Nghiên cứu nhằm xác định một số điều kiện thích hợp cho chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở hai giống đậu nành HLĐN29 và DT84. Ở cả hai giống đậu nành, mẫu lá mầm cảm ứng tạo rễ tốt hơn so với trụ hạ diệp.
114 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Xác định số điều kiện thích hợp cảm ứng tạo rễ tóc đậu nành sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Determination of some conditions for hairy root induction in soybean by Agrobacterium rhizogenes Tôn Bảo Linha , Lê Xuân Vũa , Ngô Thị Tú Trinhb Nguyễn Vũ Phonga b a Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ trẻ - Thành Đồn TP Hồ Chí Minh THƠNG TIN BÀI BÁO Ngày nhận: 26/12/2017 Ngày chấp nhận: 27/03/2018 Từ khóa Agrobacterium rhizogenes Chuyển gen Đậu nành Lá mầm Rễ tóc TĨM TẮT Nghiên cứu nhằm xác định số điều kiện thích hợp cho chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes hai giống đậu nành HLĐN29 DT84 Ở hai giống đậu nành, mẫu mầm cảm ứng tạo rễ tốt so với trụ hạ diệp Ở giống đậu nành HLĐN29, 96-100% mẫu tạo rễ lây nhiễm với chủng vi khuẩn ATCC11325 ATCC15834, số rễ trung bình khoảng rễ/mẫu Đối với giống đậu nành DT84, có chủng vi khuẩn ATCC15834 cho hiệu tạo rễ tốt Sử dụng mầm đậu nành 6-8 ngày sau gieo cho hiệu tạo rễ tốt thuận tiện thao tác Hai cách lây nhiễm trực tiếp ngâm mẫu cho tỉ lệ mẫu tạo rễ số rễ trung bình tương đương hai giống đậu nành HLĐN29 DT84 Rễ chuyển gen xác định thông qua phân tích PCR sử dụng cặp primer đặc hiệu cho gen vir D rol C ABSTRACT This study was conducted to determine some conditions for transformation via Agrobacterium rhizogenes on soybean cultivars HLDN29 and DT84 Cotyledon explants were more efficient in hairy root Agrobacterium rhizogenes induction compared with hypocotyl explants in both cultivars of Cotyledon soybean The highest root induction rate and average root number Hairy root were observed in HLDN29 explants infected with ATCC11325 and Soybean ATCC15834 strains (approx 96% – 100% and roots per explant) Transformation and in DT84 explants infected with ATCC15834 Six to eight day – old cotyledonary leaves after sowing were optimal and appropriate for hairy root induction Direct inoculation and immersion methods Tác giả liên hệ showed no significant difference in root induction rate and average root number in both HLDN29 and DT84 cultivars Transgenic root lines were identified based on PCR analysis with vir D rol C sequences – Nguyễn Vũ Phong Email: nvphong@hcmuaf.edu.vn specific primers Keywords Đặt Vấn Đề Đậu nành (Glycine max L Merrill) công nghiệp ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng cao người vật ni, có tầm quan trọng mặt kinh tế đứng sau lúa mì, lúa nước ngơ (Trần Văn Điền, 2007; Homrich ctv, 2012) Vì vậy, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển - Số (2018) nghiên cứu nhằm cải thiện chất lượng suất đậu nành trọng Hiện nay, đậu nành biến đổi gen trồng rộng rãi khắp giới chiếm 78% tổng diện tích đậu nành toàn cầu (ISAAA, 2016) Ở Việt Nam, đậu nành ba loại trồng ưu tiên nghiên cứu chuyển gen Các mục www.journal.hcmuaf.edu.vn 115 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tiêu