Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng vi khuẩn bacillus sp h5 có khả năng đối kháng nấm sclerotium rolefsii gây bệnh thối gốc lạc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY THÍCH HỢP CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SP H5 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM SCLEROTIUM ROLFSII GÂY BỆNH THỐI GỐC LẠC HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SP H5 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM SCLEROTIUM ROLFSII GÂY BỆNH THỐI GỐC LẠC Sinh viên thực : Nguyễn Thị Ngọc Ánh Lớp : K63CNSHB MSV : 637108 Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thanh Huyền Bộ môn : Bộ môn Công nghệ Vi sinh HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học em thực thời gian từ tháng 3/2022 đến 8/2022 hướng dẫn ThS Nguyễn Thanh Huyền Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa cơng bố nghiên cứu khác Các tài liệu trích dẫn khoá luận nêu mục tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Ánh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, bên cạnh nỗ lực thân hỗ trợ, hướng dẫn tận tình q thầy cơ, bạn bè với động viên, khích lệ từ gia đình Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban giám đốc Học viện, đội ngũ quý thầy cô, cán giảng dạy công tác truyền đạt cho em kiến thức quý giá Em đặc biệt biết ơn tồn giảng viên khoa Cơng nghệ Sinh học bên cạnh kiến thức chuyên ngành thầy, cô chia sẻ kinh nghiệm quý báu đời sống, yêu nghề với em Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Nguyễn Thanh Huyền người giúp đỡ, hướng dẫn tận tình đưa lời khuyên dẫn dắt em suốt thời gian thực khóa luận Qua đây, cảm ơn gia đình, hỗ trợ giúp đỡ động viên suốt trình học tập rèn luyện Dù cố gắng tránh khỏi sai sót Rất mong thơng cảm đóng góp ý kiến q thầy bạn để khóa luận hồn thiện Cuối cùng, xin kính chúc q thầy cô bạn sức khỏe, thành công công việc sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Ánh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x TÓM TẮT CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan lạc 2.1.1 Khái niệm lịch sử phát triển lạc 2.1.2 Đặc điểm thực vật lạc 2.1.3 Thành phần hóa học dinh dưỡng lạc 2.1.4 Đặc điểm canh tác lạc 2.1.5 Một số bệnh hại phổ biến lạc 2.1.5.1 Bệnh đốm sớm muộn 2.1.5.2 Bệnh gỉ sắt 10 2.1.5.3 Bệnh thối gốc mốc đen 11 2.1.5.4 Bệnh thối gốc lạc 11 2.2 Tổng quan nấm Sclerotium rolfsii bệnh thối gốc lạc 13 2.2.1 Tổng quan nấm Sclerotium rolfsii 13 2.2.1.1 Khái niệm phân loại 13 2.2.1.2 Đặc điểm hình thái sinh lý 13 iii 2.2.1.3 Phân bố khả gây bệnh 14 2.2.2 Tổng quan bệnh thối gốc lạc 14 2.2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh thối gốc lạc 14 2.2.2.2 Triệu chứng bệnh thối gốc lạc 15 2.2.2.3 Phạm vi gây bệnh thối gốc lạc 16 2.2.2.4 Các biện pháp phòng trừ bệnh thối gốc lạc 16 2.3 Tổng quan vi khuẩn Bacillus sp kháng nấm Sclerotium rolfsii 18 2.3.1 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus sp 18 2.3.2 Khả kháng tác nhân gây bệnh thực vật Bacillus sp 19 2.3.3 Khả kháng nấm Sclerotium rolfsii Bacillus