Nghiên cứu tăng cường khả năng chịu mặn bằng chuyển ghen coda trên mô hình cây xoan ta melia azedarach l

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CƢ́U TĂNG CƢỜNG KHẢ NĂNG CHỊ U MẶN BẰNG CHUYỂN GEN CODA TRÊN MÔ HÌ NH CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cƣ́u luận văn là trung thƣ̣c và chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin trân trọng cảm ơn PGS TS Chu Hoàng Hà– Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Trƣởng phòng Công nghệ tế bào thƣ̣c vật– Viện Công nghệ Sinh học– Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôirong t suốt quá trì nh thực hiện hoàn chỉnh luận văn Qua đây, cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thƣ̣c vật – Viện công nghệ sinh học , đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và đợng viên tơi thời gian thực tập phịng Tơi cũng xin đƣợc trân trọng cảm ơn Ths Bùi Văn Thắng -Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã có nhiều đóng góp giúp hoàn thành luận văn này Tôi xin cảm ơn sƣ̣ giúp đỡ và tạo điều kiện vô cùng quý báu của Ban Giám hiệu, các thầy các cô khoa Khoa học Sự sớng , phịng Sau đại học Trƣờng Đại học khoa học – Đại học Thái Nguyên để có thể hoàn thành tốt khóa học Ći cùng tơi xin bày t ỏ lịng biết ơn đến nhƣ̃ng ngƣời thân gia đì nh và bạn bè , đồng nghiệp đã tạo điều kiện , quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên và khích lệ suốt quá trình học tập , thƣ̣c hiện nghiên cƣ́u đề tài và thƣ̣c hiện thành công luận văn này Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cƣ́u Nội dung nghiên cƣ́u Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Xoan ta (Melia azedarach L.) 1.1.1 Nguồn gốc và phân bố Xoan ta 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị sử dụng 1.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học để cải tiến giống Xoan ta 1.2 Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi môi trƣờng thực vật 1.2.1 Cơ chế chịu mặn thực vật 1.2.2 Vai trò glycine betain đối với tính chống chịu thực vật 12 1.2.3 Cơ chế sinh tổng hợp glycine betaine 13 1.2.4 Nguồn gốc và đặc điểm gen codA .15 1.3 Sử dụng gen codA cải tạo giống trồng 15 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Vật liệu nghiên cƣ́u 19 2.1.1 Vật liệu 19 2.1.2 Hóa chất .20 2.1.3 Môi trƣờng nuôi câý 21 2.1.4 Thiết bị - Máy móc 22 2.2 Phƣơng pháp nghiên cƣ́u .22 2.2.1 Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen codA 22 2.2.2 Tạo chủng vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen 29 2.2.3 Tạo Xoan ta chuyển gen mang gencodA 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 3.1 Kết nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK - codA .34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 3.2 Kết thiết kế cấu trúc vector và tạo chủng vi khuẩn mang vector chuyển gen 35 3.2.1 Kết thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121- codA .35 3.2.2 Kết biến nạp vector tái tổ hợp (pBI121-codA) vào E coli DH5α .36 3.2.3 Kết sàng lọc dòng vi khuẩn E coli DH5α mang vector tái tổ hợp 37 3.2.4 Kết biến nạp vector chuyển gen (pBI121-codA) vào A tumefaciens .39 3.2.5 Kết sàng lọc dòng A tumefaciens mang vector chuyển gen 40 3.3 Kết tạo dòng Xoan ta mang cấu trúc gen codA .42 3.3.1 Kết chuyển gen và tái sinh chồi Xoan ta chuyển gen 42 3.3.2 Kết tạo chuyển gen hoàn chỉnh (ra rễ) 45 3.3.3 Kết quả và kiểm tra chuyển gen ngoài nhà lƣới 46 3.3.4 Kết quả đánh giá sơ bợ cácdịng Xoan ta chuyển gen môi trƣờng muối.47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT AS Acetosyrigone bp Cặp base (base pair) BAP 6-benzyl adenin