Xác định sự lây truyền dọc của virut gây bệnh dịch tả vịt từ đàn vịt sinh sản sang vịt con bằng kỹ thuật PCR và RT-PCR

Để xác định sự lây truyền dọc của virut gây bệnh dịch tả vịt (DTV) từ đàn vịt sinh sản mắc bệnh sang đàn vịt con của chúng, trong bài viết này, nhóm tác giả đã sử dụng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử PCR và RT-PCR. Mời bạn đọc tham khảo để biết thêm kết quả chi tiết.

XÁC ĐỊNH SỰ LÂY TRUYỀN DỌC CỦA VIRUT GÂY BỆNH DỊCH TẢ VỊT TỪ ĐÀN VỊT SINH SẢN SANG VỊT CON BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ RT-PCR Trần Ngọc Bích1 Jean-Luc GUERIN2 TÓM TẮT Để xác định lây truyền dọc virut gây bệnh dịch tả vịt (DTV) từ đàn vịt sinh sản mắc bệnh sang đàn vịt chúng, sử dụng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử PCR RT-PCR Kết nghiên cứu khẳng định có truyền dọc DEV từ đàn vịt sinh sản mắc bệnh dịch tả vịt sang chúng Kết kiểm chứng qua triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng xét nghiệm kỹ thuật PCR (Hansen, 2000) 148 mẫu vịt ngày tuổi trứng chết phôi thu thập từ trại sản xuất giống vịt Bắc Kinh mắc bệnh DTV xét nghiệm kỹ thuật PCR Kết xét nghiệm cho thấy tỷ lệ nhiễm DEV biến động từ đến 4,6% PCR từ 79 đến 97,3% RT-PCR với chất đánh dấu - SYBR Green Master Mix (Applied Bio Systems) Từ khóa: Vịt, Virut dịch tả vịt, Lây truyền, PCR , RT-PCR DETERMINATION OF THE VERTICAL TRASMISSION OF DUCK ENTERITIS VIRUS FROM DUCK BREEDERS TO DUCKLINGS BY USING PCR AND RT- PCR TECHNIQUES Tran Ngoc Bich and Jean-Luc GUERIN SUMMARY To confirm the vertical transmission of Duck Enteritis Virus (DEV) from duck breeders to their ducklings, we have used methods of molecular biology tests (PCR and RT-PCR) The result of investigation was confirmed to have the vertical transmission of DEV from infected duck breeders to their ducklings This result was verified through clinical symptoms, disease characteristics and PCR tests (Hansen , 2000) 148 samples of one day old ducklings and dead embryos collecting from DEV infected Peking duck reproduction farm were tested by PCR techniques Testing results indicated that DEV infected ratio varied from to 4.6 % by classical PCR technique, and from 79 to 97.3% by PCR-RT technique, with marking substance - SYBR Green Master Mix (Applied Bio Systems) Key words: Duck, DEV,Transmission, PCR, RT-PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh dịch tả vịt (Duck virus enteritis, Duck plague) bệnh truyền nhiễm lây lan mạnh gây chết cho loài thủy cầm (vịt, ngan, ngỗng số lồi thủy cầm hoang dã khác), tỷ lệ chết lên đến 100% Virut DTV thuộc loài Herpesvirus Anatid Herpesvirus 1, giống herpevirus phụ họ Alpha Herpesvirinae, họ Herpesviridae (OIE, Terrestrial Manual 2010) Virut có cấu tạo kháng nguyên đồng có nhiều chủng độc lực khác (Hess et Dardiri, 1968) Bệnh DTV thường truyền lây tiếp