sp 20 2.4 Tình hình nghiên cứu kiểm sốt S rolfsii thối gốc lạc nước20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 23 3.2 Đối tượng nghiên cứu 23 3.3 Thiết bị hoá chất 23 3.4 Môi trường sử dụng nghiên cứu 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Đánh giá ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 25 3.5.2 Đánh giá ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 25 3.5.2.1 Đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ dịch khuẩn H5 đến khả kháng nấm Sclerotium rolfsii 25 3.5.2.2 Đánh giá ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 26 3.5.2.3 Đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 27 3.5.2.4 Đánh giá ảnh hưởng pH đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 27 iv 3.5.2.5 Đánh giá ảnh hưởng nguồn carbon đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 27 3.5.2.6 Đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 28 3.5.3 Đánh giá khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn H5 28 3.5.4 Đánh giá khả phân giải phosphate khó tan chủng vi khuẩn H5 29 3.5.5 Đánh giá khả đối kháng nấm S rolfsii chủng H5 lạc30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết đánh giá ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 32 4.2 Kết đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 34 4.2.1 Kết đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ dịch khuẩn H5 đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii 34 4.2.2 Kết đánh giá ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 36 4.2.3 Kết đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 38 4.2.4 Kết đánh giá ảnh hưởng pH đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 39 4.2.5 Kết đánh giá ảnh hưởng nguồn carbon đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 41 4.2.6 Kết đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ đến hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 43 4.3 Kết đánh giá khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn H5 45 4.4 Kết đánh giá khả phân giải phosphate khó tan chủng vi khuẩn H5 47 v 4.5 Kết đánh giá hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng H5 lạc 49 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần môi trường sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Xây dựng đường chuẩn IAA 29 Bảng 3.3 Xây dựng đường chuẩn phosphate khó tan 30 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu suất kháng nấm S rolfsii chủng H5 lạc 31 Bảng 4.1 Kết đánh giá khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn H5 46 Bảng 4.2 Kết đánh giá khả phân giải phosphate khó tan chủng vi khuẩn H5 48 Bảng 4.3 Kết khảo sát khả đối kháng nấm S rolfsii chủng H5 điều kiện in vitro 50 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái lạc Hình 2.2 Lá lạc nhiễm bệnh đốm sớm (trái) đốm muộn (phải) Hình 2.3 Triệu chứng bệnh gỉ sắt lạc 10 Hình 2.4 Cây lạc nhiễm nấm S Rolfsii 12 Hình 2.5 Sợi nấm S rolfsii mọc đất từ gốc lạc (Arachis hypogaea) 16 Hình 4.1 Kết đánh giá ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Bacillus