Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa, độc tế bào ung thư của cây dạ cầm ( hedyotis capitellata wall ex g don, rubiaceae )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ UYÊN THANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY DẠ CẨM (Hedyotis capitellata Wall ex G Don, Rubiaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ UYÊN THANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY DẠ CẨM (Hedyotis capitellata Wall ex G Don, Rubiaceae) NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRẦN THỊ VÂN ANH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Lê Uyên Thanh TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học - Khóa 2019-2021 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY DẠ CẨM (Hedyotis capitellata Wall ex G Don, Rubiaceae) Lê Uyên Thanh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Thị Vân Anh Đặt vấn đề Dạ cẩm (Hedyotis capitellata Wall ex G Don, Rubiaceae) loài dân gian sử dụng từ lâu dùng làm thuốc trị đau dày trị loét mồm, loét miệng Các nghiên cứu Dạ cẩm cịn Đề tài thực nghiên cứu thành phần hóa thực vật Dạ cẩm tác dụng chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư Dạ cẩm, tạo sở cho việc phát triển dược liệu Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Dạ cẩm, thu hái Huế (3/2020) Chiết xuất phương pháp ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng – lỏng phương pháp sắc ký cột để phân lập Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp phổ MS, NMR Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào phương pháp MTT tế bào ung thư vú (MDA), khảo sát hoạt tính chống oxy hóa thử nghiệm DPPH Kết Phân tích sơ thành phần hóa học Dạ cẩm cho thấy có nhóm hợp chất triterpenoid, saponin, anthraquinon, coumarin, acid hữu hợp chất khử Từ 3,5 kg bột cành Dạ cẩm, chiết ngấm kiệt với cồn 96% 50% thu 1,5 lit dịch chiết đậm đặc Tiếp tục chiết phân bố lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần thu 25 g cao n-hexan, 35,43 g cao chloroform, 29,23 g cao ethyl acetat, 39,22 g cao n-butanol 228 g cao nước Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao chloroform có tác dụng kháng gây độc tế bào MDA (IC50 43,77 ± 1,27 µg/ ml), cao chloroform cao n-hexan gây độc với tế bào RD với IC50 47,66 ± 0,87, 56,00 ± 1,27 µg/ ml Cao chloroform cao ethyl acetat n-butanol cho tác dụng chống oxy hóa tốt với IC50 211,57 ± 0,28, 153,55 ± 0,92 µg/ ml 346,92± 0,43 µg/ ml Từ cao n-hexan thu hợp chất: (1) sitostenon (21 mg), (2) stigmast-4-ene-3,6-dion (14,7 mg); (3) stigmastane-3,6-dion (22,2 mg), (4) 1-ethoxy, 2methoxy anthraquinon (14,7 mg), (5) 3-ethoxy-7-ol stigmast-4-en-, (6) acetyl ursolic acid (15,6 mg), (7) acid betulonic (15 mg) Từ cao chloroform thu hợp chất xác định cấu trúc: (8) acid ursolic (71mg), (9) acid pomolic (21 mg), (10) scopoletin Kết luận Từ phân đoạn chloroform phân đoạn n-hexan có hoạt tính chống oxy hóa gây độc tế bào Dạ cẩm, đề tài phân lập 10 hợp chất gồm hợp chất sterol, triterpen, anthraquinon, coumarin Các hợp chất (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (9), (10) lần phân lập từ Dạ cẩm ABSTRACT Thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2019 – 2021 STUDY ON CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTIOXIDANT, CYTOTOXIC ACTIVITIES OF HEDY CAPITELLATA WALL EX G DON, RUBIACEAE Le Uyen Thanh Instructor: Assoc Prof Dr Tran Thi Van Anh Introduction “Dạ cẩm” (Hedyotis capitellata Wall ex G Don, Rubiaceae) has been used as a folk medicine for stomach pain and for mouth ulcers There are not many researches on this plant The object of this study is to investigate the chemical constituents and antioxidant and cytotoxic activities of Da Cam, provide the