Kiểm Nghiệm Thú Sản.doc

1 BỘ GIÁO DỤC VÀO ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNP TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP – PHÂN HIỆU ĐỒNG NAI TIỂU LUẬN Kiểm nghiệm thú sản Kiểm tra dư lượng Bê ta Agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thịt heo[.]

1 BỘ GIÁO DỤC VÀO ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNP TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP – PHÂN HIỆU ĐỒNG NAI TIỂU LUẬN Kiểm nghiệm thú sản Kiểm tra dư lượng Bê ta-Agonist (clenbuterol salbutamol) thịt heo Ngành: Thú Y Lớp: K64b Khoa: Nông học Họ tên: H Lin Kđoh MỤC LỤC Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích chủ đề Nội dung .2 2.1 Tổng quan clenbuterol salbutamol 2.1.1 Khái quát họ Bêta-agonist 2.1.2 Cơ chế tác động nhóm Bêta-angonist .2 2.1.3 Giới thiệu clenbuterol salbutamol 2.1.4 Tác dụng clenbuterol salbutamol 2.1.5 Tác hại clenbuterol salbutamol 2.1.6 Giới hạn cho phép dư lượng clenbuterol salbutamol 2.1.7 Những dấu hiệu nhận biết thịt heo có chứa clenbuterol salbutamol 2.2 Một số phương pháp xác định hàm lượng clenbuterol salbutamol .7 2.2.1 Phương pháp Elisa (ENZYM-LINK IMUNOSORRBENT ASSAY) .7 2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 2.2.3 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS .9 2.3 Thực Nghiệm 10 Tổng quát 10 Tài liệu tham khảo .10 CHỮ KÍ HIỆU p.a : pure analysis DANH MỤC BẢNG BẢNG 1: Danh pháp, cơng thức cấu tạo, tính chất vật lí clenbuterol salbutamol DANH MỤC HÌNH HÌNH 1-1: Sự nguy hiểm chất tạo nạc thịt lợn HÌNH 1-2: Một số cách nhận biết thịt heo nuôi chất cấm Hình 1-3: Cách nhận biết thịt lợn có chứa chất tạo nạc HÌNH 1-4: So sánh heo có sử dụng chất tạo nạc không sử dụng chất tạo nạc 1 Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Gần đây, với phát triển vượt bậc nên kinh tế, ngành chăn ni Việt Nam có bước phát triển mạnh mẽ, tién khoa học kỹ thuật đưa vào ứng dụng thực tiễn sản xuất khâu cải tạo giống, nâng cao chất lượng thức ăn đến việc hồn thành quy trình chăm sóc nuôi dưỡng nhằm đáp ứng nhu cầu thực phẩm ngày cao xã hội, góp phần khơng nhỏ cho kinh tế nước nhà Các sản phẩm động vật thịt, trứng, sữa, đáp ứng nhu cầu nước mà bước chiếm lĩnh thị trường vươn xa giới Tuy nhiên, việc kiểm sốt tình hình lạm dụng hố chất chăn ni cịn chưa chặt chẽ, nên gây ô nhiễm động vật, ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ cho người tiêu dùng Tình trạng lạm dụng chất kích thích tăng trưởng chăn ni phổ biến, điển hình Clenbuterol Salbutamol Đây hố chất thuộc nhóm Beta Agonist Chất trộn vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm kích thích tăng trọng, tăng tỉ lệ nạc, giảm mỡ thu nhiều lợi nhuận Tuy nhiên ăn phải thực phẩm có tồn dư Clenbuterol Salbutamol gây ảnh hưởng đến người tiêu dùng rối loạn nhịp tim, đau tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, choáng váng, run cơ, phù nề Ngày 20 tháng 06 năm 2002 Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn Việt Nam ban hành danh mục 18 kháng sinh hoá chất cấm chăn ni (quyết định số 54/2002/QĐBNN) có Clenbuterol Salbutamol Thế