sp H5 đến hiệu suất kháng nấm S rolfsii 32 Hình 4.2 Hiệu suất kháng nấm ĐX4 bổ sung dịch nuôi cấy H5 loại môi trường sau ngày nuôi cấy 33 Hình 4.3 Hiệu suất kháng nấm ĐX6 bổ sung dịch nuôi cấy H5 loại môi trường sau ngày nuôi cấy 33 Hình 4.4 Kết đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ dịch khuẩn H5 đến hiệu suất kháng nấm S rolfsii 34 Hình 4.5 Hiệu suất kháng nấm ĐX4 H5 theo tỷ lệ dịch khuẩn sau ngày nuôi cấy 35 Hình 4.6 Hiệu suất kháng nấm ĐX6 H5 theo tỷ lệ dịch khuẩn sau ngày nuôi cấy 35 Hình 4.7 Kết đánh giá ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất kháng nấm S rolfsii chủng H5 37 Hình 4.8 Hiệu suất kháng nấm ĐX4 H5 theo thời gian sau ngày nuôi cấy 37 Hình 4.9 Hiệu suất kháng nấm ĐX6 H5 theo thời gian sau ngày nuôi cấy 37 Hình 4.10 Kết đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất kháng nấm S rolfsii chủng H5 38 Hình 4.11 Hiệu suất kháng nấm ĐX4 H5 theo nhiệt độ sau ngày nuôi cấy 39 viii Trần Thi Phương Thu Nguyễn Khởi Nghĩa, 2018 Phân lập tuyển chọn số dòng nấm hòa tan lân từ đất trồng lúa khơ ngập xen kẽ kết hợp bón phân hữu Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 54(9B): 23-33 Trần Bảo Trâm, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Thanh Mai, Phạm Hương Sơn, Phạm Thế Hải (2017) Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải P từ đất trồng sâm Ngọc Linh Quảng Nam, Tạp chí Khoa học cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam, 2(75), tr.80-86 10 Vi sinh vật - xác định khả sinh tổng hợp axit 3-indol- axetie (IAA) (2015) Viện Thổ Nhưỡng Nơng Hóa, Bộ Nơng Nghiệp Phát Triển Nơng Thôn Tài liệu tiếng Anh 11 Ali‐Shtayeh, M S., & Abu Ghdeib, S I (1999) Antifungal activity of plant extracts against dermatophytes mycoses, 42(11‐12), 665-672 12 Baughman, T., Dotray, P., Grichar, J., Black, M., Woodward, J., Trostle, C., & McFarland, M (2007) Texas peanut production guide Online Coop Ext Serv., Texas A&M Univ., College Station, TX 13 Birenzvige, A & Eversole, Jay & Seaver, Mark & Francesconi, S & Valdes, E & Kulaga, H (2003) Aerosol Characteristics in a Subway Environment Aerosol Science and Technology - AEROSOL SCI TECH 37 210-220 10.1080/02786820300941 14 Bric, J M., Bostock, R M and Silverstone, S E 1991 Rapid in situ assay for indol acetic acid production by bacteria immobilized on a nitro celluloso membrane Appl Environ Microbiol Feb; 57(2):535-538 15 Brigand, G (2012) Sanofi Bioindustries, Research Laboratory, Baupte, Carenton, France Industrial Gums: Derivatives, 461 54 Polysaccharides and Their 16 Chan, K & Lin Z X (2014) A worldwide yearly survey of new data in adverse drug reactions and interactions In Side Effects of Drugs Annual 17 Ciccarese, F., Frisullo, S., Amenduni, M., & Ciruli, M (1992) Biological Control of SclerotiumRolfsii Root Rot of Sugarbeet with Trichoderma Harzianum In Biological Control of Plant Diseases (pp 243-247) Springer, Boston, MA 18 Cohn, F (1872) "Untersuchungen über Bakterien" [Studies on Bacteria.] Beiträge zur Biologie der Pflanzen [Contributions to the Biology