scientific evidence for the usage and development the product of this plant Methods Hedyotis capitellata was collected at Thua Thien Hue province in March 2020 Phytochemical constituents of H capitellata were analyzed by modified Ciuley method The aerial part of H capitellata were percolated with ethanol 96% and 50%, then the crude extract was separated by liquid–liquid distribution The isolation of pure compounds were conducted by column chromatography, size-exclusion chromatography, and recrystallization in suitable solvents The structures of the isolated compounds were identified by MS, NMR spectroscopy methods Investigation of cytotoxic activity by MTT method and antioxidant activity by DPPH Results Primary analysis the chemical constituents showed that H capitellata contains triterpene, saponin, anthranoid, coumarin, and polyuronic Then, 3.5 kg dried material was percolated with ethanol The crude extract was partitioned with polarity ascending solvents to get 25 g n-hexan extract, 35.43 g chloroform extract, 29.23 g ethyl acetat extract, 39.22 g n-butanol extract and 228 g water extract Chloroform fraction showed the cytotoxic activity on MDA cells (IC50 = 47.66 μg/ ml ± 0.87 µg/ ml) Chloroform, n- hexan fractions showed the cytotoxic activity on RD cells with IC50 value of 47.66 ± 0.87 µg/ ml and 56 ± 01,59 µg/ ml, respectively Chloroform, ethyl acetate and n-butanol fractions showed significant antioxidant activity with IC50 value of 211.57 ± 0,28, and 153.55 ± 0.92 µg/ ml and 346.92± 0.43, respectively From the n-hexane extract, seven compounds were isolated and identified as: (1) sitostenone (21 mg), (2) stigmast-4-ene-3,6-dione (14.7 mg); (3) stigmastane-3,6-dione (22.2 mg), (4) 1-ethoxy, 2-methoxy anthracene-9,10-dione (14.7 mg), (5) 3-ethoxy-7-ol stigmast-4-ene, (6) acetyl ursolic acid (15.6 mg), (7) betulonic acid (15 mg) From the chloroform extract, compounds were isolated and identified as: (8) Ursolic acid (71mg), (9) pomolic acid (21 mg) and (10) scopoletin Conclusion From the n-hexan fraction and choloroform fraction of Hedyotis capitellata,10 compounds were isolated including sterol, triterpen, anthraquinon, coumarin Compounds (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (9), (10) were identified in H capitellata for the first time i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chi Hedyotis .3 1.2 Tổng quan loài Dạ cẩm (Hedyotis capitellata Wall ex G.Don) 17 1.2 Tổng quan phương pháp thử hoạt tính sinh học 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 Kiểm tra nguyên liệu 34 3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học cao tồn phần 42 3.3 Chiết xuất, phân tách phân đoạn khảo sát hoạt tính sinh học 43 3.4 Phân lập chất từ cao Hedy A 47 3.5 Phân lập chất từ cao Hedy B 58 3.6 Xác định cấu trúc chất tinh khiết .66 3.7 Bàn luận 89 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AAPH 2,2’-azobis-(2-amidino-propan) dihydrochlorid ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl FRAD Ferric reducing antioxidant power FTC Ferric thiocyanat IC50 the half maximal inhibitory concentration MDA Malondialdehyde MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus MS Mass spectrometry MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromid NMR Nuclear magnetic resonance OD Optical Density ORAC Oxygen radical absorption capacity SRB Sulforhodamin B TBA Thiobarbiruric acid VS Vanillin- sulfuric SKLM Sắc kí lớp mỏng HTCO Hoạt tính chống oxy hóa iii DANH MỤC HÌNH Hình 1-1 Hình thái số lồi chi Hedyotis Hình 1-2 Cấu trúc alkaloid khung β-carbolin chi Hedyotis Hình 1-3 Cấu trúc số hợp chất iridoid chi Hedyotis .11 Hình 1-4 Một số lignan từ thuộc chi Hedyotis 