chọn tạo giống đậu nành gồm suất cao, kháng bệnh chống chịu tốt với điều kiện bất lợi (Krishnan, 2005) Tuy nhiên, việc tạo dòng đậu nành chuyển gen gặp nhiều hạn chế phản ứng kiểu gen với điều kiện tái sinh tác nhân khác (Kereszt ctv, 2007; Cao ctv, 2009) tốc độ 3.500 rpm 20 phút 40 C Huyền phù vi khuẩn môi trường LCCM (AL-Yozbaki ctv, 2015) có bổ sung acetosyringone 200 µM Sử dụng dịch huyền phù vi khuẩn để lây nhiễm mẫu đậu nành 2.2 Chuẩn bị mẫu đậu nành Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium phương pháp sử dụng phổ biến chuyển gen thực vật (Ozyigit ctv, 2013) Trong đó, tạo rễ đậu nành chuyển gen A.rhizogenes công cụ hiệu nghiên cứu chức gen (Homrich ctv, 2012) Vi khuẩn A.rhizogenes gây bệnh rễ tóc (hairy root) cây, tương tự bệnh khối u gây A.tumefaciens Rễ tóc ni cấy phát triển nhanh chóng theo chiều xiên phân nhánh cao môi trường chất điều hịa sinh trưởng (Collier ctv, 2005) Giống đậu nành HLĐN 29 cung cấp Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam giống đậu nành DT84 Công ty cổ phần Giống trồng miền Nam sử dụng nghiên cứu Các hạt đậu nành có kích thước lớn đồng khử trùng bề mặt khí chlorine khoảng 14 - 18 (Olhoft ctv, 2007) Sau đó, gieo hạt đậu nành khử trùng vào chai thủy tinh 500 mL chứa 100 mL môi trường B5 Trên đậu nành, rễ tóc thường sử dụng để (Gamborg ctv, 1968) bổ sung sucrose (3%), biểu promoter (Hernandez-Garcia ctv, agar (0,8%), pH 5,8 Mỗi chai cấy 10 hạt đậu 2010), nhân nuôi tuyến trùng bào nang (Cho nành, đặt0 điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ctv, 2000), nghiên cứu tổ chức cộng sinh vùng rễ 25 ± C Sau - 10 ngày, sử dụng mầm (Hayashi ctv, 2010) tương tác gây bệnh trụ hạ diệp đậu nành để lây nhiễm vi khuẩn vùng rễ (Li ctv, 2010), ngồi chúng cịn 2.3 Lây nhiễm vi khuẩn cảm ứng tạo rễ biểu gen RNAi im lặng (Subramanian ctv, 2005) Hiệu tạo rễ tóc đậu nành Mẫu đậu nành lây nhiễm A.rhizogenes thay đổi tùy vào kiểu gen đậu nành chủng vi dựa qui trình AL-Yozbaki ctv (2015) khuẩn sử dụng Nghiên cứu nhằm đánh giá Dùng lưỡi dao mổ (số 11) tạo vết thương mặt ảnh hưởng nguồn vật liệu dùng để chuyển mầm (3 vết thương/lá mầm, chiều dài vết gen, độ tuổi mẫu cách lây nhiễm đến hiệu thương khoảng 0,7 cm), cắt ngang trụ hạ diệp tạo rễ tóc đậu nành thành đoạn có chiều dài khoảng 2,5 cm tạo vết thương theo chiều dài mẫu, sau ngâm mẫu Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu dịch khuẩn 15 phút Thấm khô bề mặt mẫu khăn giấy khử trùng, chuyển mẫu 2.1 Chuẩn bị vi khuẩn đĩa mơi trường CCM có bổ sung acetosyringone Vi khuẩn A.rhizogenes dạng tự nhiên khơng 200 µM đặt tối 25 C ngày mang plasmid tái tổ hợp gồm chủng ICPB Sau giai đoạn đồng nuôi cấy (co-cultivation), loại (International Collection of Phytopathogenic vi khuẩn cách rửa mẫu lần môi Bacteria) TR7, 19812, ATCC11325, ATCC15834 trường MXB lỏng (LMXB) ngâm môi TS Nguyễn Vũ Phong, Bộ mơn Cơng Nghệ trường LMXB có bổ sung cefotaxime 500 mg/L Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí carbenicillin 400 mg/L, lắc 100 rpm 30 Minh cung cấp; chủng C25 TS Nguyễn Như phút Mẫu thấm khô bề mặt, đặt môi 2015) có bổ Nhứt, Cơng ty TNHH Gia Tường (Bình Dương) trường MXB (AL-Yozbaki