Xác định một số nấm gây bệnh trên trứng cá bá chủ (Pterapogon kauderni) trong quá trình ấp bằng phương pháp PCR và SEM

Nghiên cứu này tập trung phân lập và định danh chủng nấm từ mẫu bệnh phẩm thu nhận từ 4 mẫu trứng cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) bị hỏng trong quá trình ấp trứng và xác định sự tái nhiễm lại nấm với mẫu trứng cá thông qua kĩ thuật SEM (Scanning Electron Microscope). Kết quả hình thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử cho thấy có 3 chủng nấm sợi (M1, M1.1 và M4.1).

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN TRỨNG CÁ BÁ CHỦ (Pterapogon kauderni) TRONG QUÁ TRÌNH ẤP BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ SEM Nguyễn Thị Thủy Tiên1, Võ Minh Sơn2, Lê Quỳnh Loan3, Nguyễn Hồng Dũng3, Hồng Quốc Khánh3, Ngơ Đức Duy3* TÓM TẮT Nghiên cứu tập trung phân lập định danh chủng nấm từ mẫu bệnh phẩm thu nhận từ mẫu trứng cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) bị hỏng trình ấp trứng xác định tái nhiễm lại nấm với mẫu trứng cá thông qua kĩ thuật SEM (Scanning Electron Microscope) Kết hình thái học khuẩn lạc, khuẩn ty bào tử cho thấy có chủng nấm sợi (M1, M1.1 M4.1) Chủng M1.1 có khả thuộc chi Fusarium, chủng M1 thuộc chi Lecanicillium chủng M4.1 thuộc chi Neurospora Kết thu nhận gene DNA nhân vùng bảo tồn ITS chủng M1.1, M1 M4.1 với so sánh liệu gene chủng ngân hàng gene NCBI cho thấy chủng M1.1 có mức độ tương đồng với lồi Fusarium incarnatum 100%, chủng M1 có mức độ tương đồng với loài Lecanicillium tenuipes 100% tương tự chủng M4.1 với loài Neurospora crassa 99% Cảm nhiễm chủng nấm với trứng cá Bá Chủ thông qua kỹ thuật hình ảnh SEM ghi nhận có chủng Neurospora crassa có khả xâm nhiễm vào trứng cá Bá Chủ gây hỏng trứng trình ấp Từ kết nghiên cứu cho thấy nấm Neurospora crassa có khả gây bệnh làm hỏng trứng cá Bá Chủ Từ khóa: cá Bá Chủ, trứng cá, gene ITS, nấm, SEM I MỞ ĐẦU Việt Nam có tiềm lớn cho phát triển cá cảnh thuộc vùng khí hậu nhiệt đới, nguồn lợi thủy sinh tự nhiên phong phú đa dạng, đặc biệt phù hợp cho sinh sản phát triển loài cá cảnh Tuy nhiên, hầu hết loài cá biển đánh bắt ngồi tự nhiên hóa chất dẫn đến nhiều lồi cá có nguy tuyệt chủng nằm sách đỏ Cá Bá chủ (Pterapogon kauderni) thuộc họ cá Sơn Apogonidae, nhiên di truyền loài cá tiến hố nhánh khác có tên khoa học riêng biệt (Cites, 2007) loài cá phân bố đảo Banggai, Indonesia (Vagelli, 2007) Với màu sắc đẹp dễ nuôi nên cá Bá Chủ người chơi cá cảnh giới ưa chuộng Cá Bá chủ khai thác mức tự nhiên liệt vào danh sách đỏ tổ chức IUCN (International Union for Conservation of Nature and Natural Resources) Ngồi ra, q trình xây dựng quy trình sinh sản bể, nấm bệnh tác nhân gây hư hỏng trứng cá làm tỉ lệ trứng nở giảm mạnh, ảnh hưởng nghiêm trọng đến quy trình sản xuất Do vậy, việc xác định chủng nấm gây bệnh trứng cá Bá Chủ nhằm tìm biện pháp khắc phục mang tính cấp thiết Hiện nay, cá Bá Chủ ưa chuộng xuất nhiều nước thuộc Châu