of Plants] (in German) (1): 127–224 19 Drobniewski, F A (1993) Bacillus cereus and related species Clin Microbiol Rev, 6:324–328 20 Elkahoui, S., Djébali, N., Tabbene, O., Hadjbrahim, A., Mnasri, B., Mhamdi, R., & Limam, F (2012) Evaluation of antifungal activity from Bacillus strains against Rhizoctonia solani African Journal of Biotechnology, 11(18), 4196-4201 21 Fuchs, GJ & Faruque, ASG & Khan, M & Khan, Aashif & Malek, A & Nahar, K (2002) Impact of the HKI home gardening programme on VA status in Bangladesh 2972S-2972S 22 Jamil, B., Hasan, F., Hameed, A., & Ahmed, S (2007) Isolation of Bacillus subtilis MH-4 from soil and its potential of polypeptidic antibiotic production Pak J Pharm Sci, 20(1), 26-31 23 Jacob, S., Sajjalaguddam, R R., & Sudini, H K (2018) Streptomyces sp RP1A-12 mediated control of peanut stem rot caused by Sclerotium rolfsii Journal of Integrative Agriculture, 17(4), 892–900 doi:10.1016/s20953119(17)61816-1 24 Jeong, H., Jeong, D E., Kim, S H., Song, G C., Park, S Y., Ryu, C M cộng (2012) "Draft genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus siamensis KCTC 13613T" Journal of Bacteriology 194 (15): 4148–4149 55 25 Jooste, M., Roets, F., Midgley, G F cộng (2019) Nitrogen-fixing bacteria and Oxalis – evidence for a vertically inherited bacterial symbiosis BMC Plant Biology 19 (1): 441 26 Glick B R., 1995 The enhancement of plant growth by free living bacteria Canadian Journal of Microbiology, 41 (Suppl 2): 109-114 27 Kawsar, S M Abe & Nishat, Samia & Manchur, Mohammad & Ozeki, Yasuhiro (2016) Benzenesulfonylation of Methyl α-D-Glucopyranoside: Synthesis, Characterization and Antibacterial Screening International Letters of Chemistry, Physics and Astronomy 64 95-105 10.18052/www.scipress.com/ILCPA.64.95 28 Khan, N., Martínez-Hidalgo, P., Ice, T A., Maymon, M., Humm, E A., Nejat, N., & Hirsch, A M (2018) Antifungal activity of Bacillus species against Fusarium and analysis of the potential mechanisms used in biocontrol Frontiers in microbiology, 9, 2363 29 Kotasthane A., Agrawal T., Kushwah R and Rahatkar O.V (2015) Invitro antagonism of Trichoderma spp against Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani and their response towards growth of cucumber, bottle gourd and bitter gourd European J of Plant Pathol., 141(3): 523-543 30 Krapovickas, A., Gregory, W C., Williams, D E., & Simpson, C E (2007) Taxonomy of the genus Arachis (Leguminosae) Bonplandia, 16, 7205 31 Kumari, P., Bishnoi, S K., & Chandra, S (2021) Assessment of antibiosis potential of Bacillus sp against the soil-borne fungal pathogen Sclerotium rolfsii Sacc.