việc sử dụng bất hợp pháp loại chất thị trường chăn ni Việt Nam Vì việc áp dụng phương pháp tiến tiến để phân tích xác định, đánh giá dư lượng chất kích thích tăng trưởng nói chung Clenbuterol, Salbutamol nói riêng cần thiết 1.2 Mục đích chủ đề Xây dựng phương pháp phân tích dư lượng Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn nuôi kỹ thuật ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy độ chọn lọc cao, đáp ứng nhu cầu phân tích đơn vị kiểm nghiệm nước theo dõi mức tồn dư Clenbuterol Salbutamol thực phẩm heo Mẫu thịt dùng cho điều tra lấy số chợ thị trường Thành Phố Cần Thơ Đồng thời, giúp người tiêu dùng biết tác hại sản phẩm chế biến từ thịt heo có chứa Clenbuterol Salbutamol 2 Nội dung 2.1 Tổng quan clenbuterol salbutamol 2.1.1 Khái quát họ Bêta-agonist Họ bêta-agonist hay gọi chất tăng trọng, chất tạo nạc loại hooc mơn thích tăng trưởng Họ bêta-agonist gồm nhóm Nhóm bêta1-agonist, gồm chất có tác dụng kích thích tim dùng để điều trị sốc tim, suy tim cấp dobutamine, isoproternol, xamoterol, epine Nhóm bêta2-agonist, gppmf chất làm giãn cơ, dùng để điều trị hen xuyễn, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính như: (allbuterol), clenbuterol, isoprorenol, clenbutaline, fenoterol, cinaterol, ractopamine… chất kể salbutamol, clenbuterol ractopamine ba chất đứng đầu danh mục 18 chất kháng sinh, hố chất bị cấm sử dụng chăn ni 2.1.2 Cơ chế tác động nhóm Bêta-angonist  Ở người: Chất Beta-agonist đưa vào thể kích hoạt thụ thể betaadrenergic dẫn đến giãn nở trơn phổi từ làm giãn nở mở rộng đường hô hấp Thụ thể beta-adrenergic gắn với protein G kích thích adenylyl cyclase Enzyme tạo thơng tín viên thứ hai AMP vòng Trong phổi, AMP vòng vừa làm giảm nồng độ canxi tế bào vừa kích hoạt protein kinase A Cả hai điều làm bất hoạt myosin kinase đồng thời hoạt hóa myosin phosphatase Ngồi ra, chất beta-agonist hoạt hóa mở rộng kênh canxi kali từ làm giãn nở tế bào trơn đường hô hấp Sự kết hợp việc giảm canxi nội bào, gia tăng kali màng dẫn điện, giảm hoạt hóa myosin kinase dẫn đến giãn trơn giãn nở phế quản phổi làm cho người bệnh hen suyển dễ thở  Ở gia súc: Ngoài chế tác động vừa nêu trên, cịn có tác động làm tăng độ lớn sợi tiêu biến mỡ gia súc theo chế sau: + Khi beta-agonist kết dính vào thụ thể beta-adrenergic tế bào mỡ, chúng làm hoạt hóa số enzyme, từ làm giảm tổng hợp tích lũy mơ mỡ bên tế bào Ngồi cịn huy động mơ mỡ tế bào để phân giải mỡ nhằm cung cấp lượng cho thể đưa đến kết tỷ lệ mỡ tích lũy thể gia súc + Đối với mơ có chứa thụ thể beta-adrenergic bề mặt Sự tương tác beta-agonist với thụ thể beta-adrenergic làm gia tăng tổng hợp axit ribonucleic (ARN), từ làm gia tăng tổng hợp protein tế bào Kết làm gia tăng kích thước tế bào + Sự tăng trưởng xảy cách gia tăng chiều dài độ lớn sợi cách nhanh chóng (siêu nạc) khơng gia tăng số lượng tế bào Tuy nhiên gia tăng có hạn theo thời gian khơng thể sử dụng kéo dài làm cho gia súc chết 3 2.1.3 Giới thiệu clenbuterol salbutamol BẢNG 1: Danh pháp, cơng thức cấu tạo, tính chất vật lí clenbuterol salbutamol Tên gọi CTPT CTCT Tính chất vật lí