ctv, sung cefotaxime 500 mg/L, 25 C chiếu sáng cung cấp 16 giờ/ngày Đối với cách lây nhiễm vi khuẩn trực Các chủng A.rhizogenes cấy ria môi tiếp, nhúng lưỡi dao vào dịch khuẩn sau tạo trường YEP (Olhoft ctv, 2003) Sau 48 vết thương mẫu Mẫu sau lây nhiễm vi chọn khuẩn lạc đơn tăng sinh mơi trường khuẩn trì điều kiện trường YEP lỏng, nhiệt độ phòng, lắc 150 rpm 12 hợp ngâm mẫu - 15 Khi giá trị OD600 dịch khuẩn đạt 0,5 Các yếu tố quan trọng liên quan đến kết - 1,0 tiến hành ly tâm thu sinh khối vi khuẩn tạo rễ tóc đậu nành khảo sát gồm www.journal.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển - Số (2018) 116 phù hợp chủng A.rhizogenes loại mẫu (lá mầm trụ hạ diệp) đậu nành, độ tuổi mẫu (2 – 10 ngày) cách thức lây nhiễm (lây nhiễm trực tiếp ngâm mẫu) Sau lây nhiễm 14 ngày ghi nhận tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) số rễ trung bình mẫu tạo rễ Ở thí nghiệm, nghiệm thức lặp lại ba lần, lần sử dụng 10 hạt Mẫu mầm trụ hạ diệp sau lây nhiễm vi khuẩn cấy đĩa mơi trường đường kính 10 cm, 10 mẫu/đĩa Hạt đậu nành gieo qui ước ngày tuổi 2.4 Phân tích PCR Các dịng rễ tóc tách khỏi mẫu tăng sinh môi trường B5 khoảng tháng Sau đó, DNA tổng số rễ giả định chuyển gen rễ không chuyển gen tách chiết kit (GeneJET, Thermo Fisher Scientific) Tách chiết DNA plasmid từ dịch vi khuẩn tăng sinh 48 ISOLATE II Plasmid Mini Kit (Bioline) Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp primer đặc hiệu cho vi khuẩn A.rhizogenes đậu nành (Bảng 1) để xác định rễ chuyển gen Mỗi phản ứng PCR (25 µL) gồm 12,5 µL MyTaq Mix (Bioline), DNA khn, primer xi primer ngược (0,8 µM primer), nước khử ion tiệt trùng Chu kì nhiệt phản ứng khuếch đại gồm giai đoạn tiền biến tính 930 C phút, 35 chu kì khuếch đại gồm giai đoạn biến tính 950 C 25 giây, bắt cặp 570 C 25 giây kéo dài 720 C 45 giây Sản phẩm khuếch đại hoàn thiện 720 C 45 giây Sản phẩm PCR bổ sung thuốc nhuộm GelRed (TBR, Việt Nam) điện di gel agarose 2% (Bioline) hiệu điện 80 V 35 phút, sử dụng dung dịch đệm TBE 0,5X (Bioline) Sau điện di, đọc kết đèn UV Mẫu rễ cho kết PCR dương tính với gen rol C âm tính với gen vir D mẫu chuyển gen thành công sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu để nhân sinh khối rễ đậu nành Gen Golgin 84 gen thường trực đậu nành (Marcolino-Gomes ctv, 2015) 2.5 Xử lý số liệu Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Kết Quả Và Thảo Luận 3.1 Sự phù hợp chủng A.rhizogenes loại mẫu cảm ứng tạo rễ đậu nành Tỉ lệ mẫu tạo rễ số rễ trung bình nghiệm thức sau giai đoạn loại bỏ vi khuẩn 14 ngày thể Bảng Bảng Tỉ lệ mẫu tạo rễ số rễ trung bình mầm cao trụ hạ diệp khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Tuy nhiên, khơng có khác biệt đáng kể tỉ lệ mẫu mầm tạo rễ Bảng cho thấy giống HLĐ29, mẫu mầm lây nhiễm với chủng ATCC11325, ATCC15834 có số rễ trung bình cao khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức cịn lại đối chứng Trong đó, chủng ATCC 15834 cho hiệu tạo rễ cao mẫu mầm giống DT84 Nghiên cứu AL-Yozbaki ctv (2015) cho thấy tỉ lệ tạo rễ thấp trụ hạ diệp (16/25) so với mầm (20/26) Kết tạo rễ nghiệm thức sử dụng mẫu trụ hạ diệp hai giống đậu nành tương đương không khác