13 Hình 1-5 Một số hợp chất khác H dichotoma H herbacea .13 Hình 1-6 Đặc điểm hình thái thực vật Dạ cẩm 18 Hình 1-7 Các hợp chất anthraquinon phân lập từ Dạ cẩm 20 Hình 1-8 Phản ứng gốc DPPH với chất chống oxy hóa 22 Hình 1-9 Phản ứng ABTS với chất chống oxy hóa 23 Hình 3-1: Đặc điểm hình thái Dạ cẩm .35 Hình 3-2 Vi phẫu thân Dạ cẩm .36 Hình 3-3 Vi phẫu gân phiến Dạ Cẩm 38 Hình 3-4 Vi phẫu phiến Dạ cẩm 39 Hình 3-5 Đặc điểm bột Dạ cẩm .40 Hình 3-6 Sắc kí lớp mỏng cao phân đoạn Dạ cẩm .44 Hình 3-7 Sơ đồ chiết xuất phân tách cao phân đoạn Dạ cẩm 44 Hình 3-8 SKLM cao phân đoạn cao toàn phần Dạ Cẩm .45 Hình 3-9 Giá trị IC50 HTCO cao phân đoạn Dạ cẩm vitamin C 47 Hình 3-10 Sắc kí đồ phân đoạn phân lập từ cao Hedy A 48 Hình 3-11: Sắc kí đồ phân tách phân đoạn A.9 .50 Hình 3-12: Sắc kí đồ phân tách phân đoạn A.9 51 Hình 3-13 Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết DC-1 51 Hình 3-14: Sắc kí đồ phân tách A.10 .52 Hình 3-15 Sắc kí đồ phân đoạn đươc phân lập từ A10.2 53 Hình 3-16 Sắc kí đồ kiểm tra tinh khiết DC-2 DC-3 54 Hình 3-17 Sắc kí đồ phân đoạn phân lập từ A10.4 55 Hình 3-18 Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết DC-4 56 iv Hình 3-19 Sắc kí đồ phân tách phân đoạn A10.4.11 .57 Hình 3-20 Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết DC-5 57 Hình 3-21 Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết DC-6 58 Hình 3-22 Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết DC-7 58 Hình 3-23 Sắc kí đồ phân đoạn sau phân lập cao Hedy-B 59 Hình 3-24 SKLM kiểm tra tinh khiết DC-8 60 Hình 3-25 Sắc kí đồ phân đoạn phân lập từ B.7 61 Hình 3-26 SKLM kiểm tra độ tinh khiết DC-9 .62 Hình 3-27 SKLM phân đoạn phân tách từ B9 63 Hình 3-28 SKLM kiểm tra tinh khiết DC-10 63 Hình 3-29 Sắc kí đồ hợp chất phân lập từ Dạ cẩm 64 Hình 3-30 Sơ đồ phân lập chất từ Dạ cẩm 65 Hình 3-31 Cấu trúc DC-10 tương tác HMBC 67 Hình 3-32 Cấu trúc DC-4 tương tác HMBC, COSY 69 Hình 3-33 Cấu trúc DC-1 số tương tác HMBC, COSY 71 Hình 3-34 Cấu trúc DC-2 tương tác HMBC 74 Hình 3-35 Cấu trúc DC-3 tương tác HMBC 76 Hình 3-36 Cấu trúc hợp chất DC-5 tương tác HMBC, COSY 79 Hình 3-37 Cấu trúc DC-7 tương tác HMBC, COSY 81 Hình 3-38 Cấu trúc DC-8 tương tác HMBC, COSY 84 Hình 3-39 Cấu trúc DC-9 tương tác HMBC, COSY 86 Hình 3-40 Cấu trúc hợp chất DC-6 tương tác HMBC, COSY .88 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1-1 Một số loài thuộc chi Hedyotis Việt Nam .4 Bảng 1-2 Cấu trúc anthraquinon H diffusa .7 Bảng 1-3 Anthraquinon H dichotoma H herbacea Bảng 1-4 Các iridoid chi Hedyotis 10 Bảng 1-5 Cấu trúc triterpenoid chi Hedyotis 12 Bảng 1-6 Độ hấp thu tỷ lệ ức chế gốc tự dịch chiết từ thuộc chi Hedyotis với phương pháp thử nghiệm FTC TBA .14 Bảng 1-7 Vùng ức chế vi khuẩn (mm) đo từ dịch chiết methanol Dạ cẩm 20 Bảng 3-1 Kết tiêu thử tinh khiết Dạ cẩm .40 Bảng 3-2 Kết định tính sơ thành phần hóa học Dạ cẩm 41 Bảng 3-3 Kết thử độc tính tế bào với cao chiết Dạ cẩm 42 Bảng 3-4: Khối lượng cao phân đoạn từ dịch chiết cồn .43 Bảng 3-5 Kết khảo sát tác dụng gây độc tế bào cao phân đoạn Dạ cẩm .45 Bảng 3-6 Kết thử nghiệm DPPH với cao phân đoạn Dạ cẩm Error! Bookmark not defined Bảng 3-7 Giá trị IC50 HTCO DPPH cao phân đoạn Dạ cẩm 46 Bảng 3-8: Khối lượng phân đoạn phân tách từ cao Hedy A 48 Bảng 3-9: Khối lượng phân đoạn phân tách từ phân đoạn A9 49 Bảng 3-10: Khối lượng phân đoạn phân tách từ phân đoạn A.10 Error! Bookmark not defined Bảng 3-11: Khối lượng phân đoạn phân tách từ phân đoạn A.10.2 53 Bảng 3-12 Khối lượng phân đoạn phân lập từ phân đoạn A10.4 55 Bảng 3-13: Bảng khối lượng phân đoạn thu sau phân lập A10.4.11 56 Bảng 3-14 Các phân đoạn phân tách từ cao Hedy-B 59 Bảng 3-15 Kết phân lập phân đoạn B.7 61