purine C:I Chloroform : Isoamyl alcolhol CodA Gen mã hóa Choline oxydase DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphate Gus β-Glucuronidase gene = Gen mã hoá β- Glucuronidase E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate IBA Indole - butyric acid kb kilo base (1 kb = 1000 base) LB Luria – Bertani MS Murashige and Skoog OD Mật độ quang học (Optical density) PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase SDS Sodium doecyl sulphate T-DNA Transfer – DNA = DNA chuyển TAE Tris base – Acetic acid – EDTA Ti-Plasmid Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khối u thực vật TE Tris-EDTA WT Cây không chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự các mồi nhân gen codA .20 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch tách plasmid .20 Bảng 2.3 Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 21 Bảng 2.4 Môi trƣờng nuôi vàchọn lọc Xoan ta chuyển gen 21 Bảng 2.5 Thành phần các loại môi trƣờng gây nhiễm mặn nhân tạo .22 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA .23 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng xƣ̉ lý enzyme giới hạn .24 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối gen codA với vector pBI121 26 28 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra plasmid Bảng 2.10.Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 29 Bảng 2.11 Thành phần dung dị ch tách chiết DNA .32 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra DNA tổng số 33 Bảng 3.1 Kết tái sinh chồi Xoan ta chuyển gen sau hai lần chọn lọc .42 Bảng 3.3 Khả chị u mặn của các dòng Xoan ta chuyển gencodA 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 1.1 Rừng, Xoan ta trƣởng thành Hình 1.2 Dạng hoa và xoan Hình 1.3 Chu trình sinh tổng hợp GB thực vật 14 Hình 1.4 Chu trình sinh tổng hợp GB vi khuẩn E.coli 14 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ vector tách dịng 35 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh gen codA từ sản phẩm PCR 35 Hình 3.3 Hình ảnh điện di gen codA vector pBI121-gus cắt cặp enzyme giới hạn XbaI SacI 36 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm gel gen codA và vector pBI12 mở vòng 36 Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn E coli DH5α đƣợc biến nạp plasmid tái tổ hợp mọc môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanamycin 37 Hình 3.6 Hình ảnh plasmid tái tổ hợp tách từ vi khuẩn E coli 38 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ plasmid tái tổ hợp 39 Hình 3.8 Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp pBI121-codA cắt XbaI I 39 Hình 3.9 Khuẩn lạc Agrobacterium tumefacies EHA101 biến nạp vector pBI121-codA mọc môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanaSacmycin, 50 mg/l rifamycin 40 Hình 3.10 Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp (pBI121- codA) tách chiết từ A tumefaciens 41 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân codA từ plasmid tái tổ hợp tách từ A tumefaciens 41 Hình 3.12 Mẫu Xoan ta lây nhiễm dị ch huyền phuA ̀ tumefacien 43 Hình 3.13 Mẫu Xoan ta môi trƣờng đồngnuôi cấy CCM 43 Hình 3.14 Mảnh lá chuyển gen môi trƣờng SM sau1 tuần nuôi cấy 43 Hình 3.15 Đoạn thân chuyển gen môi trƣờng SM sau tuần nuôi 43 Hình 3.16 Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 43 Hình 3.17 Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ix Hình 3.18 Chồi tái sinh từ mảnh lá chuyển gen môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.19 Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.20 Chồi Xoan ta chuyển gen tái sinh môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.21 Mảnh lá không chuyển gen(ĐC) môi trƣờng SM sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.22 Đoạn thân không chuyển gen (ĐC) môi trƣờng SM sau tuần ni cấy44 Hình 3.23 Hình ảnh chồi Xoan ta chủn gen rễ môi trƣờng PSM 45 Hình 3.24 Hình ảnh chồi Xoan ta khơng chủn gen (ĐC) môi trƣờng PSM 46 Hình 3.25 Hình ảnh xoan ta chuyển gen trồng nhà lƣới 46 Hình 3.26 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ DNA genome tách chiết từ Xoan ta chuyển gen và không chuyển gen 47 Hình 3.27 Đồ thị sinh trƣởng các dịng Xoan ta chủn gen và đới chứng môi trƣờng tái sinh có các nồng độ NaCl khác 49 Hình 3.28 Sinh trƣởng dòng Xoan ta XT20 chuyển gen codA và dịng WT khơng chủn gen mơi trƣờng tái sinh có nồng độ NaCl khác 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trên giới, nghiên cứu nâng cao tính chớng chịu đới với các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng (hạn hán, nhiễm mặn, nhiệt độ cao, nhiệt độ thấp…) đã và đƣợc tiến hành nhiều đối tƣợng trồng khác Trong lâm nghiệp, loài đƣợc sử dụng nhƣ là một loại mơ hình cho nghiên cứu giới là dƣơng (Populus sp.) Tuy nhiên, hạn chế nhất loài này đó là khó sinh trƣởng điều kiện khí hậu Việt Nam Vì vậy, việc tìm kiếm mợt lồi dễ thích ứng phổ biến để làm mơ hình cho nghiên cứu theo hƣớng quan tâm đối tƣợng lâm nghiệp trở nên cần thiết Cây Xoan ta đƣợc đánh giá một trồng quan trọng chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp nƣớc ta Hơn nữa, kết nghiên cứu bƣớc đầu việc xây dựng phƣơng pháp chuyển gen đối tƣợng xoan ta rất có triển vọng [3], [4], [8], [9], [23], [36], [37], cho phép nhà khoa học có thể tiến hành nghiên cứu cải thiện giống, đặc biệt nâng cao tính chớng chịu lồi có thể sử dụng nhƣ mợt mơ hình cho loài lâm nghiệp đặc hữu Việt Nam Những tác động bất lợi từ môi trƣờng nhƣ: hạn hán, ngập mặn, ngập úng, nhiệt độ cực đoan đã tác động mạnh mẽ đến sinh trƣởng phát triển loài trồng Cũng nhƣ các loài sinh vật khác, gặp các điều kiện bất lợi từ mơi trƣờng, thực vật có khả sinh các chế thích nghi khác để có thể tồn tại, sinh trƣởng phát triển bình thƣờng Cơ chế thƣờng gặp nhất gặp điều kiện bất lợi nƣớc đó là tăng cƣờng khả trì sức căng mô, tế bào thông qua việc tăng cƣờng tổng hợp chất nhƣ các loại đƣờng tan, loại acid amin,… để tăng áp suất thẩm thấu Glycine betaine proline hai số chất trao đổi đƣợc quan tâm tích lũy hàm lƣợng cao hợp chất gặp các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng, đặc biệt yếu tố liên quan đến áp śt thẩm thấu nợi bào Ở mợt sớ lồi thực vật bậc cao, glycine betaine đƣợc tổng hợp thông qua một chuỗi gồm hai phản ứng từ choline đƣợc chuyển hóa thành betaine aldehyde nhờ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 mM NaCl 100 mM NaCl 150 mM NaCl 200 mM NaCl Dịng XT20 Dịng WT Hình 3.28 Sinh trƣởng dòng Xoan ta XT20 chuyển gen codA dòng WT khơng chủn gen mơi trƣờng tái sinh có nồng đợ NaCl khác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã nhân dòng thành cơng gen codA từ vector tách dịng pBluesript II-codA với kích thƣớc 1,9 kb tạo đƣợc cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen codA biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101; Đã chuyển thành công cấu trúc gen codA dƣới điều khiển promoter 35S vào Xoan ta, tạo đƣợc 25 dòng Xoan ta chuyển gen; Đã kiểm tra có mặt gen codA chuyển gen PCR, cho 12 dòng Xoan ta chuyển gen dƣơng tính với gen codA; Bƣớc đầu đã đánh giá đƣợc kh ả chị u mặn của các dòng xoan ta chuyển gen ống nghiệm ; Các dịng Xoan ta chủn gen codA có khả chịu mặn tốt so với Xoan