất mang ( Silicagel ) tạo nên hợp chất Siloxan Si CH3 H3C CH3 CH3 OH + Cl Si CH3 R Si O H3C CH3 Si R CH3 Nghiªn cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết t¬ng Nhãm Silanol DÉn chÊt DÉn chÊt Siloxan cđa Silicagel clorosilan - Nếu R nhóm phân cực nh octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl dung môi phân cực nh methanol, acetonitril có sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngợc ) - Nếu R nhóm phân cực nh: alkylamin - ( CH2- )n-NH2 hay alkyl nitril -( - CH2- )n- CN vµ dung môi phân cực nh hexan ta có sắc ký pha thuËn - C¸ch chän pha: thêng chän pha tĩnh có tính chất phân cực giống chất cần tách khác với pha động Nguyên tắc phơng pháp [2] [3]: Các chất hỗn hợp đợc tách dựa khả phân bố khác chúng vào hai pha không hoà lẫn vào nhau, tiếp xúc nhau: pha tĩnh pha động Dung dịch mẫu thử đợc đa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm mẫu đợc dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ bơm cao áp Tại cột xảy trình tách, phân tử có lực thấp với pha tĩnh đợc rửa giải trớc, phân tử có lực mạnh với pha tĩnh đợc rửa giải sau Chất khỏi cột đợc phát detector gắn với máy ghi, máy tính hay máy tích phân Thời gian lu tR đặc trng định tÝnh cđa chÊt, chiỊu cao hay diƯn tÝch pic lµ đặc trng định lợng chất Sắc ký đợc tiến hành so với chuẩn Một số thông số đặc trng HPLC [2]: Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng Ví dụ: Ta có sắc đồ sau: - Thời gian lu tR ( phút ) thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất ®Ønh cđa pic So s¸nh thêi gian lu cđa mÉu thử mẫu chuẩn làm điều kiện ta định tính đợc chất - Thời gian chết tM ( ) lµ thêi gian cđa mét chÊt không bị lu giữ độ di chuyển trung bình phân tử dung môi - Thời gian lu hiệu tR, đợc tính theo công thøc: tR = tR, + tM ( hay tR, = tR - tM ) - Thõa sè dung lỵng k’ dùng để mô tả tốc độ di chuyển chÊt Qs t’R tR - tM VR -VM k’ = = = = QM tM tM VM - Thõa sè chọn lọc : Mô tả tốc độ di chuyển tû ®èi cđa hai chÊt kB k’B t’R,B = = = kA kA tR,A Qui ớc B chất bị lu giữ mạnh A nên Để tách riêng chất > 1, thờng từ 1,05 2,00 -Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột sắc ký 10 Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen huyết tơng