xúc trực tiếp đàn vịt bệnh vịt khỏe, tiếp xúc gián tiếp qua mơi trường có mầm bệnh nguồn nước, người chăn nuôi, dụng cụ chăn nuôi, Sự truyền dọc virut DTV từ đàn vịt giống sinh sản mắc bệnh DTV đến vịt chủ đề gây tranh cãi (Burgess et al., 1981) Hiện nay, phương pháp chẩn đoán kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) nhiều Khoa Nông nghiệp sinh học ứng dụng-Đại học Cần Thơ Ecole nationale vétérinaire de Toulouse ( France) I 41 nhóm nghiên cứu quốc tế Việt Nam sử dụng chẩn đoán bệnh DTV thực địa từ bệnh phẩm nội tạng phân thủy cầm nghi mắc bệnh DTV (Pritchard L.I et al.,1999 ; Samia Shawky et al., 2002, Kim Van Phuc et al., 2004 ; Han Xian-jie et al., 2006 ; Trần Đình Từ et al., 2004…) Tuy nhiên chưa có nghiên cứu thức truyền dọc virut DTV từ đàn vịt giống sinh sản mắc bệnh DTV đến vịt NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu Khảo sát truyền dọc virut gây bệnh DTV từ đàn vịt giống sinh sản mắc bệnh sang cách sử dụng phương pháp xét nghiệm PCR RT-PCR 2.2 Vật liệu - Mẫu phân đàn vịt giống sinh sản Bắc Kinh nghi mắc bệnh virut DTV - 51 trứng vịt ấp ngày thứ 28 30 trứng ấp bị chết phôi lấy lô từ đàn vịt giống Bắc Kinh xét nghiệm xác định mắc bệnh DTV trước phương pháp PCR, mang phịng thí nghiệm trường Thú y Quốc gia Toulouse – Cộng hòa Pháp để tiến hành xét nghiệm - 110 mẫu bệnh phẩm (phân, gan lách) thu từ 51 vịt ngày tuổi nở từ 51 trứng 38 mẫu bệnh phẩm (phân-nước trứng gan) 30 trứng chết phôi (thai) Tổng số 148 mẫu bệnh phẩm trình bày bảng - Kit High Pure PCR template Preparation kit (Roche, Germany) - Taq DNA Polymerase recombinante (Invitrogen) sử dụng phản ứng PCR, với cặp mồi DEV F – DEV R Hansen et al.,(2000) sử dụng - Hố chất đánh dấu SYBR® Green Master Mix (Applied Bio Systems) sử dụng kỹ thuật RT-PCR, cặp mồi (DEV SBF1 – DEV SBR) thiết kế phần mềm Primer3 software dựa đoạn gen 446 bp virut DTV sử dụng máy 5700 Sequence detector (Perkin-Elmer Applied Biosystems) Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu cung cấp công ty Eurogentec SA (Bỉ) Mồi Trình tự mồi (5’→ 3’) Kích thước Kỹ thuật xét nghiệm (bp) DEV-F GAAGGCGGGTATGTAATGTA Xác định DEV 446 phản ứng PCR DEV-R CAAGGCTCTATTCGGTAATG DEV-SBF1 CTCCTCCTCGCTGAGTGG Xác định DEV 76 phản ứng RT-PCR DEV-SBR AACCGCAGCACTGCTATCTT II 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu - Kỹ thuật ly tách ADN: Việc ly tách ADN virut tiến hành phòng thí nghiệm cách sử dụng Kit High Pure PCR template Preparation kit (Roche, Germany) - Phản ứng PCR: Trong nghiên cứu sử dụng cặp mồi DEV F – DEV R Hansen et al.,(2000) mô tả, với Taq DNA Polymerase recombinante (Invitrogen), sản phẩm thu từ phản ứng PCR sau chạy điện di (electrophoretis) môi trường thạch 1% đọc kết đèn cực tím (UV) -Phản ứng RT-PCR:) Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng hố chất đánh dấu SYBR ® Green