ta đối chứng khơng chủn gen dịng XT20 có khẳ chịu mặn và sinh trƣởng tốt nhất môi trƣờng nhiễm mặn Kiến nghị : Tiếp tục theo dõi và đánh giá khả chịu mặn dòng Xoan ta chuyển gen codA phƣơng pháp gây mặn nhân tạo ngoài đồng ruộng; Sử dụng cấu trúc vector chuyển gen pBI121-codA làm nguyên liệu chuyển gen cho các đới tƣợng trồng khác, nâng cao tính chớng chịu với các điều kiện bất lợi môi trƣờng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Lê Mộng Chân Lê Thị Huyên (2000), Thực Vật rừng, NXB Nông nghiệp Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà (2008), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh Xoan ta (Melia azedarach L.) thông qua phôi soma từ thân mầm phục vụ chủn gen”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2, tr 227-232 Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2011), “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa gibberellin 20 – oxidase vào Xoan ta (Melia azedarach L.) Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, (2), tr 217-222 Hồ Văn Giảng, Hà Văn Huân, Vũ Kim Dung, Chu Hoàng Hà, Bùi Văn Thắng (2011), “Tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) sinh trƣởng nhanh kỹ thuật chủn gen”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, tr 11-14 Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Hà Nội Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dịng chịu hạn lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học Quyết định số 16/2005/QĐ-BNN, việc ban hành “Danh mục loài chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo vùng sinh thái lâm nghiệp” Bùi Văn Thắng, Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Việt, Hồ Văn Giảng (2007), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh Xoan ta (Melia azedarach L.) phục vụ cho chuyển gen” Hội nghị Khoa học Toàn Quốc Nghiên cứu khoa học sống NXB KH&KT, tr 815-819 Bùi Văn Thắng (2008), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh chuyển gen thị Gus vào Xoan ta (Melia azedarach Linn) thông qua Agrobacterium tumefaciens, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 Tài liệu nƣớc 10 Ashraf M., Foolad MR (2009), “Roles of glycine betaine and proline in improving plants abiotic stress resistance”, Environmental and Experimental Botany 59, pp 206 – 216 11 Eriksson EE., Isaelsson M., Olsson O and Moritz T (2000), “Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, biomass production and xylem fiber length”, Nature Biotechnology 18, pp 784-788 12 Fan F., Ghanem M., and Gadda G., (2004), “Cloning, sequence analysis, and purification of choline oxidase from Arthrobacter globiformis: a bacterial enzyme involved in osmotic stress tolerance”, Arch Biochem Biophys 421, pp 149-158 13 Gallardo F., Fu J., Jing ZP., Kirby EG and Cánovas FM (2003), Genetic modification of amino acid metabolism in woody plants, Plant Physiology and Biochemistry 41, pp 587–594 14 Giovanni Gadda and Elien Elizabeth McAllister-Wilkins (2003), “Cloning, Expression, and Purification of Choline Dehydrogenase from the Moderate Halophile Halomonas elongata”, Applied and Environmental Microbiology, pp 2126–2132 15 Hayashi H., Alia, Mustardy L., Deshnium P., Ida M and Murata N (1997), “Transformation of Arabidopsis thaliana with codA gene for choline oxidase; accumulation of glycinebetaine and enhanced tolerance to salt and cold stress”, Plant J 12, pp 133–142 16 Huang R C., Tadera K., Yagi F., Minami Y., Okamura H., Iwagawa T and Nakatani M., (1996), "Limonoids from Melia azedarach”, Phytochemistry 43, pp 581-583 17 Itokawa H., Qiao Z., Hirobe C