Âu, Mỹ Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh *Email: ngoduy007itb@gmail.com 58 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Châu Á với mục đích phục vụ cho người chơi cá cảnh Do nhu cầu tiêu thụ loài cá tăng giới Ở Việt Nam có tiềm lớn cho phát triển cá cảnh có khí hậu nhiệt đới phù hợp với nguồn lợi thủy sinh tự nhiên phong phú đa dạng hệ thống kênh, sông 3.000 km bờ biển trải dài điều kiện thuận lợi cho phát triển nghề cá cảnh, đặc biệt phù hợp cho sinh sản phát triển loài cá cảnh nhiệt đới Người chơi cá cảnh nước ta có xu hướng chuyển dần sang chơi lồi cá cảnh biển chúng có nhiều màu sắc đẹp, đa dạng thành phần loài Cá Bá Chủ lồi có giá trị kinh tế cao, chúng có màu sắc đẹp dễ nuôi nên người chơi cá cảnh ngày ưa chuộng Điều giúp gia tăng số lượng giá trị cá nhân nuôi sinh sản nhân tạo làm giảm áp lực cho nguồn cá tự nhiên, đồng thời đem lại nguồn lợi to lớn cho nghề nuôi trồng cá cảnh nước ta Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh nấm động vật thủy sản số loài nấm bất toàn thuộc giống Fusarium, Acremonium, Plectosporium, Ochroconis, Phoma, Exophiala nhóm nấm thủy mi Saprolegnia, Achlya, Leptolegnia Aphanomyces tác nhân gây bệnh động vật thủy sản Trong bệnh chủ yếu thủy sản bệnh nấm Thủy Mi (Saprolegnia, Aphanomyces Achlya) (Yanong, 2003), bệnh nấm Lagenidium (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004), bệnh nấm Haliphthoros Plectosporium (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2005) bệnh nấm Fusarium (Khoa và ctv., 2004) Riêng cá Bá Chủ phát lần vào năm 1996 xem loài cá có khả kháng bệnh tốt Tuy nhiên, từ năm 2002-2003 đến có số báo cáo từ người nuôi cá cảnh chết đột ngột cá Bá chủ đánh bắt từ tự nhiên Triệu chứng bệnh ghi nhận sau: chúng trở nên biếng ăn, thái độ thờ bất bình thường, màu sắc trở nên đen sậm cách rõ ràng sau vài ngày, cá chết (Vagelli, 2011) Đến năm 2005, virus thuộc loài Megalocytivirus (thuộc họ Iridoviridae) phát nguyên nhân gây bệnh cho P kauderni (Weber et al., 2009) Iridovirus gây bệnh cho cá Bá chủ (BCIV) có liên quan gần gũi với virus gây bệnh hoại tử lách thận (ISKNV) loài Megalocytivirus gây bệnh cho cá vền biển đỏ, cá vền đá, cá đù vàng lớn cá Mú chấm cam (Weber et al., 2009) Loài Megalocytivirus loài virus gây bệnh nguy hiểm với tỉ lệ gây chết lên đến 100% Chúng ghi nhận tác nhân gây bệnh số loài cá biển cá nước kể cá cảnh xuất từ vùng biển Nam Trung Quốc vài nước Đông Nam Á (Wang et al., 2007) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nhiễm nấm bệnh trứng giai đoạn ấp trứng Vì nghiên cứu nhằm xác định nấm gây hỏng trứng trình ấp trứng cá Bá Chủ II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Các chủng nấm phân lập từ mẫu trứng cá Bá Chủ bị hỏng trình ấp trứng Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Vật liệu từ đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất giống cá Bá chủ (Pterapogon kauderni)” thuộc Sở Khoa Học Tp Hồ Chí Minh 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái chủng nấm sợi Quan sát hình thái học mơi trường thạch đĩa theo phương pháp làm phòng ẩm (chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc thủy tinh chữ “u” bên môi trường PDA, tất hấp khử trùng Dùng pipetman hút môi trường trải lớp thật mỏng lame, sau dùng que cấy tế bào nấm lame đậy lamelle lại, nhỏ nước cất vô trùng cho thấm giấy thấm lọc tạo độ ẩm đĩa petri, ủ đĩa nhiệt độ phòng sau ngày kiểm tra quan sát chụp ảnh kính hiển vi 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA Quy trình tách chiết DNA thực TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 59 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) Hút 200µl dịch ni cấy nấm mơi trường PDB sau ngày vào eppendorf 1,5ml, thêm vào 800µl đệm CTAB sau đem ủ 60oC 60 phút, ly tâm 1.300 rpm phút, hút dịch khoảng 600µl cho vào tube 1,5ml, thêm thể tích chloroformisoamylalcohol (24:1) tương đương với thể tích phần dịch lấy (600µl), trộn sau đem ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4oC thu dịch bên màng phân cắt Chuyển phần dịch thu vào tube 1,5ml (phần dịch khoảng 400µl) Thêm vào isopropanol lạnh (tỉ lệ thể tích 1:1) Trộn đều, để lạnh -80oC 60 phút, ly tâm 1.300 rpm 20 phút 4oC, Thu tủa rửa tủa DNA với 700µl ethanol 70%, 90%, 99% lắc nhẹ đem ly tâm 13.000 rpm phút Hịa tan tủa DNA 50µl nước cất tinh khiết, bảo quản -4oC 2.2.3 Nhân vùng gene ITS phương pháp PCR Trước tiên thành phần nhân vùng gene phản ứng PCR bao gồm; Taq DNA polymerase, mồi ITS1F, mồi ITS4R, gene DNA cá Bá Chủ Khuếch đại vùng gene ITS thực với cặp mồi ITS1-F (M.Gardes, 1993) ITS4 (T J White, 1990) cho nhóm vi nấm có trình tự ITS1F 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4R 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) Chu trình phản ứng PCR 98oC phút, 35 chu kỳ (94oC 45 giây, 55oC 50 giây, 72oC 1giây) chu kỳ 72oC kéo dài 10 phút Sau PCR, kết sản phẩm nhân đoạn gene ITS kiểm tra gel agarose 1%, với nguồn điện 100 vol thời gian 45 phút với thang 100bp (hãng Thermo) Sau nhuộm gel với Ethidium Bromide 15 phút xem kết sản phẩm PCR UV 2.2.4 Giải trình tự định danh nấm sợi Sản phẩm giải trình tự gene thực cơng ty Nam Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh Kết giải trình tự phân tích 60 thiết lập phát sinh loài phần mềm ChromasPro, MEGA 5, Seaview Ngân hàng gene NCBI 2.2.5 Cảm nhiễm Phương pháp nuôi cấy để thu bào tử: nấm nuôi cấy môi trường Peptone Yeast extract Glucose Salt Agar (PYGSA) gồm 0,125% Bacto peptone; 0,125% Bacto yeast extract; 0,3% glucose; 1,2% agar 3,8% muối); thời gian nuôi cấy 7-10 ngày tùy vào tốc độ phát triển loài nấm; ủ nhiệt độ 25°C Thu hoạch bào tử nấm cách cho 10 ml nước muối sinh lí (0,85% NaCl) tiệt trùng vào đĩa petri nuôi cấy nấm, dùng que cấy cào nhẹ bề mặt đĩa thạch bào tử tách từ khuẩn ty Sau dung dịch lọc qua phễu lọc tiệt trùng (phễu thủy tinh có lót lớp vải mùng dùng y khoa) để thu bào tử Số lượng bào tử nấm xác định cách sử dụng buồng đếm hồng cầu, xác định mật độ 5x106 bào tử/ml