Master Mix (Applied Bio Systems), cặp mồi thiết kế phần mềm Primer3 software dựa đoạn gen 446 bp đặc thù virut DEV sử dụng máy 5700 Sequence detector (Perkin-Elmer Applied Biosystems) 42 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Từ đàn vịt giống sinh sản Bắc Kinh trại chăn nuôi thực nghiệm Trường nông nghiệp Périgueux thuộc vùng Aquitaine-Pháp, nghi bị nhiễm bệnh DTV với triệu chứng bệnh tích đặc trưng bệnh tỷ lệ chết cao kéo dài, bại liệt, chảy nước mắt, tiêu chảy lỏng có màu xanh nhạt, giảm tỷ lệ đẻ… Vịt chết bị xuất huyết nhiều quan, đặc biệt loét dày cơ, xuất huyết vòng nhẫn ruột non, xuất huyết xoang miệng… (hình 1) III Hình Triệu chứng bệnh tích đàn vịt giống Bắc Kinh nghi nhiễm virut DTV Để xác định đàn vịt giống nhiễm bệnh virut DTV, lấy mẫu phân vịt giống đàn có triệu chứng bệnh tích điển hình bệnh dịch tả vịt để mang phịng thí nghiệm thực phản ứng PCR, kết chứng minh mẫu điều dương tính với virut DTV (Hình 2) 43 Ghi chú:  1, 2, 3: mẫu xét nghiệm  T+: đối chưng dương  T-: đối chứng âm  M: thang đo kích thước gen 1kpb(Invitrogen)  446 bp: kích thước đoạn gen virus DEV phát sử dụng cặp mồi miêu tả Hình ADN virut DTV chẩn đoán PCR từ đàn vịt giống nghi nhiễm bệnh Để theo dõi truyền dọc virut DTV từ đàn vịt giống mắc bệnh sang tiến hành xét nghiệm 148 mẫu bệnh phẩm vịt ngày tuổi trứng chết phôi (thai) lấy từ đàn vịt giống Bắc Kinh xác định bị nhiễm DEV, phản ứng PCR RTPCT, kết trình bày trong bảng 3, hình Bảng Kết xét nghiệm PCR RT-PCR theo loại mẫu Mẫu Số lượng Dương tính PCR Dương tính RT-PCR Số lượng (mẫu) Tỷ lệ (%) Số lượng (mẫu) Tỷ lệ (%) Phân 51 9,80 51 100 Vịt Lách 51 50 98,04 ngày tuổi Gan 75 Phân-nước 30 23 76,67 Trứng chết trứng phôi (thai) Gan 87,50 Tổng 148 3,38 137 72,30 Bảng Kết xét nghiệm PCR RT-PCR vịt trứng chết phơi Số mẫu Dương tính PCR Dương tính RT-PCR Số lượng (mẫu) Tỷ lệ (%) Số lượng (mẫu) Tỷ lệ (%) Vịt ngày tuổi 110 4,60 107 97,30 Trứng chết phôi (thai) 38 0 30 79.00 Tổng 148 3,38 137 72,30 Qua bảng 3; hình cho thấy tỷ lệ nhiễm virut DTV vịt ngày tuổi trứng chết phôi (thai) từ đàn vịt giống mắc bệnh DTV dao động từ 4,6 đến 97,3% vịt ngày tuổi từ đến 79% trứng chết phôi (thai) tùy theo phương pháp xét nghiệm Tỷ lệ nhiễm vịt ngày tuổi cao so với trứng chết phôi phương pháp xét nghiệm virut DTV có sức đề kháng kém, dể bị giảm mật độ virut trình phân hủy trứng chết phơi (thai), xét nghiệm PCR phát (0%) nhiên sử dụng phương pháp RT-PCR tỷ lệ nhiễm DTV phát tăng lên cao (79%), Real-time PCR 44 phương pháp PCR định lượng đại hoàn toàn tự động sử dụng phổ biến để xác định số lượng virut diện mẫu phân tích có độ nhạy cao, phát nhiễm virut DEV số lượng thấp (nhỏ 10 sao/mẫu) Hình Kết xét nghiệm PCR RT-PCR vịt trứng chết phôi Tỷ lệ nhiễm theo loại mẫu bảng mẫu phân ln chiếm tỷ lệ cao nhất, gan lách vịt ngày tuổi trứng chết phôi, nhiên