and Takeya K., (1995), “Cytotoxic limonoids and tetranortriterpenoids from Melia azedarach”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 43, pp 1171-1175 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 18 Kavi Kishor PB., Sangam S., Amrutha RN., Sri Laxmi P., Naidu KR., Rao KRS., Sreenath Rao S., Reddy K.J., Theriappan P., and Sreenivasulu N (2005), “Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and trantport in higher plants: its implications in plant growth and abiotic stress tolerance”, Curr Sci 88, pp 424–438 19 Mohammad SK., Xiang Y., Akira K., Masashi A, Kazuo NW (2009), “Genetic engineering of glycine betaine biosynthesis to enhance abiotic stress tolerance in plants”, Plant Biotechnology 26, pp 125–134 20 Mud S.H., and Datko A.H., (1989) “Synthesis of methylated ethanolamine moieties, Regulation by choline in Lem na”, Plant Physiology 90, pp 296-305 21 Murashige T., and Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant 15(3), pp 473-497 22 Nakayama A., Nakajima M., and Yamaguchi I (2005), “Distribution of Gibberellins and Expressional Analysis of GA 20-oxidase Genes of Morning glory during Fruit maturation” Biosci Bitechnol Biochem 69, pp 334-342 23 Nirsatmanto A and Gyokusen K., (2007), “Genetic transformation of Melia azedarach L., using Agrobacterium mediated transformation”, Journal of Forestry Research, 4(1), pp 1-8 24 Prasad KVSK., Sharmila P., Kumar PA., and Pardha Saradhi P (2000), “Transformation of Brassica juncea (L.) Czern with bacterial codA gene enhances its tolerance to salt stress”, Molecular Breeding 6, pp 489–499 25 Rathinasbapathi B., Fouand WM., Sigua CA., (2001), “b-alanine betaine synthesis in the Plumbaginaceae Purifacation and characterization of a trifunctional, S-adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase from Limonium latifolium leaves”, Plant Physiol 126, pp 1241-1249 26 Rhodes D., and Hanson AD (1993), “Quaternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants”, Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 44, pp 357–384 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 27 Sambrook J., and Russell DW (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Mannul, 1st ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 28 Sakamoto A., Alia, Murata N (1998), “Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold”, Plant Mol Biol 38, pp 1011–1019 29 Sakamoto A and Murata N., (2001), “The role of glycine betaine in the protection of plants form stress: clues from transgenic plants”, Plant, Cell and Environment 25, pp 163 – 171 30 Saneoka H., Nagasaka C., Hahn DT., Yang W-J, Premachandra GS., Joly RJ., Rhodes D (1995), “Salt tolerance containing maize of glycinebetaine-deficient and - lines”, Plant Physiol 107, pp 631–638 31 Sharry S., and Teixeira da Silva J (2006), “Effective organogenesis, somatic embryogenesis and salt tolerance induction in vitro in the persian Lilac tree (Melia azedarach L.)”, Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology 2, pp 318-324 32 Sharry S., Cabrera Ponce JL., Estrelia LH., Rangel Cano RM., Lede S., Abedini W (2006), “An alternative pathway for plant in vitro regeneration of Chinaberry – tree Meia azedarach L derived from the induction of somatic embryogenesis”, Electronic Journal of Biotechnology 9, pp.188-194 33 Subbarao, GV., Wheeler, RM., Levine, “Glycine betaine accumulation, LH., Stutte, GW (2001), ionic and water relations of red-beet at contrasting levels of sodium supply”, J Plant Physiol 158, pp 767–776 34 Szabados L., and Savouré A (2010), “Proline: a multifunctional amino acid”, Trends Plant Sci 15, pp 89-97 35 Thakur R., Rao P., and Bapat V (1998), “In vitro plant regeneration in Melia azedarach L”, Plant Cell Reports 18, pp 127-131 36 Bui Van Thang, Do Xuan Dong, Ho Van Giang, Ha Van Huan, Vu Kim Dung, Chu Hoang Ha, Le Tran Binh (2007), “An efficient protocol for Agrobacterium Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 - mediated genetic transformation of Melia azedarach L.” From Biosciene to Biotechnology and Bioindustry Bio-Ha Noi Tr 71 37 Ngo Van Thanh, Jiang Xiangning, Ha Van Huan, Nguyen Thi Hau, Ho Van Giang (2010), “Vector construction and transformation of 4Cl1 gene into Chinaberrytree (Melia azedarach L.)”, Journal of Science, Hanoi National Uni 26, pp 205-210 38 Venkatesan A., Chellappan KP (1998), “Accumulation of proline and glycine betaine in Ipomoea pescaprae induced by NaCl” Biol Plant 41, pp 271–276 39 Vila S., Gonzalez A., Rey H., and Mroginki L (2003), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature zygotic embryos of Melia azedarach (Meliaceae)”, In vitro Cell Dev Biol Plant 39, pp 283-287 40 Vila S., Gonzalez A., Rey H and Mroginski L (2005), “Plant regeneration, origin, and development of shoot buds from root segment of Melia azedarach L (Meliaceae) seedlings”, In vitro Cell Dev Biol Plant 41, pp.746-751 41 Wyn Jones RG., and Storey R (1981), Betaines In: Paleg, L.G., Atpinall, A (Eds.), “The Physiology and Biochemistry of Drought Resistance in Plants”, Academic Press, Sydney, pp 171–204 42 Xiang Yu, Akira kikuchi, Essuku Matsunaga, Yoshihiko Morishita, Kazuya Nanto, Nozomu Sakura, Hideyuki Suzuki, Daisuke Shibata, Teruhisa Shimada, Kazuo N Watanabe (2009), “Establishment of the evaluation system of salt tolerance on transgenic woody plants in the special netted-house”, Plant Biotechnology 26, pp 135-141 43 Yang, W.J., Rich PJ., Axtell JD., Wood KV., Bonham CC., Ejeta G., Mickelbart MV and Rhodes D (2003), “Genotypic variation for glycine betaine in sorghum”, Crop Sci 43, pp 162-169 44 Yu X., Kikuchi A., Matsunaga E., Morishita Y., Nanto K., Sakurai N., Suzuki H., Shibata D., Shimada T., Watanabe KN (2009), “Establishment of the evaluation system of salt tolerance on transgenic woody plants in the special netted-house”, Plant Biotechnology 26, pp 135–141 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự gen codA tổng hợp nhân tạo so sánh với tình tự gen codA có mã sớ AY304485 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 Phụ lục So sánh trình tự amino acid enzyme choline oxidase đƣợc mã hóa gen codA tổng hợp nhân tạo gen codAcó mã sớ AY304485 (NCBI) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 Phụ lục Sơ đồ cấu trúc vector pBluescript II SK-tp-codA-cmyc BsaHI TatI ScaI PsiI f1 origin 'LacZ T7/M13F Ampcillin BsaI ClaI BsgI 4000 PmlI ApaI PspOMI GS52006-2 pBSK-CoAp-SP 1000 4754 bps pUC origin BbvCI 3000 2000 CoAp-SP Tth111I AccI SalI MunI LacZ' T3/M13R BsaBI SapI XhoI AvaI EcoRV HpaI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên AgeI Van91I Acc65I KpnI http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 Seq: LOCUS GS52006-2 pBSK-CoAp-SP 4754 bp DNA CIRCULAR SYN 19-DEC-2011 DEFINITION Ligation of CoAp-SP into modified pBSK/SmaI ACCESSION GS52006-2 pBSK-CoAp-SP KEYWORDS SOURCE Unknown ORGANISM Unknown Unclassified REFERENCE (bases to 4754) AUTHORS Self JOURNAL Unpublished COMMENT SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software FEATURES Location/Qualifiers CDS 21 327 /gene="f1 origin" misc_feature 600 643 /gene="T7/M13F" CDS