biệt so với đối chứng, ngoại trừ nghiệm thức sử dụng ICPB TR7 giống DT84 với số rễ trung bình thấp (0,6 rễ) (Hình 1) Bên cạnh đó, kết phân tích thống kê thể tương tác loại mẫu chủng vi khuẩn hai giống đậu nành Điều cho thấy phù hợp chủng A.rhizogenes mẫu lây nhiễm có liên quan với hiệu cảm ứng tạo rễ đậu nành Trong nghiên cứu tương tự Savka ctv (1990), tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ 10 kiểu gen đậu nành sử dụng A.rhizogenes K599 (chủng cucumopine) 37% Ở chủng mannopine-type 8196, tỉ lệ 3% kiểu gen đậu nành chủng agropine 1855 A4 có tỉ lệ mẫu tạo rễ thấp (1%) Mẫu trụ hạ diệp xuất rễ sau lây nhiễm với tất chủng A.rhizogenes khảo sát, khơng phải rễ tóc có khả tổng hợp opine 3.2 Ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tóc Số liệu thu thập xử lí thống kê, đọc kết Tuổi mẫu cấy yếu tố quan trọng dựa vào phân tích ANOVA, bảng trung bình thí nghiệm chuyển gen (Tazeen Mirza, bảng so sánh khác biệt nghiệm thức 2004) Hiệu chuyển gen với Agrobacterium theo trắc nghiệm phân hạng (LSD) liên quan chặt chẽ với độ tuổi cân nội tiết tố vật chủ (Karmarkar ctv, 2001) Khả Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển - Số (2018) www.journal.hcmuaf.edu.vn 117 Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Bảng Các trình tự primer sử dụng nghiên cứu Gen Trình tự primer Kích thước sản phẩm (bp) Tài liệu Golgin 84 F: 5’-TTG GAC AAG GAG AGA CTC CAC -3’ R: 5’-TGC GAG GCT ACG AAA ACT TC -3’ 121 Marcolino-Gomes ctv, 2015 534 Fattahi ctv, 2013 438 Fattahi ctv, 2013 Rol C Vir D F: 5’-TAA CAT GGC TGA AGA CGA CC-3’ R: 5’-AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC-3’ F:5’- ATG TGG CAA GGC AGT AAG CCCA-3’ R: 5’- GGA GTC TTT CAG CAG GAG CAA-3’ Bảng Tỉ lệ (%) mẫu mầm trụ hạ diệp tạo rễ (A) sau lây nhiễm với chủng A.rhizogenes khác (B) Chủng A.rhizogenes (B) ATCC11325 ATCC15834 19812 C25 ICPB TR7 Đối chứng Trung bình (A) HLĐN29 Lá mầm Trụ hạ diệp Trung bình (A) (A) (B) 96,7 20,0 58,3 100 40,0 70,0 96,7 43,3 70,0 96,7 53,3 75,0 96,7 60,0 78,3 98,3 23,3 60,8 96,7 40,0 FA = 221∗∗ FAB =2,4ns FB = 1,80ns CV(%) = 18,5 DT84 Lá mầm Trụ hạ diệp Trung bình (A) (A) (B) 90,0 20,0 55,0ab 98,3 40,0 69,2a 90,0 20,0 55,0ab 93,3 16,7 55,0ab 95,0 23,3 59,1ab 80,0 13,3 46,7b 91,1 22,2 FA = 414∗∗ FAB =0,32ns FB = 5,20∗∗ CV(%) = 13,7 Bảng Số rễ tạo thành từ loại mẫu đậu nành in vitro (A) sau lây nhiễm chủng A.rhizogenes khác (B) Chủng A.rhizogenes (B) ATCC11325 ATCC15834 19812 C25 ICPB TR7 Đối chứng Trung bình (A) HLĐN29 Trụ Trung Lá mầm hạ diệp bình (A) (A) (B) 8,27a ➧0,57 3,17c ➧0,62 5,72a 8,23a ➧0,84 3,33c ➧0,51 5,78a 5,34b ➧0,72 2,98c ➧0,87 4,16b 6,30b ➧0,24 2,92c ➧0,82 4,61ab 5,39b ➧0,93 2,32c ➧0,74 3,85b 4,91b ➧0,27 2,17c ➧0,62 3,54b 6,41 2,81 FA = 159∗∗ FAB = 2,70* FB = 7,45∗∗ CV(%) = 18,51 ➧ Lá mầm (A) 4,60c ➧0,38 6,32a ➧0,10 5,45b ➧0,22 4,65c ➧0,23 4,70c ➧0,45 5,20b ➧0,35 5,15 FA = 866∗∗ FB =10,6** DT84 Trụ Trung hạ diệp bình (A) (B) 1,57d ➧0,45 3,08bc 1,97d ➧0,25 4,14a 1,27d ➧0,15 3,36b 1,43d ➧0,87 2,65c 0,60e ➧0,17 3,47b 1,73d ➧0,06 3,47b 1,43 FAB =3,21* CV(%) = 11,5 Số liệu trình bày dạng Trung bình SD (Độ lệch chuẩn); CV: hệ số biến thiên; kí tự a, b, c thể khác biệt mặt thống kê; ∗ khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) ; ∗∗ khác biệt có ý nghĩa (α=0,01) www.journal.