dùng cho thí nghiệm gây cảm nhiễm Trứng thu từ miệng cá đực (P kauderni) sau cá đẻ thụ tinh Sau trứng kiểm tra không nhiễm nấm, tiến hành bố trí thí nghiệm cảm nhiễm với chủng nấm phân lập (M1.1, M1 M4.1) phương pháp ngâm với bào tử có mật độ 5x105 bào tử/ml Sau thời gian ngâm ngày, tiến hành thu mẫu kiểm tra khả nhiễm chủng nấm phương pháp SEM 2.2.6 Phân tích hình ảnh tái nhiễm kỹ thuật hình ảnh SEM Hình ảnh SEM chụp Viện Cơng nghệ Hóa học III KẾT QUẢ 3.1 Hình thái mẫu trứng cá Bá Chủ Kết hình ảnh trứng cá Bá Chủ phát triển bình thường có màu đỏ cam (Hình 1A) sau nhiễm bệnh trứng chuyển sang màu trắng đục (Hình 1B 1C) trứng dai cứng so với trứng phát triển bình thường TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Hình ảnh mẫu trứng cá Bá Chủ, A: Mẫu trứng cá chưa bị nhiễm, B: Mẫu trứng cá nhiễm phần C: mẫu trứng cá bị nhiễm hồn tồn Độ phóng đại ảnh 20X 3.2 Kết hình thái học nấm gây hỏng trứng cá Bá Chủ Từ mẫu trứng bị hỏng trình ấp trứng Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, phân lập, làm chọn lọc chủng nấm bệnh kí hiệu M1.1, M1 M4.1 (Hình 2) Hình Hình ảnh mẫu nấm bệnh chủng M1.1, M1 M4.1 môi trường PDA 48 sợi khuẩn ty bào tử vật kính 40X TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 61 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Chủng nấm M1.1 nuôi môi trường PDA nhiệt độ 28oC thời gian 48 có kích thước khuẩn lạc 20 – 24 mm, sợi nấm màu trắng, mặt màu trắng màu vàng nhạt, mặt có màu vàng cam, hồng, rìa khuẩn lạc có dạng cưa Dựa vào hình ảnh hình thành sợi khuẩn ty cho thấy sợi có dạng phân nhánh, hình thành vách ngăn tạo tế bào phân đốt, cuống bào tử đính hình thành cấu trúc bó sợi bào tử cong với tế bào đỉnh nhọn tế bào hình chân thể bình đơn Kết hợp với hình thái khuẩn lạc cho phép kết luận sơ chủng M1.1 thuộc chi Fusarium (dựa vào hệ thống phân loại nấm CBS Course of Mycology) Tương tự với chủng nấm M1 cho thấy kích thước khuẩn lạc 12 – 15 mm, sợi nấm màu trắng dạng mặt nhung mịn, mặt màu trắng, mặt màu vàng, mép mỏng Chủng M1 có dạng sợi phân nhánh có hình thành vách ngăn tạo tế bào phân đốt Kết hợp với hình thái khuẩn lạc cho phép kết luận sơ chủng M1 thuộc vào chi Lecanicillium Còn chủng nấm M4.1 phát triển nhanh mọc tràn khắp đĩa peptri, khuẩn lạc khơng có hình dạng rõ rệt, màu trắng tơi bơng gịn Sau 48 giờ, chủng M4.1 sinh bào tử có màu vàng cam Kết hợp với hình thái khuẩn lạc cho phép kết luận sơ chủng M4.1 thuộc vào chi Neurospora (Amita Pandey, et al., 2004) 3.3 Kết thu nhận gene sản phầm PCR vùng gene ITS Sau khảo sát hình thái học, tiếp tục li trích thu nhận gene DNA theo phương pháp CTAB nhân đoạn gene ITS cặp mồi ITS1-F ITS4-R, có kết sản phẩm gel agarose 1% Hình với kích thước khoảng 500bp Hình Kết thu nhận gene (A) (B) sản phẩm PCR gene ITS chủng nấm M1.1 M1 M4.1 gel agarose 1% thang 100bp (hãng Thermo) Từ kết sản phẩm nhân vùng gene ITS, mẫu DNA gởi giải trình tự gene cơng ty Nam Khoa, sau trình tự gene sử dụng phần mềm sinh học phân