complement (460 648) /gene="'LacZ" CDS 655 2541 /gene="CoAp-SP" CDS complement (2547 2609) /gene="LacZ'" misc_feature complement (2565 2621) /gene="T3/M13R" misc_feature 2951 3618 /gene="pUC origin" CDS complement (3769 4626) /gene="Ampcillin" BASE COUNT 1220 a 1108 c 1180 g 1246 t ORIGIN CTGACGCGCC CTGTAGCGGC GCATTAAGCG CGGCGGGTGT GGTGGTTACG CGCAGCGTGA 61 CCGCTACACT TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG CTCCTTTCGC TTTCTTCCCT TCCTTTCTCG 121 CCACGTTCGC CGGCTTTCCC CGTCAAGCTC TAAATCGGGG GCTCCCTTTA GGGTTCCGAT 181 TTAGTGCTTT ACGGCACCTC GACCCCAAAA AACTTGATTA GGGTGATGGT TCACGTAGTG 241 GGCCATCGCC CTGATAGACG GTTTTTCGCC CTTTGACGTT GGAGTCCACG TTCTTTAATA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 301 GTGGACTCTT GTTCCAAACT GGAACAACAC TCAACCCTAT CTCGGTCTAT TCTTTTGATT 361 TATAAGGGAT TTTGCCGATT TCGGCCTATT GGTTAAAAAA TGAGCTGATT TAACAAAAAT 421 TTAACGCGAA TTTTAACAAA ATATTAACGC TTACAATTTG CCATTCGCCA TTCAGGCTGC 481 GCAACTGTTG GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT ATTACGCCAG CTGGCGAAAG 541 GGGGATGTGC TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG GTTTTCCCAG TCACGACGTT 601 GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACCCT AAGCATGGCA 661 CAAATTAACA ACATGGCACA AGGGATACAA ACCCTTAATC CCAATTCCAA TTTCCATAAA 721 CCCCAAGTTC CTAAATCTTC AAGTTTTCTT GTTTTTGGAT CTAAAAAACT GAAAAATTCA 781 GCAAATTCTA TGTTGGTTTT GAAAAAAGAT TCAATTTTTA TGCAAAAGTT TTGTTCCTTT 841 AGGATTTCAG CATCAGTGGC TACAGCCTGC ATGCACATCG ATAATATTGA AAATCTTAGT 901 GACAGAGAGT TCGACTACAT TGTTGTTGGA GGTGGTTCAG CTGGAGCTGC AGTGGCTGCA 961 CGTCTTTCTG AAGATCCTGC AGTTAGTGTT GCCTTGGTTG AAGCCGGACC TGATGACAGA 1021 GGGGTGCCAG AGGTGTTGCA GTTGGATCGT TGGATGGAAT TGCTTGAATC TGGATACGAT 1081 TGGGATTATC CAATAGAACC ACAAGAGAAT GGCAATAGTT TTATGAGGCA TGCACGTGCT 1141 AAAGTCATGG GCGGTTGTTC TTCACATAAC AGTTGCATTG CATTCTGGGC CCCAAGGGAG 1201 GATTTGGATG AGTGGGAAGC AAAATATGGT GCTACTGGCT GGAATGCTGA GGCTGCATGG 1261 CCTCTTTACA AAAGGCTTGA AACTAACGAA GATGCAGGAC CAGATGCTCC ACATCACGGA 1321 GATTCAGGGC CTGTCCACTT GATGAATGTG CCACCTAAAG ATCCAACAGG CGTAGCATTG 1381 TTGGATGCAT GCGAACAGGC CGGCATTCCT AGAGCCAAGT TTAATACCGG CACAACAGTC 1441 GTTAATGGAG CCAACTTCTT TCAGATTAAT AGAAGGGCTG ACGGGACAAG GTCATCTTCA 1501 AGTGTCTCAT ATATCCATCC AATCGTCGAG CAAGAAAACT TTACTTTGTT GACTGGTCTT 1561 AGGGCACGTC AACTTGTTTT CGACGCTGAT AGACGTTGCA CTGGGGTTGA TATAGTCGAC 1621 TCTGCCTTTG GACATACACA TAGGCTTACA GCTAGAAACG AAGTCGTACT TTCTACTGGT 1681 GCAATTGATA CACCAAAGTT GCTTATGTTG TCTGGAATCG GGCCTGCAGC ACACCTTGCT 1741 GAACATGGAA TCGAGGTGTT GGTTGACTCT CCAGGTGTAG GGGAACACCT TCAAGATCAC 1801 CCTGAAGGAG TTGTCCAGTT CGAGGCTAAA CAACCAATGG TCGCCGAATC AACCCAATGG 1861 TGGGAGATCG GTATCTTTAC TCCTACTGAA GACGGCCTTG ATAGGCCAGA CCTTATGATG 1921 CATTACGGTT CAGTCCCTTT CGATATGAAT ACTTTGAGAC ATGGGTATCC TACAACTGAG 1981 AATGGATTCT CATTGACCCC TAATGTTACA CATGCCAGGT CTAGGGGTAC TGTGAGACTT 2041 AGAAGTAGGG ACTTTAGAGA CAAGCCTATG GTTGATCCTA GATATTTCAC CGACCCAGAA 2101 GGCCACGATA TGAGAGTAAT GGTGGCAGGT ATTAGAAAGG CTAGAGAGAT TGCAGCTCAA 2161 CCTGCTATGG CTGAATGGAC CGGTAGAGAG CTTTCACCAG GAGTTGAGGC CCAAACCGAT 2221 GAAGAATTGC AGGATTATAT TCGTAAGACT CATAACACCG TTTACCACCC TGTGGGTACC 2281 GTGAGAATGG GCGCTGTGGA AGACGAGATG AGTCCACTTG ATCCTGAATT GAGAGTGAAA 2341 GGAGTGACAG GACTTAGGGT CGCAGATGCT TCAGTGATGC CTGAACATGT AACAGTTAAC 2401 CCTAATATCA CCGTGATGAT GATAGGTGAG CGTTGTGCTG ATTTGATTAG ATCAGCTAGA 2461 GCAGGGGAGA CTACCACCGC TGATGCTGAA CTTTCTGCAG CTTTGGCACA GAAACTCATC 2521 TCAGAAGAGG ATCTGAATTG ATTACGGGGG ATATCCTCGA GGTTCCCTTT AGTGAGGGTT 2581 AATTGCGAGC TTGGCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 2641 