Clenbuterol 1-(4-amino-dichlorophenyl)-2(tert-butylamino)ethanol C12H18Cl2ON2 (276,0796 đvC) Salbutamol 4-[2-(tert-butylamino)-1-hydroxyethyl] -2-(hydroxymethyl]phenol C13H21O3N (239,15 đvC) Điểm nóng chảy: 174-175,5 độ C Chất bột màu trắng, tan H2O, C2H5OH, CH3OH, CHCI3, không tan benzen Điểm nóng chảy: 157-158 độ C Chất bột màu trắng, tan H2O, C2H5OH, CH3OH, tan CHCI3, không tan benzen 2.1.4 Tác dụng clenbuterol salbutamol  Trong y học: Clenbuterol có tác dụng làm giảm phế quản, điều trị hen sử dụng bệnh nhân có bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính, dùng cho người chúng có tên biệt dược broncodil, clenbutol, ventolax, protovent… nhiên, clenbuterol gây tổn hại đến hệ thần kinh tuần hoàn người Salbuamol hấp thụ dễ dàng qua đường tiêu hoá, loại thuốc sử dụng nhiều khoa hô hấp như: cắt hen, giãn phế quản, giãn trơn, viêm phế quản mãn tính Trong sản khoa, thuốc sử dụng với định chuyển sớm khơng có biến chứng xảy tuần 24-33 thai kỳ, làm chậm thời gian, có tác dụng phát triển thai nhi Trên thị trường, thuốc có hoạt chất sabultamol có nhiều dạng bào chế viên nén, thuốc tiêm, thuốc đặt trực tràng, hậu mơn, thuốc hít  Trong thú y: Clenbuterol sử dụng để điều trị bệnh dị ứng đường hô hấp ngựa (tên thương mại ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp trâu, bị,…thuốc thải qua đường tiểu qua phân với thời gian dài  Trong chăn nuôi: clenbuterol salbutamol điều tiết sinh trưởng động vật, thúc đẩy trình phát triển bắp, nở mông, nở vai làm tăng lượng thịt nạc đẩy nhanh việc phân giải mỡ, giảm tối đa lượng mỡ hình thành nhằm tạo vật ni siêu nạc, mau lớn dùng liều khiến thể vật ni mang bệnh tử vong 2.1.5 Tác hại clenbuterol salbutamol  Tác hại chăn nuôi: Khi sử dụng chất cấm chăn ni lợn, tính từ ngày thứ sau sử dụng lợn bắt đầu có dấu hiệu thay đổi Từ ngày thứ lợn di chuyển thường nằm ngủ li bì Sau ngày thứ 10 lợn bắt đầu ăn đâu nằm kèm chân đứng không vững Thường khoảng sau 15 ngày sử dụng phải xuất bán nguy gẫy chân cao Tuy nhiên kết nhận lợn khơng nở mơng vai siêu nạc mà cịn cho kết tăng trọng cao từ 15-20%  Tác hại người: Tác dụng chất β2-agonist người sử dụng sản phẩm chất tồn dư lại sản phẩm thực phẩm gây tác hại lớn cho người sử dụng như: + Ngộ độc cấp tính: Xảy người sử dụng sản phẩm có hàm lượng cao chất β2-agonist Rối loạn nhịp tim, run cơ, co thắt phế quản, tăng huyết áp, nguy sẩy thai,… + Ngộ độc mãn tính: Khi người sử dụng thực phẩm chứa hóa chất tăng trưởng thời gian dài gây nhiễm độc gan,…Có thể dẫn đến rối loạn hệ thống hormon thể HÌNH 1-1: Sự nguy hiểm chất tạo nạc thịt lợn 2.1.6 Giới hạn cho phép dư lượng clenbuterol salbutamol Châu Âu: MRL clenbuterol 0,1 ppb (thịt) 0,5 ppb (gan) Codex Alimentarius: MRL clenbuterol 0.2 ppb (thịt) 0,6 ppb (gan) Việt Nam, bêta-agonist tuyệt đối bị cấm sử dụng thức ăn chăn ni khơng có thịt gia súc, gia cầm 2.1.7 Những dấu hiệu nhận biết thịt heo có chứa clenbuterol salbutamol HÌNH 1-2: Một số cách nhận biết thịt heo ni chất cấm Hình 1-3: Cách nhận biết thịt lợn có chứa chất tạo nạc HÌNH 1-4: So sánh heo có sử dụng chất tạo nạc khơng sử dụng