Xác định loài trong hỗn hợp bột thịt xương bằng phương pháp PCR

Xác định loài trong hỗn hợp bột thịt xương bằng phương pháp PCR

XÁC ĐỊNH LOÀI TRONG HỖN HỢP BỘT THỊT XƢƠNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Nguyễn Văn Ba, Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, Lê Quang Nam, Trần Thị Thu Thủy, Lê Anh Quỳnh Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật Tóm tắt Phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để xác định loài bò, lợn, gà trong hỗn hợp bột thịt xương. Bột thịt xương của các loài bò, lợn và gà được pha trộn ở các tỷ lệ 5%, 2%, 1%, 0,5% trong các hỗn hợp khác nhau. Các hỗn hợp mẫu này được tiến hành phân tích xác định loài bằng bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc trưng cho loài bò, lợn và gà. Sản phẩm PCR thu được các băng 271, 212, và 95 bp tương ứng với loài bò, lợn, gà. Kết quả phân tích cho thấy ở tất cả các hỗn hợp bột thịt xương pha trộn đều xác định được loài một cách chính xác bằng phương pháp PCR. Tỷ lệ thấp nhất có thể phát hiện được loài trong hỗn hợp bột thịt xương là ở mức 0,5%. Qua đó cho thấy, sử dụng phương pháp PCR để xác định loài trong hỗn hợp bột thịt xương cho kết quả nhanh và chính xác, đây là một phương pháp kiểm soát hữu hiệu các sản phẩm bột thịt xương động vật trên thì trường. 1. Đặt vấn đề Các loại thức ăn hay các sản phẩm được chế biến thành thức ăn tổng hợp thường được bổ sung thêm một số loại thịt của các loài khác nhằm làm tăng lợi nhuận bất chính theo kiểu “treo đầu dê bán thịt chó”. Ví dụ như thịt lợn có thể được bổ sung thêm vào các sản phẩm được chế biến từ thịt bò hoặc thịt bê (Chen và CS, 1998). Tương tự, trong các loại sản phẩm thức ăn sử dụng làm nguồn cung cấp protein cho động vật chế biến từ cá có thể có các loại thịt bò hay xương bò dẫn đến việc lây nhiễm một số bệnh như: bệnh bò điên (Mackie, 1999). Việc xác định các loài có thể thực hiện bằng nhiều các phương pháp khác nhau. Phân loại chủ yếu dựa trên các phương pháp sinh học phân tử như: phân tích về mặt hóa học của hệ thỗng miễn dịch đối với mẫu tươi, xét nghiệm miễn dịch, điện di… (Zerifi và CS, 1991), phân tích các acid béo (Verbeke và Brabander, 1980) hoặc xác định vi cấu trúc của các loại thức ăn (Koolmees, 1999). Tuy nhiên các phương pháp này thường phải xác định trong thời gian dài hoặc kém chính xác. Vì vậy việc sử dụng acid nucleic là cơ sở để đánh giá và xác định loài được sử dụng nhiều hơn và trở nên phổ biến hơn. Tác giả Irfan và cộng sự (2007) đã sử dụng lỹ thuật PCR đặc hiệu để xác định các loài ngựa, chó, mèo, bò, cừu, lợn, dê trong hỗn hợp thức ăn Tác giả Martin (2007) công bố có thể sử dụng phương pháp PCR đặc hiệu để nhân biết thành phần loài gà, ngỗng, vịt, gà tây trong hỗn hợp bằng các cặp mồi đặc trưng cho loài. Các kết quả đã chỉ ra rằng có thể xác định chính xác được các loài có trong hỗn hợp bột thịt, xương. Ở Việt Nam trong những năm gần đây nhiều nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm hỗ trợ chọn và cải tiến giống cây trồng và động vật nuôi có năng suất cao đã thu được thành tựu đáng kể. Tuy nhiên việc sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP và kỹ thuật PCR với các mồi đặc hiệu cho loài để xác định được các loài có trong thành phần thức ăn vật nuôi đang được quan tâm, nhưng chưa có công trình nào được công bố về tỉ lệ thịt của loài nào đó xuất hiện trong hỗn hợp thức ăn là bao nhiêu thì mới có thể phát hiện được bằng kỹ thuật PCR. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài này với mục đích xác định được loài bò, lợn, gà có trong thức ăn hỗn hợp bột thịt xương ở tỷ lệ thấp nhất có thể. 2. Vật liệu và phƣơng pháp 2.1. Nguyên liệu và bố trí thí nghiệm 2.1.1. Nguyên liệu - Thu thập các mẫu thịt, xương của các loài gà, bò, lợn. Sấy khô ở nhiệt độ 70 0 C trong vòng 1 tuần. Nghiền nhỏ tạo thành bột mịn để tiến hành phối trộn theo các tỷ lệ và thành phần khác nhau. - Thu thập một số hỗn hợp bột thịt, bột xương, bột máu chưa biết thành phần loài và tỷ lệ hỗn hợp từ phòng Phân Tích - Viện Chăn Nuôi 2.1.2. Bố trí thí nghiệm Chúng tôi tiến hành phối trộn các loại bột thịt xương với nhau theo các tỷ lệ xuất hiện của mỗi loại bột thịt xương tương ứng là 0,5%; 1%; 2%; và 5% với thành phần và cách phối trộn như sau: - Lô 1: Phối trộn hỗn hợp bột thịt xương của các loài bò, lợn và gà theo các tỷ lệ khác nhau (bảng 1) Bảng 1. Thành phần và tỷ lệ phối trộn các mẫu bột thịt xương khác nhau Lô 1 Tỷ lệ ( % theo khối lượng ) Bò - Lợn BL1 5% bò - 95% lợn BL2 2% bò - 98% lợn BL3 1% bò - 99% lợn BL4 0,5% bò - 99,5% lợn Lợn - Gà LG1 5% lợn - 95% gà LG2 2% lợn - 98% gà LG3 1% lợn - 99% gà LG4 0,5%lợn - 99,5% gà Bò - Gà BG1 5% bò - 95% gà BG2 2% bò - 98% gà BG3 1% bò - 99% gà BG4 0,5% bò - 99,5% gà Bò - Lợn - Gà BLG1 0,5% bò - 0,5% lợn - 99% gà BLG2 1% bò - 49% lợn - 50% gà BLG3 49% bò - 1% lợn - 50% gà BLG4 49% bò - 50% lợn - 1% gà BLG5 49,5% bò - 50% lợn - 0,5% gà - Lô 2: Phối trộn tỷ lệ thành phần bột thịt xương của các loài ở các mức 0,5%; 1%; 2%; và 5% trong bột đệm chính là bột ngô (Bảng 2). Bảng 2. Thành phần và tỷ lệ phối trộn các mẫu bột thịt xương với bột ngô Lô 2 Tỷ lệ ( theo khối lượng - gam) Bò - Lợn BL1 5% bò - 1% lợn - 94% bột ngô BL2 2% bò - 1% lợn - 97% bột ngô BL3 1% bò - 1% lợn - 98% bột ngô BL4 0,5% bò - 1% lợn – 98,5% bột ngô Lợn - Gà LG1 5% lợn - 1% gà - 94% bột ngô LG2 2% lợn - 1% gà - 97% bột ngô LG3 1% lợn - 1% gà - 98% bột ngô LG4 0,5%lợn - 1% gà – 98,5% bột ngô Bò - Gà BG1 5% bò - 1% gà - 94% bột ngô BG2 2% bò - 1% gà - 97% bột ngô BG3 1% bò - 1% gà - 98% bột ngô BG4 0,5% bò - 1% gà – 98,5% bột ngô Bò - Lợn - Gà BLG1 5% bò - 5% lợn - 5% gà - 85% bột ngô BLG2 2% bò - 2% lợn - 2% gà - 94% bột ngô BLG3 1% bò - 1% lợn - 1% gà - 97% bột ngô BLG4 0,5% bò – 0,5% lợn – 0,5% gà – 98,5% bột ngô - Lô 3: Tiến hành lặp lại thí nghiệm với hỗn hợp bột thịt xương của bò, lợn, gà ở tỷ lệ là 0,5% được phối trộn với bột đệm là bột ngô, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Thành phần và tỷ lệ phối trộn được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3. Thành