tử 62 (ChromasPro, MEGA 5) BLAST liệu gene khác có ngân hàng gene NCBI Kết thu phát sinh loài (Seaview 4) (Hình 4) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gene ITS chủng phân M1, M1.1 M4.1 với chủng nấm ngân hàng gene NCBI Tiến hành so sánh vùng gene mẫu phân lập với vùng gene bảo tồn ITS chủng nấm sợi ngân hàng gene NCBI, đặc điểm hình thái học chủng tương đồng có kết sau Chủng M1.1 có mối quan hệ gần với loài Fusarium incarnatum KM519192.1, Penicillium expansum FJ008994.1 Fusarium longipes AB820724.1 có mức độ tương đồng trình tự vùng gene chủng M1.1 chủng 100% Chủng M1 có mối quan hệ gần với lồi Lecanicillium fusisporum KF766521.1 Lecanicillium tenuipes JN036556.1 với mức độ tương đồng 100% Kết so sánh trình tự gene giống nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng M1 lồi Lecanicillium tenuipes Chủng M4.1 có mối quan hệ gần với lồi Neurospora Crassa FJ360521.1, Neurospora pannonica KF881757.1 Neurospora tetrasperma FJ904922.1 với mức độ gene tương đồng 99% Kết so sánh trình tự gene 99% trình tự DNA giống với chủng kết hợp đặc điểm hình thái chủng M4.1 chủng Neurospora crassa Để kiểm chứng diện nguyên nhân gây nhiễm nấm trứng chủng nấm M1, M1.1 M1.4 trình ấp trứng cá Bá Chủ Mẫu trứng cá Bá Chủ cảm nhiễm theo phương pháp Koch (Koch, R 1876) với chủng từ hình ảnh SEM TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 63 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.4 Kết hình ảnh kĩ thuật SEM bề mặt mẫu trứng cá Bá Chủ Kết hình ảnh bề mặt trứng cá Bá Chủ chụp qua kĩ thuật SEM xem Hình Hình Hình ảnh SEM bề mặt trứng cá Bá Chủ với 100X (a) 500x (b) Hình Hình ảnh SEM bề mặt trứng cá Bá Chủ với 500X (a) 1.000X (b) mẫu nhiễm chủng nấm M4.1 Mẫu chủng M1(c) với độ phân giải 1.000x chủng M1.1 (d) với độ phân giải 1.000X Từ kết ban đầu phân lập chủng nấm M1., M1.1 M4.1 mẫu sản phẩm trứng bị hỏng tiếp tục kiểm tra nguyên 64 nhân gây hỏng thực thí nghiệm cảm nhiễm theo phương pháp Koch cho thấy có chủng nấm M1.4 gây hỏng trứng có TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II khả xâm nhiễm vào bên trứng thơng qua hình ảnh SEM bề mặt trứng bên trứng xem Hình IV THẢO LUẬN Theo kết so sánh trình tự gene đặc điểm hình thái chủng M1.1 loài Fusarium incarnatum Chủng F incarnatum phân lập từ tổn thương mang tôm sú nuôi (Penaeus monodon), vụ thu hoạch thời gian 2000 - 2002 tỉnh Nghệ An, Việt Nam Tôm bị nhiễm bệnh cho thấy dấu hiệu điển hình bệnh mang đen tỷ lệ chết khoảng tháng trước thu hoạch (Khoa ctv., 2004) Chủng L tenuipes phân lập từ 0,82% xác B piniaria tìm thấy đất phân loại nấm Keratinophylic Nó kết hợp với trùng tuyến trùng đất (Dalė Pečiulytė ctv., 2010) Kết chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M1, M1.1 M4.1 cho thấy thay đổi từ vùng không nhiễm sang vùng nhiễm nấm với độ phân giải 500X (Hình 6a) vùng nhiễm nấm với độ phân giải 1000X (Hình 6b) so sánh với bề mặt trứng mẫu khơng nhiễm chủng M1 (Hình 6c) chủng M1.1 (Hình 6d) thời gian cảm