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển - Số (2018) 118 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tương tự kết nghiên cứu Cao ctv (2009) Cụ thể, thí nghiệm xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đến trình chuyển gen đậu nành ex vitro sử dụng A.rhizogenes cho thấy mẫu đậu nành từ – ngày tuổi tạo rễ sau lây nhiễm vi khuẩn từ - ngày; chồi đậu nành ngày sau gieo hạt có tỉ lệ mẫu tạo rễ thấp so với mẫu - ngày, nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê AL-Yozbaki ctv (2015) sử dụng mầm đậu nành từ – 10 ngày sau gieo hạt để tạo rễ tóc sử dụng A.rhizogenes R1000 Chồi đậu nành sử dụng chất dinh dưỡng dự trữ hai mầm để tăng trưởng, từ hạt nảy mầm, chất dinh dưỡng hai mầm giảm dần Hiệu mặt thời gian cảm ứng tạo rễ phụ thuộc vào độ tuổi mẫu Mẫu giai đoạn sớm thường khuyến khích sử dụng (Cao ctv, 2009) Bên cạnh đó, giai đoạn ngày tuổi, lượng chất dinh dưỡng thấp so với mầm giai đoạn sớm Hạt đậu nành ngày sau gieo bắt đầu trương to, hai mầm nứt bọc vỏ hạt Từ ngày thứ 4, mầm đậu nành chuyển từ màu vàng sang màu xanh Từ ngày thứ trở đi, lớp vỏ hạt bắt đầu tách (Hình 2) Do thực tế, xử lí mẫu để lây nhiễm, sử dụng hạt đậu nành từ ngày thứ trở tạo thuận lợi Hình Lá mầm trụ hạ diệp đậu nành HLĐ29 thao tác, làm tổn thương mẫu tách vỏ hạt sau lây nhiễm A.rhizogenes 16 ngày môi rút ngắn thời gian thực giai đoạn Vì trường MXB bổ sung cefotaxime 500 mg/L hạt đậu nành - ngày sau gieo mẫu thích (A) Mẫu trụ hạ diệp lây nhiễm với chủng ICBP TR7 hợp để cảm ứng tạo rễ sử dụng A.rhizogenes (B) ATCC11325; mầm đậu nành sau lây nhiễm với chủng (C) ATCC15834; (D) ATCC11325; (E) C25; (F) 19812; (G) ICPB TR7; (H) Đối chứng không lây nhiễm tạo rễ mầm đậu nành 2, 4, 6, 10 ngày tuổi lây nhiễm chủng ATCC15834 ghi nhận Bảng Kết cho thấy giống HLĐN29 số rễ trung bình tỉ lệ mẫu tạo rễ mầm từ - 10 ngày tuổi không khác biệt mặt thống kê Trong đó, mẫu 10 ngày tuổi có tỉ lệ tạo rễ thấp Ở giống DT84, tỉ lệ mẫu tạo rễ mầm ngày tuổi khác không khác mặt thống kê, nhiên số rễ trung bình có khác biệt đáng kể Số rễ trung bình có xu hướng tăng mẫu từ – ngày sau gieo hạt có xu hướng giảm từ ngày thứ 10 Ở hai giống đậu nành, hầu hết mẫu cảm ứng tạo rễ từ – 10 ngày sau lây nhiễm vi khuẩn Kết Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển - Số (2018) Hình Hạt đậu nành DT84 gieo môi trường B5 ngày tuổi khác (a) ngày tuổi; (b) ngày tuổi; (c) ngày tuổi; (d) ngày tuổi; (e) ngày tuổi; (f) 10 ngày tuổi www.journal.hcmuaf.edu.vn 119 Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Bảng Số rễ tạo thành tỉ lệ tạo rễ mầm đậu nành ngày tuổi khác Ngày tuổi 10 HLĐN29 Số rễ Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) 5,32➧0,95 100,00 5,65➧1,10 93,33 6,70➧0,95 91,67 8,39➧1,49 90,00 5,93➧0,57 88,33 CV(%) = 17,5; CV(%) = 2,98; F = 3,60ns F = 1,95ns ➧ Số rễ 3,33b ➧1,58 4,67b ➧1,99 5,92ab ➧0,94 8,33a ➧0,46 5,40ab ➧0,17 CV(%) = 22,2 F = 6,65** DT84 Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) 93,33 95,00 91,67 91,67 88,33 CV(%) = 3,32; F = 0,49ns Số liệu