phần và tỷ lệ bột xương của các loài Lô 3 Tỷ lệ ( theo khối lượng - gam) Bò - Lợn (lặp 3 lần) BL1 0,5% bò - 5% lợn - 94,5% bột ngô BL2 0,5% bò - 5% lợn - 94,5% bột ngô BL3 0,5% bò - 5% lợn - 94,5% bột ngô Lợn - Gà (lặp 3 lần) LG1 0,5% lợn - 5% gà - 94,5% bột ngô LG2 0,5% lợn - 5% gà - 94,5% bột ngô LG3 0,5% lợn - 5% gà – 94,5% bột ngô Bò - Gà (lặp 3 lần) BG1 0,5% bò - 5% gà - 94,5% bột ngô BG2 0,5% bò - 5% gà - 94,5% bột ngô BG3 0,5% bò - 5% gà - 94,5% bột ngô Bò - Lợn - Gà (lặp 3 lần) BLG1 0,5% bò - 0,5 % lợn - 0,5% gà - 98,5% bột ngô BLG2 0,5 % bò - 0,5 % lợn - 0,5% gà - 98,5% bột ngô BLG3 0,5 % bò - 0,5 % lợn - 0,5% gà - 98,5% bột ngô 2. 2. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN Chúng tôi sử dụng kít tách mô của hãng Qiagen để tách ADN từ mẫu bột thịt xương được phối trộn theo các tỷ lệ từ các lô mẫu như ở phần bố trí thí nghiệm. 2.2.2. Phương pháp PCR đặc hiệu để xác định thành phần loài trong hỗn hợp bột thịt xương Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho loài là đoạn mồi dùng để nhân đặc hiệu đoạn gen tổng hợp ARN riboxom ở gà và đoạn gen ty thể ở bò và lợn. * Thành phần PCR: Đệm PCR 10X: 1.5 µl, dNTP mix (2mM mỗi loại) 1.0 µl, Mg 2+ (25mM) 1.0 µl , mồi(mồi xuôi và mồi ngược 10 pM mỗi loại) 0.6 µl, ADN Taq polymerase 0.2 µl, ADN 1.0 µl, H 2 O vô trùng thêm vào sao cho tổng thể tích cuối cùng là 15 µl. * Chu trình nhiệt: 94 0 C trong 5 phút; 94 0 C trong 35 giây, 56-58 0 C trong 45 giây, 72 0 C trong 35 giây lặp lại 30 chu kỳ; 72 0 C trong 10 phút; 4 0 C trong 10 phút hoặc qua đêm. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả 3.1.1 . Kết quả tách chiết ADN Sử dụng kít Qiagen tách mô để tách chiết ADN từ bột thịt xương theo quy trình đã được nêu ở trên. Kết quả tách chiết ADN được thể hiện tại hình 1. Hình 1. Kết quả tách chiết ADN từ hỗn hợp bột thịt xương bò, lợn, gà Ảnh điện di cho thấy ADN tập trung thành băng đậm nét sáng rõ trên bản gel agarose 1%, rất phù hợp cho các phản ứng PCR tiếp theo. 3.1.2. Kết quả PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho loài Sau khi tiến hành các phản ứng PCR đặc hiệu với các cặp mồi đặc trưng cho loài, kết quả sẽ cho các băng có kích thước khác nhau trên điện di. - Chạy PCR mồi bò: Đoạn gen ty thể được nhân lên có kích thước khoảng 271 bp và đặc hiệu cho bò, đoạn mồi này không bắt cặp để phản ứng với ADN của gà và lợn (Hình 2) BG1 BG2 BG3 BG4 BL1 BL2 BL3 BL4 M50 Bò Lợn Gà Hình 2. Kết quả PCR đặc hiệu với ADN bò của lô mẫu 2 Chú thích: BG- hỗn hợp bò gà, BL- hỗn hợp bò lợn, BLG- hỗn hợp bò lợn gà, Bò- đối chứng dương, Lợn, Gà – mẫu đối chứng âm M50- thang chuẩn có khoảng cách 50 bp - Chạy PCR mồi lợn: Phản ứng PCR đặc hiệu cho đoạn gen ty thể của lợn được nhân lên với một đoạn băng kích thước 212 bp, cặp mồi này rất đặc hiệu và không phản ứng với ADN của bò và gà (hình 3). Hình 3. Kết quả PCR đặc hiệu với ADN lợn của lô mẫu 2 Chú thích: LG- hỗn hợp lợn gà, BL- hỗn hợp bò lợn, BLG- hỗn hợp bò lợn gà, Lợn- đối chứng dương, Bò, Gà – mẫu đối chứng âm M50- thang chuẩn