với kỹ thuật PCR phát virut DTV mẫu phân vịt ngày tuổi với tỷ lệ 9,8% cịn loại mẫu khác khơng phát mật số virut thấp, với kỹ thuật RT-PCR loại mẫu (phân, gan, lách) phát virut DTV vịt ngày tuổi trứng chết phôi (thai) từ đàn vịt giống bị nhiễm virut DTV với tỷ lệ dao động từ 75-100% tỷ lệ nhiễm DTV trung bình 72,3% Kết hoàn toàn phù hợp với giả thuyết số nhà nghiên cứu trước bệnh dịch tả vịt virut DTV có khả lây truyền dọc từ mẹ sang (Burgess et al., 1981; JL Guerin et al., 2005) KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu khẳng định có truyền dọc virut DTV gây bệnh dịch tả vịt từ đàn vịt giống sinh sản mắc bệnh đến vịt (vịt ngày tuổi trứng chết phôi) với tỷ lệ nhiễm trung bình 72,3% kỹ thuật xét nghiệm RT-PCR Do đó, phương pháp PCR, đặc biêt RT-PCR chứng minh độ nhạy hiệu việc phát ADN virut DTV với mật số thấp RT-PCR khuyến cáo nên sử dụng nghiên cứu dịch tễ phương tiện tin cậy dùng chẩn đoán bệnh để xác định nguồn bệnh tự nhiên IV 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Burgess, E C et al (1981) "Vertical transmission of duck plague virus (DPV) by apparently healthy DPV carrier waterfowl." Avian Dis 25(4) : 795-800 Duck virus enteritis OIE terrestrial manual (2010) Chapter 2.7.10 Hansen, W R et al (2000) "Diagnosis of duck plague in waterfowl by polymerase chain reaction" Avian Dis 44(2): 266-74 Han Xian-Jie et al (2006) “Cloning and sequence of glycoprotein H of duck plague virus” Agricultural sciences in china, 5(5): 397-402 Kim Van Phuc et al (2004) “Application of the polymerase chain reaction (PCR) for the detection of duck plague virus in Vietnam” ACIAR Proceedings N°:117 Pritchard, L I et al (1999) "Development of a polymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis." Veterinary Microbiology 68(1-2) : 149-156 Samia Shawky et al (2002) “Latency sites and reactivation of duck enteritis virus” Avian diseases 46:308-313 Tran Dinh Tu et al (2004) "Isolation and identification of duck plague viruses from naturally infected ducks in Southern Viet Nam" ACIAR Proceedings N°: 117 Vũ Đình Tiếu Mai Anh (1969) "Bệnh dịch tả vịt vùng Hà Nội -Tạp chí KHKT Nơng nghiệp 12, 723–724 Nhận ngày 20-5-2012 Phản biện: 3-6-2012 46 ... sát truyền dọc virut gây bệnh DTV từ đàn vịt giống sinh sản mắc bệnh sang cách sử dụng phương pháp xét nghiệm PCR RT -PCR 2.2 Vật liệu - Mẫu phân đàn vịt giống sinh sản Bắc Kinh nghi mắc bệnh virut. .. khả lây truyền dọc từ mẹ sang (Burgess et al., 1981; JL Guerin et al., 2005) KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu khẳng định có truyền dọc virut DTV gây bệnh dịch tả vịt từ đàn vịt giống sinh sản mắc bệnh. .. mồi miêu tả Hình ADN virut DTV chẩn đoán PCR từ đàn vịt giống nghi nhiễm bệnh Để theo dõi truyền dọc virut DTV từ đàn vịt giống mắc bệnh sang tiến hành xét nghiệm 148 mẫu bệnh phẩm vịt ngày tuổi