trình bày dạng Trung bình SD (Độ lệch chuẩn); CV: hệ số biến thiên; kí tự a, b, c thể khác biệt mặt thống kê; ∗ khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) ; ∗∗ khác biệt có ý nghĩa (α=0,01) 3.3 Ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A.rhizogenes đến hiệu cảm ứng tạo rễ mẫu đậu nành Cách thức lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium lên mẫu thực vật cho kết cảm ứng tạo rễ khác Thí nghiệm thực đậu nành HLĐN29 DT84 nhằm tìm cách lây nhiễm phù hợp mẫu mầm Số rễ trung bình tỉ lệ mẫu tạo rễ ghi nhận sau lây nhiễm A.rhizogenes 14 ngày Kết Bảng cho thấy số rễ trung bình tỉ lệ mẫu tạo rễ nghiệm thức lây nhiễm trực tiếp ngâm mẫu dịch khuẩn hai giống đậu nành cao so với nghiệm thức đối chứng (ĐC1 ĐC2), khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Ở giống HLĐN29 DT84, dùng dao nhúng vào dịch khuẩn sau tạo vết thương cho tỉ lệ mẫu tạo rễ cao 98% 95% Dù vậy, kết không khác biệt so với phương pháp ngâm mẫu tạo vết thương dịch khuẩn Kết tương tự với nghiên cứu AL-Yozbaki ctv (2015) tạo rễ tóc đậu nành sử dụng A.rhizogenes R1000 Số rễ trung bình hai cách lây nhiễm không khác biệt mặt thống kê 3.4 Khẳng định rễ chuyển gen Gen rol C tồn vùng T-DNA A.rhizogenes tồn mẫu rễ chuyển gen Gen vir D tồn Ri plamsid, nhiên nằm vùng T-DNA nên gen không chuyển vào gen thực vật DNA mẫu rễ giả định chuyển gen ly trích thực PCR để kiểm tra diện gen rol C vir D để khẳng định kết chuyển gen www.journal.hcmuaf.edu.vn Hình Kết kiểm tra diện gen Golgin 84 (A), gen rol C (B) gen vir D (C) dòng rễ giả định chuyển gen (1, 2, 3) rễ không chuyển gen (-) (+) DNA plasmid A.rhizogenes ATCC15834; M1, M2: DNA ladder 100 bp kb (Bioline); (D) Rễ đậu nành giả định chuyển gen rễ đối chứng (E) Gen Golgin 84 gen thường trực đậu nành sản phẩm khuếch đại từ gen có kích thước 121 bp (Marcolino-Gomes ctv, 2015) Hình 3A cho thấy mẫu DNA ly trích từ dịng rễ tóc giả định chuyển gen sử dụng cho phản ứng khuếch đại DNA Các mẫu DNA tiếp tục khuếch đại với cặp primer đặc hiệu cho gen rolC để kiểm tra kết chuyển gen (Hình 3B) Kết điện di cho thấy mẫu rễ tóc phân tích xuất băng nằm vạch 600 bp 400 bp thang DNA chuẩn tương tự sản phẩm PCR từ plasmid A.rhizogenes ATCC15834, phù hợp với kích thước sản phẩm dự kiến 535 bp Trong đó, khuếch đại với cặp primer đặc hiệu cho gen virD, có mẫu Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển - Số (2018) 120 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Bảng Số rễ trung bình tỉ lệ tạo rễ mẫu mầm đậu nành sau lây nhiễm A.rhizogenes theo hai cách khác Cách lây nhiễm Trực tiếp ĐC1 Ngâm mẫu ĐC2 HLĐN29 Số rễ (➧ SD) 8,74a ➧1,47 3,79b ➧0,55 6,68a ➧1,15 4,15b ➧0,21 CV(%)=14,1; F = 24,07∗∗ Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) 98,3a 70,0c 91,7ab 71,7bc CV(%)=13,4; F = 6,76∗ Số rễ (➧ SD) 7,07a ➧0,11 5,28b ➧0,03 7,26a ➧0,27 4,54c ➧0,19 CV(%)=2,88 ; F = 177,43∗∗ DT84 Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) 95,0a 78,3b 91,7a 76,7b CV(%)= 3,57 ; F = 6,99∗ SD (Độ lệch chuẩn); CV: hệ số biến thiên; kí tự a, b, c thể khác biệt mặt thống kê; ∗ khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) ; ∗∗ khác biệt có ý nghĩa (α=0,01) đối chứng dương tạo sản phẩm PCR ( 438 bp) mẫu phân tích cho kết âm tính (Hình 3C) Kết phân tích DNA cho thấy mẫu rễ kiểm tra chuyển gen từ A.rhizogenes ATCC15834 Kết Luận Nghiên cứu xác định số điều kiện thích hợp chuyển gen vi khuẩn A.rhizogenes hai giống đậu nành HLĐN29 DT84 Lá mầm cảm ứng tạo rễ tốt trụ hạ diệp lây nhiễm A.rhizogenes ATCC15834 ATCC11325 Hiệu tạo rễ lây nhiễm vi khuẩn trực tiếp ngâm mẫu dịch khuẩn tương đương Kết nghiên cứu ứng dụng tạo đậu nành chuyển gen nhờ vi khuẩn A.rhizogenes Lời Cảm Ơn Nhóm nghiên cứu cảm ơn TS Nguyễn Như Nhứt cung cấp A.rhizogenes chủng C25 Cảm ơn Sở Khoa học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ - Thành Đồn Thành phố Hồ Chí Minh cấp kinh phí cho nghiên cứu Đề tài thuộc Chương trình Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ Trẻ năm 2016 Tài Liệu Tham Khảo [1] AL-Yozbaki G.S.H., Rasheed J.H., Salih S.M., 2015 Transformation of Soybean (Glycine max L.) Via GUS – Labeled Agrobacterium rhizogenes R1000 International Journal of Science and Technology 4(6):267 – 272 Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển - Số (2018) [2] Cao D., Hou W., Song S., Sun H., Wu C., Gao Y., and Han T., 2009 Assessment of conditions affecting Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean Plant Cell, Tissue and Organ Culture 96: 45-52 [3] Cho H.J., Farrand S.K., Noel G.R., and Widholm J.M., 2000 High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode Planta 210:195-204 [4] Collier R., Fuchs B., Walter N., Kevin L.W and Taylor C.G., 2005 Ex vitro composite plants: An inexpensive, rapid method for root biology Plant J 43:449-457 [5] Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K., 1968 Nutrient requirement of suspensions cultures of soybean root cells Experimental Cell Research 50:151-158 [6] Fattahi M., Nazeri V., Torras-Claveria L., Sefidkon F., Cusido R M., Zamani Z., and Palazon J., 2013 A new biotechnological source of rosmarinic acid and surface flavonoids: hairy root cultures of Dracocephalum kotschyi Boiss Industrial crops and Products 50:256-263 [7] Hayashi T., Banba M., Shimoda Y., Kouchi H., Hayashi M., Imaizumi-Anraku H., 2010 A dominant function of CCaMK in intracellular accommodation of bacterial and fungal endosymbionts Plant J 63:141–154 [8] Hernandez-Garcia C.M., Bouchard R A., Rushton P.J., Jones M.L., Chen X., Timko M P., & Finer J.J., 2010 High level transgenic expression of soybean (Glycine max) www.journal.hcmuaf.edu.vn Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh [9] [10] [11] [12] 121 GmERF and GmUBI gene promoters iso- [16] Olhoft P M., Flagel, L X., Donovan, C M., lated by a novel promoter analysis pipeline and Somers, D A., 2003 Efficient soybean BMC Plant Biology 10(1), 237, http:// transformation using hygromycin B selecdoi.org/10.1186/1471-2229-10-237 tion in the cotyledonary-node method Planta 216(5): 723–735 Homrich M S., Wiebke-Strohm B., Weber R L M., and Bodanese-Zanettini M [17] Olhoft P M., Bernal L M., Grist L B., H., 2012 Soybean genetic transformation: Hill D S., Mankin S L., Shen Y., KalogerA valuable tool for the functional study of akis M., Wiley H., Toren