(Athelia rolfsii (Curzi) Tu & Kimbrough) Egyptian Journal of Biological Pest Control, 31(1), 1-11 32 Le, C N., Mendes, R., Kruijt, M., & Raaijmakers, J M (2012) Genetic and phenotypic diversity of Sclerotium rolfsii in groundnut fields in central Vietnam Plant Disease, 96(3), 389-397 56 33 Muimba-Kankolongo, A (2018) Food Crop Production by Smallholder Farmers in Southern Africa: Challenges and Opportunities for Improvement 34 Nautiyal, C.S 1999 An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms FEMS Microbiology Letters,170: 265-270 35 Oă zcan, M M (2010) Some nutritional characteristics of kernel and oil of peanut (Arachis hypogaea L.) Journal of Oleo Science, 59(1), 1-5 36 Ramesh, A., Sharma, S K., Sharma, M P., Yadav, N., Joshi, O P (2014) Inoculation of zinc solubilizing Bacillus aryabhattai strains for improved growth, mobilization and biofortification of zinc in soybean and wheat cultivated in Vertisols of central India 37 Shan, H., Zhao, M., Chen, D., Cheng, J., Li, J., Feng, Z., & An, D (2013) Biocontrol of rice blast by the phenaminomethylacetic acid producer of Bacillus methylotrophicus strain BC79 Crop Protection, 44, 29-37 38 Sharma, K K & Bhatnagar-Mathur, P (2006) Peanut (Arachis hypogaea L.) Agrobacterium Protocols, 347-358 39 Sidorova, T M., Asaturova, A M., Homyak, A I., Zhevnova, N A., Shternshis, M V., & Tomashevich, N S (2020) Optimization of laboratory cultivation conditions for the synthesis of antifungal metabolites by bacillus subtilis strains Saudi journal of biological sciences, 27(7), 1879-1885 40 Slonczewski, J L & Foster, J W (2011) Microbiology: An Evolving Science (2nd ed.) Norton 41 Subandar, I., Hakim, L., Suliansyah, I., & Syakur, S (2021) Identification of antagonistic bacteria against peanut stem rot disease (Sclerotium rolfsii Sacc.) on the peatland of Kuala Pesisir-Nagan Raya, Indonesia In IOP 57 Conference Series: Earth and Environmental Science (Vol 637, No 1, p 012063) IOP Publishing 42 Suchoszek-Łukaniuk, K., Jaromin, A., Korycińska, M., & Kozubek, A (2011) Health benefits of peanut (Arachis hypogaea L.) seeds and peanut oil consumption In Nuts and seeds in health and disease prevention (pp 873-880) Academic Press 43 Sulastri, I., Syukriani, Lily & Jamsari, Ari (2021) Optimization of antagonistic activity of the extracellular compound Serratia plymuthica UBCF_13 against phytopathogenic fungi through the addition of carbon and nitrogen IOP Conference Series: Earth and Environmental Science 741 012061 10.1088/1755-1315/741/1/012061 44 Termorshuizen, A J (2007) Fungal and fungus-like pathogens of potato In Potato biology and biotechnology (pp 643-665) Elsevier Science BV 45 Thiessen, L D., & Woodward, J E (2012) Diseases of peanut caused by soilborne pathogens in the Southwestern United States International Scholarly Research Notices, 2012 46 Tian, Z., Hou, L., Hu, M., Gao, Y., Li, D., Fan, B., & Li, S (2022) Optimization of Sporulation Conditions for Bacillus subtilis BSNK5 Processes, 10(6), 1133 47 Tu, C C., & Kimbrough, J W (1978) Systematics and phylogeny of fungi in the Rhizoctonia complex Botanical Gazette, 139(4), 454-466 48 Vaishnnave, M P., Suganya Devi, K., & Ganeshkumar, P (2020) Automatic method for classification of groundnut diseases using deep convolutional neural network Soft Computing, 24(21), 16347-16360 49 Vassiliou, E K., Gonzalez, A., Garcia, C., Tadros, J H., Chakraborty, G., & Toney, J H (2009) Oleic acid and peanut oil