chất tạo nạc 2.2 Một số phương pháp xác định hàm lượng clenbuterol salbutamol 2.2.1 Phương pháp Elisa (ENZYM-LINK IMUNOSORRBENT ASSAY) Phương pháp dùng rộng rãi để xác định chất dư lượng thuốc trừ sâu, độc tố nấm mốc (Skeritt, 1998) Nguyên lý ELISA xác định Clenbuterol Salbutamol dựa nguyên lý phản ứng kháng thể - kháng nguyên Phương pháp ELISA thường áp dụng để chế tạo test nhanh Clenbuterol Salbutamol thị trường ngày Nguyên lý Elisa: kháng nguyên cố định bề mặt giêng phân tích Kháng ngyên tự (Chất phân tích) kháng nguyên cố định cạnh tranh để bám vào kháng thể Lượng kháng nguyên tự nhiều lượng kháng thể bị kháng nguyên cố định giữ lại Sau rửa trơi chất cịn dư, dùng lượng kháng thể thứ có đánh dấu enzyme immunoassay để phát lượng kháng thể ban đầu bị giữ lại phản ứng tạo màu tỷ lệ nghịch với nồng độ màu bước sóng 450nm cường độ màu tỷ lệ nghich với Clenbuterol Salbutamol mẫu Từ suy lượng kháng nguyên tự (Chất phân tích) 7 Kỹ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng dộ thấp giới hạn phát phương pháp 0.1 ppb 2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ Xác định β2-agonist thịt heo, sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với sắc ký lỏng ghép khối phổ Phương pháp xác định đồng thời dư lượng bốn β2-agonist: terbutaline, salbutamolclenbuterol formoterol thịt heo Các chất phân tích tinh chế kỹ thuật chiết lỏng-lỏng (LLE) chiết pha rắn (SPE) định lượng sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-ESI-MS/MS).Phương pháp cung cấp giới hạn phát (LOD)nhỏ ng/g Các phạm vi hiệu chuẩn cho hợp chất thu từ 0,25 đến ng/g Độ thu hồi nằm khoảng từ 78 đến 101% với giá trị RSD 1,8 7,2% Thiết bị  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao HPLC 1200  Hệ thống sắc ký tố lỏng ghép hai lần khối phổ đầu dò tứ cực (Agilent 6460 Triple quad LC-MS/MS)  Cột Agilent SamliQ SCX Polymer, 50x3 ml, 60mg (p/n: 5928-3236)  Cột C18 Agilent ZORBAX Eclipse, 50x2.1 mm, 1,8 mm (p/n: 959,741-906)  Hệ thống hút chân không Manifold (p/n: 5982-9120) Chuẩn bị mẫu kỹ thuật chiết lỏng lỏng Xay mẫu sinh tố Cân 2g thịt heo (± 0,01g) cho vào ống mũ 15ml Thêm vào ml sodium acetate 0,2 M (pH=5,2) vortex, thêm tiếp 100 μll β-Glucuronidase, vortex phút Thuỷ phân 37°C 16 Lắc 15 phút Ly tâm 4000 rpm 10 phút Lấy ml lớp cho vào ống ly tâm Thêm ml axit percloiric 0,1 M pH=1 (± 0,3) Ly tâm 4000 rpm 10 phút Lấy lớp cho vào ống ly tâm khác Điều chỉnh pH đến 11 sodium hydroxide 10 M Thêm vào 10 ml dung dịch natri clỏua bão hoà isopropanol-ethyl acetat (60:40) Lắc phút Ly tâm 4000 rpm phút, lấy lớp cho vào ống ly tâm khác, lặp lại bước Thổi thổ khí nitơ 40oC, hồ tan lại mẫu ml sodium acetate 0,2M (pH=5,2) Kỹ thuật chiết pha rắn Hoạt hoá cột SPE với ml methanol sau cân với ml nước cho qua cột ml dung dịch mẫu sau rửa cột ml nước 2% Tồn nước thải loại bỏ Hút chân khoong phút khô cột Cuối rửa giải với 5ml dung dịch amoniac 5% methanol Sau thổi khơ khí nitơ 40 độ C Mẫu hoà tab lại ml acid fomic 0.1 % H20/Acetonitrile (90:10, sau vortex đánh siêu âm, cho vào ống 1,5 ml ly tam 3000 rpm phút Cuối cho vào vial 2ml để