nhiễm ngày Từ hình ảnh SEM kết hình ảnh cảm nhiễm cho kết luận chủng M4.1 (Neurospora crassa) nấm có khả gây nhiễm làm hỏng trứng cá Bá Chủ giai đoạn ấp trứng so với chủng M1 M1.1 KẾT LUẬN Qua chọn lọc sơ từ mẫu trứng cá bị hỏng thu kết mẫu nấm trứng cá Bá Chủ M1.1, M1 M4.1 Kết hình thái học khuẩn lạc, khuẩn ty bào tử cho thấy chủng M1.1 có khả thuộc chi Fusarium, chủng M1 thuộc chi Lecanicillium chủng M4.1 thuộc chi Neurospora Dựa vào kết thu nhận gene DNA nhân vùng bảo tồn ITS chủng M1.1, M1 M4.1cùng với so sánh liệu gene chủng ngân hàng gene NCBI cho kết chủng M1.1 có mức độ tương đồng với lồi Fusarium incarnatum 100%, chủng M1 có mức độ tương đồng với loài Lecanicillium tenuipes 100% tương tự chủng M4.1 với loài Neurospora crassa 99% Kết cảm nhiễm chủng nấm với trứng cá Bá Chủ từ hình ảnh kĩ thuật SEM cho thấy chủng Neurospora crassa có khả xâm nhiễm vào trứng cá Bá Chủ gây hỏng trứng q trình ấp LỜI CẢM ƠN Có kết nghiên cứu này, xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, anh chị đồng nghiệp Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản II Phịng Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới hỗ trợ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Bùi Quang Tề Đỗ Thị Muội, 2004 Giáo trình Bệnh học thủy sản Đại họcThủy sản Nha Trang, 2004, NXB Nơng Nghiệp Đặng Thị Hồng Oanh Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học thủy sản Đại học Cần Thơ Trang 73 Tài liệu tiếng Anh Pandey A.,  M Gabriela Roca, Nick D Read and N Louise Glass, 2004 Role of a mitogenactivated protein kinase pathway during conidial germination and hyphal fusion in Newrospora crassa American society for Microbiology doi: 10.1128/EC.3.2.348-358.2004 Cites, 2007 Convention on international trade in endangered species of wild fauna flora Fourteenth meeting of the Conference of the Parties The Hague (N etherlvàs), 3-15 Pečiulytė D., I Nedveckytė, V DirginčiūtėVolodkienė, V Būda, 2010 Pine defoliator Bupalus piniaria L (Lepidoptera: Geometridae) and its entomopathogeneic fungi Ekologija Vol 56 No 1–2 P 34–40 IUCN, 2007 Banggai cardinalfish (Pterapogon kauderni), 2007 IUCN Red lish of threatened species IUCN The word conservation union Khoa, L V., K Hatai, T Aoki, 2004 Fusarium TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 65 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II incarnatum isolated from black tiger shrimp Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease cultured in Vietnam Journal of Fish Diseases 27: 507-515 Koch, R., 1876. Investigations into bacteria: V The etiology of anthrax, based on the ontogenesis of  Bacillus anthracis.  Cohns Beitrage zur Biologie der Pflanzen (2): 277–310 Vagelli, A., 2007 Synopsis of the biology conservation status of the Banggai cardinalfish Pterapogon kauderni Indonesian CITES Authorities, Jakarta Yanong, R P E., 2003 Fungal diseases of fish Vet Clin Exot Anim 6: 377–400 Wang, Y., Lu, L., Weng, S., Juang, J., Chan, S.