E., Song H.genes and the production of agronomically S., Hillebrand H., Jones T., 2007 A novel improved plants Genetics and Molecular BiAgrobacterium rhizogenes-mediated transforology 35(4 Suppl) 998-1010 mation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from ISAAA, 2016 Global Status of Commercialseedlings In Vitro Cell & Dev Biol Plant ized Biotech/GM Crops: 2016 ISAAA Brief 43: 536–549 No 52 ISAAA: Ithaca, NY [18] Ozyigit I I., Dogan I., and Artam Tarhan Karmarkar S H, Keshavachandran R., E., 2013 Agrobacterium rhizogenes-Mediated Nazeem P A and Girija D., 2001 Hairy root Transformation and Its Biotechnological Apinduction in Adapathiyan (Holostemma adaplications in Crops In K R Hakeem, P Ahkodien K Schum.) Journal of Tropical Agrimad and M Ozturk (Eds.), Crop Improveculture 39:102-107 ment: New Approaches and Modern Techniques (pp 1-48) Boston, MA: Springer US Kereszt A., Li D., Indrasumunar A., Nguyen C D T, Nontachaiyapoom S., Kinkema [19] Savka M A., Ravillion B., Noel G R., M., Gresshoff P M., 2007 Agrobacterium and Farrand S K., 1990 Induction of hairy rhizogenes-mediated transformation of soyroot on cultivated soybean genoptypes and bean to study root biology Nat Protoc their use to propagate soybean cyst nema2:948–952 tode Phyto 80: 503 – 508 [13] Krishnan H B., 2005 Engineering Soybean [20] Subramanian A., Tamayo P., Mootha V K., for Enhanced Sulfur Amino Acid Content Mukherjee S., Ebert B L., Gillette M A., Crop Science 45(2):454-461 Mesirov J P., 2005 Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for in[14] Li J., Todd T T and Trick H N., 2010 terpreting genome-wide expression profiles Rapid in planta evaluation of root expressed Proceedings of the National Academy of Scitransgenes in chimeric soybean plants Plant ences 102(43): 15545-15550 Cell Rep 29:13-123 [15] Marcolino-Gomes J., Rodrigues F A., [21] Tazeen S., and Mirza B., 2004 Factors affecting Agrobacterium tumefaciens mediated Fuganti-Pagliarini R., Nakayama T J., genetic transformation of Vigna radiata (L.) Ribeiro Reis, R., Bou¸cas Farias, J R., Wilczek Pak J Bot 36(4):887-896 Nepomuceno, A., 2015 Transcriptome-wide identification of reference genes for ex- [22] Trần Văn Điền, 2007 Giáo trình đậu pression analysis of soybean responses to tương Trường Đại học Nông Lâm Thái drought stress along the day PLOS ONE Nguyên Nhà Xuất Bản Nông nghiệp Hà Nội 10(9), e0139051, https://doi.org/10 1371/journal.pone.0139051 www.journal.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp Phát triển - Số (2018) ... 3.1 Sự phù hợp chủng A .rhizogenes loại mẫu cảm ứng tạo rễ đậu nành Tỉ lệ mẫu tạo rễ số rễ trung bình nghiệm thức sau giai đoạn loại bỏ vi khuẩn 14 ngày thể Bảng Bảng Tỉ lệ mẫu tạo rễ số rễ trung... nhiễm vi khuẩn vùng rễ (Li ctv, 2010), ngồi chúng cịn 2.3 Lây nhiễm vi khuẩn cảm ứng tạo rễ biểu gen RNAi im lặng (Subramanian ctv, 2005) Hiệu tạo rễ tóc đậu nành Mẫu đậu nành lây nhiễm A .rhizogenes. .. điều kiện thích hợp chuyển gen vi khuẩn A .rhizogenes hai giống đậu nành HLĐN29 DT84 Lá mầm cảm ứng tạo rễ tốt trụ hạ diệp lây nhiễm A .rhizogenes ATCC15834 ATCC11325 Hiệu tạo rễ lây nhiễm vi khuẩn