phân tích Điều kiện HPLC  Cột Agilent ZORBAX Eclípe Plus C18 2,1 mm x 50 mm; 1,8 mm (p/n: 969.741-906)  Tốc độ dòng: 0,4 ml/min, cột nhiệt độ 40 độ C  Pha động: nước (0,1% acid fomic Mm CH3COONH4, A), acetonitrile (0,1% acid fomic, B)  Nồng độ: Thời gian (phút) A (%) B (%) 90 10 0,5 90 10 1,8 20 80 90 10 3,5 90 10 Điều kiện vận hành hệ thống khối phổ - Nguồn taoh ion : ESI+4000V - Áp suất dong khí nitơ cho hệ phun sương (Nebulizer): 45psi - Thế áp vào ống mao quản (Capillảy): 4000V - Nhiệt độ dịng khí (Gas temp): 325 đọ C - Tốc độ dịng khí (Gas flow): l/min - Chọn chế độ quét phổ MRM Ion định lượng Ion định tính Terbutaline 226,1→152,1 226,1→125 Salbutamol 240,1→148,1 240,1→222,1 Clenbuterol 277→203 277 →259,1 Formotero 345,1→149,1 345,1→327,1 Sắc ký đồ terbutaline, salbutamol, clenbuterol, formoterol 2.2.3 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS Phương pháp xác nhận theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 2002/657/EC Hiệu suất thu hồi 68,8 % clenbuterol 69,6 % salbutamol * Chuẩn bị dung dịch mẫu Dung dịch chuẩn dùng làm khảo sát thông số: từ dung dịch chuẩn Clenbuterol Salbutamol 1000ppm, pha thành 100 ul dung lượng chuẩn Clenbuterol Salbutamol 1ppm, thêm 100 ul nội chuẩn Clenbuterol Salbutamol d 3, ml methanol, vào vial 1,5 ml Đối với mẫu: cân 10g mẫu thịt, chiết với methano; môi trường đệm acetat (pH 5,2), lắc voltex, ly tâm 2500 vòng/phút 20 độ C 15 phút, làm cách cho qua cột PCX, dung dịch rửa giải etylacetat/acetionitri/ammonium hydõi (90:10:5) Thổi khơ dung dịch chiết khí nitơ 40 độ C, hoà tan 1ml methanol, chuyển hết vào vial 1,5 ml, thêm 100 ul nội chuẩn Clenbuterol Salbutamol d3 * Khảo sát hệ thống số hệ thống GC/MS Để khảo sát thông số hệ thống, tạo dẫn xuất Clenbuterol Salbutamol với BSTFA:TMCS (99:1) môi trường dậm acetat, chiết dẫn xuất tiến hành chạy sắc ký với phương trình nhiệt chế độ chia dòng khác * Xây dựng đường chuẩn khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn Do điều kiện thí ngjiệm hạn chế (dẫn xuất dồng vị d có giá thành cao) nên đường chuẩn nồng độ Clenbuterol Salbutamol 10 ppb Bên cạch đó, Clenbuterol Salbutamol lad chất cấm, khơng có thực phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam nên để đânhs giá khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn cần khảo sát với khoảng nồng độ Clenbuterol Salbutamol < = 200 ppb * khảo sát hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu Dung dịch chuẩn ppb (pha từ dung dịch Clenbuterol Salbutamol 1000 ppm) dùng để đánh giá dộ xác đường chuẩn hiệu suất thu hồi phương pháp Để đánh giá hiệu suất thu hồi quy trình: cần 10g mẫu thịt thêm 0,1 ml dung dịch chuẩn Clenbuterol Salbutamol mẫu thêm chuẩn với dung môi trường đệm acetat Cô khơ mẫu dịng nitơ, thêm thuốc thử (BSTFA:TMCS) tạo dẫn xuất với Clenbuterol Salbutamol nội môi chuẩn Clenbuterol Salbutamol d Tiêm mẫu vào máy sắc ký với thể tích mẫu 1ul 2.3 Thực Nghiệm 10 2.3.1 Quy trình định tính, định lượng Bêta-Agonist (Clenbuterol Salbutamol) Hầu hết phương pháp phân tích sắc ký sác định lượng Clenbuterol Salbutamol trãi qua ba