high in oleic acid reverse the inhibitory effect of insulin production of the inflammatory cytokine TNF-a in both in vitro and in vivo systems Lipids Health Disease, 26(8), 25 58 50 Verheye, W H (Ed.) (2010) Soils, Plant Growth and Crop ProductionVolume III EOLSS Publications 51 Wahyudi, A T., Prasojo, B J., & Mubarik, N R (2010) Diversity of antifungal compounds-producing Bacillus spp isolated from rhizosphere of soybean plant based on ARDRA and 16S rRNA HAYATI Journal of Biosciences, 17(3), 145-150 52 War Nongkhla, F., Joshi, S (2014) Epiphytic and endophytic bacteria that promote growth of ethnomedicinal plants in the subtropical forests of Meghalaya, India Revista de Biología Tropical 62 (4): 1295–1308 53 Wright, G., Wieck, L., Harden, P (2015) Peanut production guide Peanut Company of Australia 59 PHỤ LỤC Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy đến khả kháng S rolfsii ĐX4 chủng H5 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) ĐX4 Ngày Ngày Ngày MPA 1,95 ± 0,05 2,75 ± 0,05 3,3 ± 4,05 ± 0,05 4,55 ± 0,05 5,35 ± 0,05 NA 2,25 ± 0,05 3,1 ± 0,1 3,65 ± 0,15 4,1 ± 0,1 4,65 ± 0,05 6,15 ± 0,15 GCY 2,65 ± 0,05 KB 2,9 ± 0,1 TSA 2,7 ± 0,1 LB 1,25 ± 0,05 1,65 ± 0,05 1,75 ± 0,05 1,95 ± 0,05 2,35 ± 0,05 3,15 ± 0,05 2,95 ± 0,05 6,95 ± 0,05 Đối chứng Ngày Ngày Kín đĩa Kín đĩa 7,45 ± 0,05 Kín đĩa Kín đĩa 4,55 ± 0,05 5,25 ± 0,05 5,6 ± 0,1 6,1 ± 0,1 6,05 ± 0,15 7,85 ± 0,15 5,6 ± 0,1 Kín đĩa Kín đĩa Ngày Kín đĩaHạch trắng Kín đĩaHạch trắng 6,85 ± 0,05 Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy đến khả kháng S rolfsii ĐX6 chủng H5 Đường kính nấm môi trường thạch (cm) ĐX6 Ngày Ngày MPA 2,55 ± 0,05 3,3 ± 0,1 NA 2,65 ± 0,05 GCY 2,3 ± 0,1 6,0 ± 0,2 7,85 ± 0,15 Kín đĩa Kín đĩa KB 2,9 ± 0,1 5,8 ± 0,1 Kín đĩa Kín đĩa Kín đĩa TSA 3,2 ± 0,1 4,9 ± 0,1 5,55 ± 0,05 6,0 ± 6,25 ± 0,05 7,15 ± 0,05 LB 1,25 ± 0,05 1,55 ± 0,05 1,7 ± 0,1 1,9 ± 0,1 2,25 ± 0,05 2,95 ± 0,05 2,9 ± 0,05 6,9 ± 0,2 Kín đĩa Kín đĩa Đối chứng Ngày Ngày 4,05 ± 0,05 4,55±0,05 3,65 ± 0,15 4,55 ± 0,15 60 Ngày Ngày 4,9 ± 0,1 5,3 ± 0,1 5,1 ± 0,1 5,65 ± 0,05 6,05 ± 0,15 Kín đĩaHạch trắng Kín đĩaHạch trắng Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ dịch khuẩn H5 đến hiệu suất kháng nấm S rolfsii ĐX4 Đường kính nấm môi trường thạch (cm) ĐX4 Ngày Ngày Ngày Ngày 1% 2,8 ± 0,1 6,95 ± 0,05 Kín đĩa Kín đĩa 3% 2,55 ± 0,05 3,85 ± 0,15 6,5 ± 0,1 8,4 ± 0,1 5% 1,35 ± 0,05 2,25 ± 0,05 3,4 ± 0,1 7% 1,35 ± 0,05 2,15 ± 0,05 2,95 ± 0,05 9% 1,3 ± 0,1 11 % 1,15 ± 0,05 13 % 1,1 ± 0,1 1,2 ± 0,1 3,05 ± 0,05 7,05 ± 0,05 Đối chứng 1,85 ± 0,05 2,7 ± 0,1 Ngày Ngày Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Kín đĩa Kín đĩa 3,85 ± 0,05 4,35 ± 0,05 5,45 ± 0,05 3,7 ± 0,1 3,9 ± 0,1 3,25 ± 0,05 3,75 ± 0,05 5,25 ± 0,05 4,6 ± 0,1 1,55 ± 0,05 1,75 ± 0,05 1,85 ± 0,05 2,35 ± 0,05 3,15 ± 0,05 1,35 ± 0,05 1,65 ± 0,05 1,85 ± 0,05 1,85 ± 0,05 Kín đĩa Kín đĩa Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ dịch khuẩn H5 đến hiệu suất kháng nấm S rolfsii ĐX6 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) ĐX6 Ngày Ngày Ngày