-M., and He, J., 2007 Molecular epidemiology and phylogenetic analysis of a marine fish infectious spleen and kidney necrosis virus-like (ISKNVlike) virus Arch Virol 152, 763-773 Weber, S., Waltzek, T., Young, D., Twitchell, E., Gates, A., Vagelli, A., Risatti, G., Hedrick, R., and Frasca, S., 2009 Systemic iridovirus infection in the Banggai cardinalfish (Pterapogon kauderni) J Vet Diag Invest 21, 306-320 IDENTIFICATION OF FUNGI CAUSING INFECTION IN Pterapogon kauderni EGG DURING INCUBATION USING PCR AND SEM METHODS Nguyen Thi Thuy Tien1, Vo Minh Son2 , Le Quynh Loan3, Nguyen Hoang Dung3, Hoang Quoc Khanh3, Ngo Duc Duy3* ­ ABSTRACT The goal of this study is to isolate and identify fungi strains from four specimen samples of Pterapogon kauderni eggs which were infected during incubation The results were confirmed from the challenge test of fungi with eggs by technical SEM Based on morphology, mycelium and spore characteristics, three filamentous fungi strains (M1, M1.1 and M4.1) were identified The M1 strain belongs to Fusarium species, M1.1 strain belongs to Lecanicillium species and M4.1 strain belongs to Neurospora The results of sequencing analysis of ITS (Internal Transcribed Spacer) gene region of M1, M1.1 and M4.1 strains and comparison with database on NCBI (National Center for Biotechnology Information ) showed that there was 100% similarity between M1 strain and Lecanicillium tenuipes, 100% similarity between M1.1 strain and Fusarium incarnatum and 99% similarity between M4.1 strain and Neurospora crassa The results from the challenge of these three strains with Pterapogon kauderni eggs on technical SEM (Scanning Electron Microscope) pictures showed that only Neurospora crassa species can penetrate inside Pterapogon kauderni eggs during incubation It can be concluded that Neurospora crassa species may cause infection and stop the hatching of Pterapogon kauderni eggs Keywords: fish eggs, fungi, ITS gene, Pterapogon kauderni, SEM Người phản biện: TS Nguyễn Ngọc Du Ngày nhận bài: 02/11/2017 Ngày thông qua phản biện: 20/11/2017 Ngày duyệt đăng: 12/12/2017 Biotechnology Center of Ho Chi Minh City Research Institute for Aquaculture No.2 Insititute of Tropical Biology, Vietnam Academy Sciences and Technology *Email: ngoduy007itb@gmail.com 66 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 ... nhiễm nấm bệnh trứng giai đoạn ấp trứng Vì nghiên cứu nhằm xác định nấm gây hỏng trứng trình ấp trứng cá Bá Chủ II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Các chủng nấm phân lập từ mẫu trứng cá Bá Chủ. .. thuật SEM bề mặt mẫu trứng cá Bá Chủ Kết hình ảnh bề mặt trứng cá Bá Chủ chụp qua kĩ thuật SEM xem Hình Hình Hình ảnh SEM bề mặt trứng cá Bá Chủ với 100X (a) 500x (b) Hình Hình ảnh SEM bề mặt trứng. .. crassa 99% Kết cảm nhiễm chủng nấm với trứng cá Bá Chủ từ hình ảnh kĩ thuật SEM cho thấy chủng Neurospora crassa có khả xâm nhiễm vào trứng cá Bá Chủ gây hỏng trứng trình ấp LỜI CẢM ƠN Có kết nghiên