giai đoạn sau:  Chiết chất phân khối mẫu (mẫu nguyên liệu)  Làm mẫu, loại tạp chất khỏi dịch chiết làm giàu chất phân tích  Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích 2.3.2 Thiết bị, hố chất chất dung dịch thử - Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm: - Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm hệ thống tiêm mẫu tự động - Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai nguồn loại nguồn ion hoá ÉI APCI - Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt um, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck) - Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị xử lý liệu sắc ký 11 phân tích hàm lượng Bêta-Agonist (Clenbuterol Salbutamol) thịt heo - Hoá chất dung dịch thử - Nước cất lần thử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a; HCOOH loại HPLC K2HPO4, p.a - Dung dịch thử K2HPO4 0,1M - Dung dịch pha động: MeOH (0,1 HCOOH) H2O (0,1% HCOOH) (v/v) - Chất chuẩn nội chuẩn Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2, HCl) Clenbuterol-d9 (100 mg/l), Dr Ehrenstorfer, (C13H12O3N) ½ H2SO4 Sabutamol sulfate, Dr Ehrenstorfer, 99% (C13H19D3O3N) 2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đầu dò tứ cực - Xác định hàm lượng Bêta-Agonist theo phương pháp ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS)  Phạm vi áp dụng Xác định hàm lượng Bêta-Agonist gồm chất Clenbuterol Salbutamol Ractopamine thịt heo kỹ thuật sắc ký lỏng hai lần khối phổ Giới hạn định lượng phương pháp cho chất Clenbuterol 0,2 ug/kg, Salbutamol ug/kg Ractopamine HCl 10 ug/kg  Nguyên tắc Dư lượng Clenbuterol Salbutamol Ractopamine từ thịt heo chiết từ mẫu hỗn hợp Axetonitrile isopropanol Sử dụng muối natri clorit, natri sunphat, magie sunphat để tủa protein loại nước có dịch chiết mẫu 11 Dịch chiết mẫu làm bay dung môi đến khơ, phần cặn hồ tan dung dịch nước chứa 10% Axetonitril, làm n-hexan đưa vào phân tích kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) để xác định lượng Clenbuterol Salbutamol Ractopamine có mẫu  Thuốc thử: Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích nước cất hai lần khử ion - Chuẩn Clenbuterol HCL (CLEN.HCL), > = 98,5% - Chuẩn Salbutamol sunphat (SAL.SUL), > = 99 % - Chuẩn Ractopamine HCL (RAC.HCL), > = 98% - Nội chuẩn Clenbuterol D9 (CLEN D9), > 99% - Nội chuẩn Salbutamol D3 (SAL D3), > = 98% Phân tích hàm lượng Bêta-Agonist (Clenbuterol Salbutamol) thịt heo - Nội chuẩn Ractopamine HCL D6 (RAC D6), > 99% - Axetonitril (ACL), loại dùng cho LC-MS - Nước, loại dùng cho LC-MS - Metanol (MeOH), loại dung cho LC-MS - Isopropanol (IPA), loại dùng cho HPLC  Thiết bị dụng cụ: Sử dụng thiết bị dụng cụ phòng thử nghiệm thường thường cụ thể sau: Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS - Bơm kênh dung mơi biến đổi dịng - Đầu dị MS-MS - Máy tính phần mềm phân tích - Cột sắc ký Hypersil GOLD 18C, đường kính 2,1 mm, kích thước hạt nhồi 1,9 um, độ dài cột 100 mm - Ống ly tâm nhựa, dung tích 50ml có nắp - Ống ly tâm thuỷ tinh, dung tích 10ml - Bình định mức thuỷ tinh, dung tích 10ml, 20ml, 25ml, 50ml, 100ml, 1000ml - Pipet tự động, dung tích 50 ul, 100ul, 250ul 1000ul, 5000ul - Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 vịng/phút - Cân phân tích, có độ xác đến 0,1 mg - Bơm hút chân không - Màng lọc dung mơi, đường kính 45 mm, kích thước lỗ 0,2um, làm chất liệu dung môi hữu - Bộ lọc dung môi thuỷ tinh 12 - Máy lắc, tốc độ tối thiểu 4000 vòng/phút - Máy lắc ngang, tốc độ tối thiểu 300 vịng/phút - Lọ đựng mẫu dung tích ml - Màng lọc mẫu, đường kính 13 mm, kích thước 0,2 um, làm PTFE - Bộ hút dung môi tự động, thể tích 25ml - Bộ bay nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ - Máy xây thịt 2.3.3 Phân tích hàm lượng Bêta-Agonist (Clenbuterol Salbutamol) thịt heo  Chuẩn bị mẫu lấy mẫu - Lấy mẫu: việc lấy mãu theo TCVN 4833 – 1: 2002 (ISO 3100-1991) Mẫu phân tích phịng thử nghiệm phải mẫu đại diện khơng bị hư hỏng bị biến đổi q trình vận chuyển bảo quản - Chuẩn bị mẫu: căt thịt thành miếng nhỏ, đồng hoá mẫu cách cho mẫu qua máy xay thịt hai lần trộn, chuyển mẫu đồng sang dụng cụ đựng mẫu, đậy kín lưu trữ nhiệt độ -10 độ C Khi thực phân tích, phải đưa mẫu nhiệt độ phòng Chuẩn bị mẫu thử cân 5g mẫu đồng vào ống ly tâm 50ml cho vào 50ul dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50 mg/ml (3.3.18.9) - Chuẩn bị mẫu trắng thịt heo, xác định không nhiễm Clenbuterol Salbutamol Ractopamin.HCL - Mẫu trắng chuẩn bị mẫu thử - Chuẩn bị mẫu kiểm soát: mẫu kiểm soát chuẩn bị từ mẫu trắng, mẫu thử có bổ sung 50 ul dung dịch chuẩn hỗn hợp S2 (3.3.18.4) vào mẫu - Trộn máy lắc, sau để yên 15 phút trước tiến hành bước - Chuẩn bị mẫu xây dựng dường chuẩn, đường chuẩn xây dựng dựa mẫu trắng, cân mẫu 5g đông vào vào ống ly tâm 50ml, bổ sung 50ul dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50 ng/ml vào ống nghiệm chứa mẫu trắng, tiến hành máy lắc 15 giây, sau để yên 15 phút trước tiến hành bước  Tiến hành thử nghiệm - Chiết mẫu làm mẫu cho 1ml axetonitril, 1ml isopropanol vào ống nghiệm chứa mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn Trộn máy lắc phút tiếp theo, thêm vào ống 1,2g NaCl lắc mạnh, sau tiếp tục thêm vào ống Na2SO4 0,5g MgSO4 lắc mẫu với máy lắc, ly tâm 4000 vòng/phút Dùng pipet, chuyển ml lớp sang ống thuỷ tính sau cho bay bay N đến nhiệt độ 40độ C Kết luận Chất tăng trưởng Bêta-Agonist chất gây nguy hiểm cho sức khoẻ người, khiến thể bị nhiểm độc, gây rối loạn tiêu hố, tuần hồn, ảnh hưởng đến tính mạng việc sử dụng Clenbuterol Salbutamol nhiều người quan tâm cần có 13 nhiều biện pháp khống chế thích đáng hành vi cá nhân, tổ chức gây hại sức khoẻ cộng đồng hợp chất cấm Clenbuterol Salbutamol chăn ni gia súc Vấn đề phân tích Bêta-Agonist thịt heo cần thiết hữu ích Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ phương pháp hiệu với độ nhạy cao, độ xác cao Tài liệu tham khảo - Trần Nguyễn An Sa*, Nguyễn Trang Vi Hậu - Tạp chí Khoa học cơng nghệ thực phẩm 12 (1) (2017) 73-80 - Tạp chí điện tử (ViêtQ.vn) chất lượng Việt Nam Trang wed tham khảo - https://tincay.com/chat-cam-trong-chan-nuoi/ - https://123docz.net/document/5055627-phuong-pha-p-test-nhanh-salbutamol-trongthuc-pham.htm