Thiết lập hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn agrobacterium rhizogenes cho cây xoan ta (melia azedarach l)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “THIẾT LẬP HỆ THỐNG CHUYỂN GENTHÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM RHIZOGENES CHO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.)” Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “THIẾT LẬP HỆ THỐNG CHUYỂN GENTHÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM RHIZOGENES CHO CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) ” Người thực : NGUYỄN THỊ THANH HỊA Ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn : TS ĐỖ TIẾN PHÁT : TS NGUYỄN THỊ LÂM HẢI Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu trung thực chưa cơng bố Nội dung lý thuyết có khóa luận tơi có tham khảomột số tài liệu trích dẫn mục tài liệu tham khảo Mọi giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà nội, ngày 03 tháng 10 năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Hịa i LỜI CẢM ƠN Để báo cáo khóa luận tốt nghiệp hồn thành, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Đỗ Tiến Phát TS Nguyễn Thị Lâm Hải theo sát hướng dẫn giúp đỡ tơi tận tình suốt thời gian tơi thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn ban Lãnh đạo phịng Cơng nghệ tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam truyền đạt cho kiến thức định hướng thật quý báu ngành học Trong khoảng thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, nhận hướng dẫn hỗ trợ tận tình ThS Lý Khánh Linh với tất cô, anh chị cán phịng Cơng nghệ tế bào Thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ấm áp đến tất anh chị cán phịng giúp đỡ tơi Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 10 năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Hòa ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii TÓM TẮT viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: 1.3 Yêu cầu đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây Xoan ta ứng dụng 2.1.1 Giới thiệu chung Xoan ta 2.1.2 Tầm quan trọng Xoan ta, giá trị sử dụng giá trị kinh tế mà đem lại 2.1.3 Các nghiên cứu Xoan ta giới 2.1.4 Các nghiên cứu Xoan ta Việt Nam 2.2 Tổng quan rễ tơ 2.2.1 Giới thiệu chung rễ tơ, chế hình thành rễ tơ thực vật 2.2.2 Tiềm rễ tơ việc hỗ trợ nghiên cứu chức gen công nghệ gen thực vật 12 2.2.3 Tiềm rễ tơ sản xuất trao đổi chất thứ cấp thực vật 12 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen 13 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 15 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 15 iii 3.1.2 Hóa chất sử dụng 15 3.1.3 Thiết bị sử dụng 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Phương pháp khử trùng hạt Xoan ta tạo nguyên liệu 16 3.2.2 Phương pháp chuẩn bị huyền phù vi khuẩn 17 3.2.3 Phương pháp chuyển gen vào Xoan ta thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 17 3.2.4 Phương pháp phân tích chuyển gen 18 3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu phân tích thống kê 19 3.2.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20 3.2.7 Nội dung nghiên cứu 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho cảm ứng rễ tơ Xoan ta 23 4.2 Đánh giá ảnh hưởng mật độ huyền phù vi khuẩn mẫu cấy tới hiệu cảm ứng tạo rễ tơ 25 4.3 Đánh giá ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy tới hiệu cảm ứng tạo rễ tơ 27 4.4 Kiểm tra có mặt biểu gen chuyển dòng rễ tơ Xoan ta 29 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AS Acetosyringone EDTA Cetyl trimethyl ammonium bromide gus β-glucuronidase OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction YEP Yeast Extract Peptone YMB Yeast Mannitol Broth T-DNA Transfer DNA TL-DNA Transfer DNA Right border repeat sequences TR-DNA Transfer DNA Right border repeat sequences X – Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucoronide v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại khoa học Xoan ta Bảng 3.1 Các môi trường sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 4.1 Hiệu quy trình chuyển gen với điều kiện tối ưu 30 Bảng 4.2 Kết nhuộm X-Gluc dòng rễ tơ thu 31 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh Xoan ta Hình 2.2 Cơ chế chuyển T-DNA Ri-plasmid sang genome thực vật Hình 2.3 Ri Plasmid vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 10 Hình 3.1 Hạt xoan sử dụng làm nguyên liệu biến nạp 15 Hình 4.1 Tỷ lệ hình thành rễ tơ từ mẫu thân mầm Xoan ta biến nạp với chủng khuẩn K559 ATCC sau tuần biến nạp Sự khác biệt đáng kể mặt thống kê xác định hàm Welch’s t-test (*P < 0,05, n =4) 23 Hình 4.2 Ảnh hưởng A rhizogenes K559 ATCC đến cảm ứng rễ tơ từ thân mầm Xoan ta sau tuần biến nạp 24 Hình 4.3 Tỷ lệ hình thành rễ tơ từ mẫu thân mầm mầm Xoan ta ởcác nồng độ khuẩn khác sau tuần biến nạp 26 Hình 4.4 Ảnh hưởng A rhizogenes ATCC15834 đến cảm ứng rễ tơ từthân mầm Xoan ta mật độ khuẩn lây nhiễm khác sau tuần biến nạp 27 Hình 4.5 Tỷ lệ hình thành rễ tơ từ mẫu cấy Xoan ta biến nạp thời gian đồng nuôi cấy khác sau tuần biến nạp Sự khác biệt đáng kể mặt thống kê xác định hàm One-Way ANOVA với kiểm định Duccan Các chữ khác thể mức độ khác biệt có ý nghĩa (P