có khoảng cách 50 bp - Chạy PCR mồi gà: Với đoạn mồi thiết kế để nhân đặc hiệu đoạn gen 12s ARN riboxom, kết quả PCR thu được đoạn băng có kích thước 95 bp và chỉ xuất hiện trong các mẫu có chứa ADN gà (hình 4). LG1 LG2 LG3 LG4 BL1 BL2 BL3 BL4 M Lợn Bò Gà bp BG1 BG2 BG3 LG1 LG2 LG3 BLG1 BLG2 M50 Gà Lợn Bò Hình 4. Kết quả PCR đặc hiệu với ADN gà của lô mẫu 2 Chú thích: LG- hỗn hợp lợn gà, BL- hỗn hợp bò lợn, BLG- hỗn hợp bò lợn gà, Lợn- đối chứng dương, Bò, Gà – mẫu đối chứng âm M50- thang chuẩn có khoảng cách 50 Kết quả PCR cho các lô thí nghiệm được thể hiện chi tiết ở bảng 4,5 và 6. Bảng 4. Kết quả PCR với các mồi đặc hiệu của lô mẫu 1 Lô mẫu 1 Mồi bò Mồi lợn Mồi gà Bò - Lợn BL1 + + 0 BL2 + + 0 BL3 + + 0 BL4 + + 0 Lợn - Gà LG1 0 + + LG2 0 + + LG3 0 + + LG4 0 + + Bò - Gà BG1 + 0 + BG2 + 0 + BG3 + 0 + BG4 + 0 + Bò - Lợn - Gà BLG1 + + + BLG2 + + + BLG3 + + + BLG4 + + + BLG5 + + + Đối chứng (+) + + + Đối chứng ( -) - - - Kết quả PCR lô mẫu 1 cho thấy các cặp mồi sử dụng rất đặc hiệu cho loài, ở tất cả các tỷ lệ phối trộn từ 0,5 đến 5% trong thí nghiệm đều thành công 100%. Bảng 5. Kết quả PCR với các mồi đặc hiệu ở lô mẫu 2 Lô mẫu 2 Mồi bò Mồi lợn Mồi gà Bò - Lợn BL1 + + 0 BL2 + + 0 BL3 + + 0 BL4 + + 0 Lợn - Gà LG1 0 + + LG2 0 + + LG3 0 + + LG4 0 + + Bò - Gà BG1 + 0 + BG2 + 0 + BG3 + 0 + BG4 + 0 + Bò - Lợn - Gà BLG1 + + + BLG2 + + + BLG3 + + + BLG4 + + + Đối chứng + + + + Đối chứng - - - - Trong lô mẫu 2, tỷ lệ % của bột thịt xương các loài cũng phối trộn từ 0,5 đến 5% nhưng có thêm ADN của ngô. Kết quả lô 2 vẫn thành công giống lô 1, đạt 100% dương tính ở các mẫu thí nghiệm và phù hợp với mẫu đối chứng. Bảng 6. Kết quả PCR với các mồi đặc hiệu ở lô mẫu 3 Lô mẫu 3 Mồi bò Mồi lợn Mồi gà Bò - Lợn BL1 + + - BL2 + + - BL3 + + - Lợn – Gà LG1 - + + LG2 - + + LG3 - + + Bò – Gà BG1 + - + BG2 + - + BG3 + - + Bò - Lợn -Gà BLG1 + + + BLG2 + + + BLG3 + + + Đối chứng + + + + Đối chứng - - - - Trong lô mẫu 3 chúng tôi bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần chỉ ở tỷ lệ 0,5%,nhằm xác định độ chính xác ở tỷ lệ này. Kết quả các lần lặp lại giống hệt nhau và đạt 100% ở tất cả các mẫu. Chúng tôi cũng đã thử nghiệm với tỷ lệ nhỏ hơn nữa là 0,1% nhưng không thành công (5 lần chạy PCR chỉ cho kết quả đúng là 1 lần tương đương 20%). Áp dụng phương pháp PCR đặc hiệu với lô mẫu bột máu, bột thịt, bột xương thu thập từ Phòng phân tích của Viện Chăn Nuôi, chúng tôi thu được kết quả thể hiện trong bảng 7. Bảng 7. Kết quả chạy 3 cặp mồi bò, lợn, gà trên mẫu bột máu, bột thịt, bột xương Mẫu Bột máu -BM Bột xương -BX Bột thịt 1 -BT Bột thịt 2- BTP Chạy mồi bò + + + + Chạy mồi lợn + - + + Chạy mồi gà + + + - Kết quả Có bò, lợn, gà Có bò, gà Có bò, lợn, gà Có bò, lợn Sau khi phân tích các mẫu bột thịt, bột máu và bột xương thu từ phòng phân tích, kết quả cho thấy mẫu bột máu và bột thịt 1 có cả bò, lợn và gà; còn mẫu bột xương có bò, gà; mẫu bột thịt 2 có bò và lợn. 3.2. Thảo Luận Chúng tôi có thể xác định được loài bò, lợn, gà trong hỗn hợp với tỷ lệ nhỏ nhất là 0,5% và đây cũng là tỷ lệ nhỏ nhất mà nhiều tác giả trên thế giới đã công bố. Với tỷ lệ nhỏ hơn nữa (0,1%) chúng tôi đã thử nghiệm phối trộn nhưng không thành công mặc dù chúng tôi đã tăng chu kỳ phản ứng nhân gen lên 35-40 chu kỳ. Có thể do tỷ lệ quá nhỏ nên xác xuất để lấy được phần mẫu cần quan tâm để tách chiết ADN là quá nhỏ (vì khi tách ADN chỉ lấy một lượng mẫu hỗn hợp rất nhỏ tương đương 30 mg). 4. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận - Phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi đặc trưng cho loài bò, lợn và gà hoàn toàn đặc hiệu và chính xác trong việc xác định thành phần loài trong hỗn hợp bột thịt xương. - Tỷ lệ thấp nhất có thể xác định được các loài bò, lợn và gà pha trộn trong hỗn hợp bột thịt xương là ở mức 0,5%. 4.2. Đề nghị - Sử dụng phương pháp PCR đặc hiệu để phát hiện thành phần loài trong hỗn hợp để phân tích các mẫu bột xương dùng trong thức ăn chăn nuôi. - Công nhận đây là tiến bộ kỹ thuật để áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm. Tài liệu tham khảo 1. Chen, F. C., Peggy Hsieh, Y H. ADN Bridgman, R. C. 1998. Monoclonal antibodies to porcine thermal- stable muscle protein for detection of pork in raw and cooked meats. Journal of Food Science, 63: 201- 205. 2. Koolmees, P. A. 1999. Histology as an additional technique for species identification in meat products. In Bergwerff, A. A. (Ed). Species Identification in Meat Product, p. 35-41. Utrecht, The Netherlands: ECCEAMST. 3. Mackie, I. M., Pryde, S. E., Gonzales-Sotelo, C., Medina, I , Perez-Martin, R., Quinteiro, J., Rey-Mendez, M. ADN Rehbein, H. 1999. Challenges in the identification of species of canned fish. Trends in Food Science and Technology, 10: 9-14. 4. Martın, I., Garcıa, T., Fajardo, V., Lopez-Calleja, I., Rojas, M., Pavon, M. A., et al. (2007). Technical note: Detection of chicken, turkey, duck, and goose tissues in feedstuff s using species-specific polymerase chain reaction. Journal of AnimalScience, 85, 452–458. 5. Irfan Ilhak, O., Ali Arslan, 2007. Identification of Meat Species by Polymerase Chain Reaction (PCR) Technique. Turk. J. Vet. Anim. Sci; 31(3): 159-163 6. Verbeke, R. and Brabander, H. F. 1980. Identification of animal fat species. Proceedings of European Meeting of Meat. Research Workers, 26: 150-153. 7. Zerifi, C., Lanie, C. and Benard, G. 1991. SDS-PAGE technique for species identification of cooked meat. Fleischwirtschaft, 71: 1060-1062. . được loài trong hỗn hợp bột thịt xương là ở mức 0,5%. Qua đó cho thấy, sử dụng phương pháp PCR để xác định loài trong hỗn hợp bột thịt xương cho kết quả nhanh và chính xác, đây là một phương pháp. nghệ Tế bào Động vật Tóm tắt Phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để xác định loài bò, lợn, gà trong hỗn hợp bột thịt xương. Bột thịt xương của các loài bò, lợn và gà được pha. có thể xác định được các loài bò, lợn và gà pha trộn trong hỗn hợp bột thịt xương là ở mức 0,5%. 4.2. Đề nghị - Sử dụng phương pháp PCR đặc hiệu để phát hiện thành phần loài trong hỗn hợp để