CACAATTCCA CACAACATAC GAGCCGGAAG CATAAAGTGT AAAGCCTGGG GTGCCTAATG 2701 AGTGAGCTAA CTCACATTAA TTGCGTTGCG CTCACTGCCC GCTTTCCAGT CGGGAAACCT 2761 GTCGTGCCAG CTGCATTAAT GAATCGGCCA ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG 2821 GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC 2881 GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG 2941 AAAGAACATG TGAGCAAAAG GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT 3001 GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA 3061 GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT 3121 CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC 3181 GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT 3241 TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC 3301 CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC 3361 CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG 3421 GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGAAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC 3481 AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG 3541 CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA 3601 TCCTTTGATC TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT 3661 TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG 3721 TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT 3781 CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC 3841 CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT 3901 ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG 3961 GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG 4021 CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC 4081 TACAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA 4141 ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG 4201 TCCTCCGATC GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC 4261 ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA 4321 CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC 4381 AATACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG 4441 TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC 4501 CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC 4561 AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT 4621 ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG 4681 CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC 4741 CCGAAAAGTG CCAC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 Phụ lục Thành phần môi trƣờng MS (Murashige Skoog, 1962) Nhóm Hóa chất Hàm lƣợng (mg/l) Stock đa lƣợng MS : KNO3 1900 SKOOG I (x10) NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 K2HPO4 170 CaCl2 332 Stock sắt MS: SKOOG FeSO4.7H2O 27,84 II (x100) Na2EDTA 37,24 Stock vi lƣợng MS: ZnSO4 8,6 SKOOG III (x100) H3BO3 6,2 Na2MnO4 0,25 CuSO4 0,025 CoCl2 0,025 KI 0,83 MnSO4.H2O 16,9 THÀNHPHẦN Thiamin HCl 0,1 VITAMIN CỦA Pyridoxyl HCl 0,5 MOREL Nicotinic acid 0,5 (Morel’sVitamin) Glyxin Myo-Inositol 100 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... Arabipopsis codA thaliana Arabipopsis codA codA thaliana codA kaki codA globulus) L? ??nh Lục l? ??p Nồng độ chƣa xác Lục l? ??p trọng l? ?ợng khơ codA codA codA 0.82 µmol g-1 trọng l? ?ợng tƣơi (lá) 0.1-0.3... liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TA? ?I LIỆU 1.1 Giới thiệu Xoan ta (Melia azedarach L. ) 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Xoan ta Cây Xoan ta có tên khoa học (Melia. .. trọng l? ?ợng tƣơi (l? ?) l? ?ợng tƣơi (cơ quan sinh sản) Cà chua Solanum Lục l? ??p/tế 2.0 µmol g-1 trọng Cà chua Solanum 5.3 µmol g-1 trọng codA 0.9-1.43 µmol g-1 trọng l? ?ợng tƣơi (lá) Lục l? ??p Lục