Ngày 1% 2,7 ± 0,1 6,75 ± 0,05 Kín đĩa Kín đĩa 3% 2,35 ± 0,05 4,2 ± 0,1 5,9 ± 0,1 5% 1,3 ± 0,1 2,3 ± 0,1 3,9 ± 0,1 7% 1,25 ± 0,05 9% 1,25 ± 0,05 11 % 1,15 ± 0,05 1,55 ± 0,05 1,65 ± 0,05 1,85 ± 0,05 2,25 ± 0,05 13 % 1,05 ± 0,05 1,35 ± 0,05 1,45 ± 0,05 1,45 ± 0,05 1,65 ± 0,05 1,65 ± 0,05 2,95 ± 0,05 7,05 ± 0,05 Đối chứng 2,05 ± 0,05 2,95 ± 0,05 1,4 ± 0,1 Ngày Ngày Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen 8,2 ± 0,1 Kín đĩa Kín đĩa 4,1 ± 0,1 4,35 ± 0,05 5,25 ± 0,1 3,7 ± 0,1 3,9 ± 0,1 4,8 ± 0,05 3,5 ± 0,1 4,15 ± 0,05 1,75 ± 0,15 3,25 ± 0,05 Kín đĩa 61 Kín đĩa 2,9 ± 0,1 Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng thời gian đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX4 chủng H5 ĐX4 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 18 h 1,55 ± 0,1 2,45 ± 0,1 3,2 ± 0,05 3,78 ± 0,025 4,65 ± 0,1 6,25 ± 0,1 24 h 1,25 ± 0,1 2,05 ± 0,1 3,15 ± 0,1 3,65 ± 0,1 4,35 ± 0,1 ± 0,05 48 h 1,3 ± 0,05 2,1 ± 0,05 3,2 ± 0,05 3,4 ± 0,05 4,2 ± 0,05 5,3 ± 0,05 72 h 2,55 ± 0,1 3,35 ± 0,1 3,75± 0,1 Đối chứng 2,85 ± 0,1 6,8 ± 0,05 Kín đĩa 4,15± 0,2 Kín đĩa 4,7 ± 0,25 5,8 ± 0,2 Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả đối kháng ĐX6 H5 ĐX6 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 18 h 1,1 ± 0,05 2,4 ± 0,05 4,05 ± 0,1 5,2 ± 0,2 24 h 1,65 ± 0,1 3,2 ± 0,2 48 h 1,3 ± 0,1 2,25 ± 0,1 3,4 ± 0,05 3,85 ± 0,1 4,15 ± 0,1 4,85 ± 0,1 72 h Đối chứng 5,8 ± 0,05 6,3 ± 0,05 3,6 ± 0,2 4,55 ± 0,1 5,05 ± 0,1 5,85 ± 0,1 2,33± 0,05 3,15 ± 0,3 3,55 ± 0,05 4,05 ± 0,1 4,4 ± 0,25 2,75 ± 0,1 6,95 ± 0,1 Kín đĩa 62 Kín đĩa 5,28 ± 0,15 Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch Hạch trắng đen Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX4 chủng H5 ĐX4 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 25 oC 2,25 ± 0,1 2,7 ± 0,2 3,55 ± 0,1 4,35 ± 0,1 5,5 ± 0,05 6,05 ± 0,1 30 oC 1,25 ± 0,1 2,2 ± 0,05 3,15 ± 0,1 3,65 ± 0,1 4,25 ± 0,1 5,25 ± 0,1 35 oC 2,1 ± 0,05 2,75 ± 0,1 3,35 ± 0,1 3,9 ± 0,2 4,45 ± 0,1 5,35 ± 0,1 2,9 ± 0,05 6,8 ± 0,05 Kín đĩa Kín đĩa Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Đối chứng Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX6 chủng H5 ĐX6 Đường kính nấm môi trường thạch (cm) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 3,4 ± 0,2 4,2 ± 0,2 5,05 ± 0,1 5,55 ± 0,1 ± 0,05 30 oC 1,2 ± 0,05 2,1 ± 0,05 3,35 ± 0,1 3,9 ± 0,05 4,2 ± 0,05 4,8 ± 0,05 35 oC 2,15 ± 0,1 3,58 ± 0,15 4,15 ± 0,1 5,65 ± 0,1 5,25 ± 0,1 Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen 25 oC 2,25 ± 0,1 Đối chứng 2,8 ± 0,2 2,75 ± 0,1 6,75 ± 0,1 Kín đĩa 63 Kín đĩa Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng pH đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX4 chủng H5 ĐX4 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày pH 1,7 ± 0,1 3,35 ± 0,1 4,35 ± 0,1 5,3 ± 0,05 6,2 ± 0,05 Kín đĩa pH 1,58 ± 0,5 2,45 ± 0,1 3,45 ± 0,1 4,25 ± 0,1 5,3 ± 0,1 6,05 ± 0,1 pH 1,3 ± 0,05 2,25 ± 0,1 3,1 ± 0,05 3,69 ± 0,1 4,2 ± 0,05 5,15 ± 0,1 pH 1,45 ± 0,1 2,3 ± 0,05 3,25 ± 0,1 3,9,5 ± 0,1 4,45 ± 0,1 5,65 ± 0,1 pH 1,65 ± 0,1 2,8 ± 0,05 3,55 ± 0,1 3,9 ± 0,1 5,25 ± 0,1 ± 0,05 2,8 ± 0,05 6,9 ± 0,05 Kín đĩa Kín đĩa Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Đối chứng Bảng 10 Kết đánh giá ảnh hưởng pH đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX6 chủng H5 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) ĐX6 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày pH 1,95 ± 0,1 3,05 ± 0,1 4,15 ± 0,1 5,2 ± 0,05 6,05 ± 0,1 8,85 ± 0,1 pH 1,8 ± 0,05 2,6 ± 0,05 3,65 ± 0,1 4,15 ± 0,1 5,0 ± 0,05 5,85 ± 0,1 pH 1,35 ± 0,1 2,25 ± 0,1 3,25 ± 0,1 3,65 ± 0,1 4,1 ± 0,05 4,63 ± 0,05 pH 1,4 ± 0,05 2,3 ± 0,05 3,55 ± 0,1 3,9 ± 0,05 4,25 ± 0,1 ± 0,05 pH 1,75 ± 0,1 3,1 ± 0,1 3,85 ± 0,1 4,15 ± 0,1 4,85 ± 0,1 5,85 ± 0,1 2,9 ± 0,05 6,8 ± 0,05 Kín đĩa Kín đĩa Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch trắng Hạch đen Đối chứng 64 Bảng 11 Kết đánh giá ảnh hưởng nguồn carbon đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX4 chủng H5 Đường kính nấm môi trường thạch (cm) ĐX4 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Alpha lac 1,85 ± 0,1 3,45 ± 0,1 4,1 ± 0,2 5,1 ± 0,2 5,7 ± 0,2 6,1 ± 0,2 Dextrin 1,9 ± 0,2 3,85 ± 0,1 5,0 ± 0,2 5,55 ± 0,1 6,1 ± 0,2 7,1 ± 0,2 Glucose 2,15 ± 0,1 3,5 ± 0,05 4,5 ± 0,05 5,15 ± 0,1 5,95 ± 0,1 6,55 ± 0,1 Saccharose 1,45 ± 0,1 2,7 ± 0,1 4,28 ± 0,05 5,35 ± 0,1 Tinh bột 1,35 ± 0,1 1,95 ± 0,1 2,95 ± 0,1 3,55 ± 0,1 4,08 ± 0,15 4,65 ± 0,1 3,35 ± 0,1 3,6 ± 0,2 Bảng 12 Kết đánh giá ảnh hưởng nguồn carbon đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX6 chủng H5 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) ĐX6 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Alpha lac 1,9 ± 0,05 3,65 ± 0,1 3,95 ± 0,1 4,8 ± 0,2 5,35 ± 0,1 5,68 ± 0,05 Dextrin 2,2 ± 0,2 4,05 ± 0,1 5,15 ± 0,1 6,1 ± 0,2 7,05 ± 0,1 Glucose 2,3 ± 0,2 4,35 ± 0,1 5,35 ± 0,3 6,55 ± 0,1 7,25 ± 0,1 7,53 ± 0,05 Saccharose ± 0,05 3,2 ± 0,2 Tinh bột Đối chứng 3,55 ± 0,1 4,0 ± 0,2 4,55 ± 0,3 7,45 ± 0,1 5,0 ± 0,2 1,55 ± 0,1 1,83 ± 0,05 2,8 ± 0,05 3,35 ± 0,1 3,85 ± 0,1 4,33 ± 0,05 2,95 ± 0,1 7,1 ± 0,1 Kín đĩa 65 Kín đĩa- Kín đĩa- Kín đĩa- Hạch Hạch Hạch đen Bảng 13 Kết đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX4 chủng H5 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) ĐX4 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Peptone 1,4 ± 0,05 2,05 ± 0,1 Tryptone 1,3 ± 0,2 2,45 ± 0,1 3,3 ± 0,1 4,7 ± 0,2 5,05 ± 0,1 6,1 ± 0,2 Cao thịt 2,35 ± 0,1 3,45 ± 0,1 3,65 ± 0,1 3,9 ± 0,2 4,3 ± 0,2 5,28 ± 0,15 (NH4)2SO4 2,3 ± 0,2 2,65 ± 0,1 3,45 ± 0,1 5,0 ± 0,05 6,25 ± 0,1 7,28 ± 0,15 NH4NO3 2,65 ± 0,1 3,75 ± 0,3 4,6 ± 0,2 5,45 ± 0,1 6,0 ± 0,05 6,85 ± 0,1 Ure 1,95 ± 0,3 2,75 ± 0,3 3,15 ± 0,3 3,65 ± 0,3 4,2 ± 0,05 5,3 ± 0,2 3,08 ± 0,15 3,55 ± 0,1 4,03 ± 0,05 4,63 ± 0,05 Bảng 14 Kết đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả đối kháng nấm S rolfsii ĐX6 chủng H5 Đường kính nấm mơi trường thạch (cm) ĐX6 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 1,88 ± 0,05 2,85 ± 0,1 3,35 ± 0,1 3,85 ± 0,1 Ngày Peptone 1,55 ± 0,1 Tryptone 1,7 ± 0,2 2,7 ± 0,2 3,15 ± 0,1 3,9 ± 0,2 4,85 ± 0,1 5,85 ± 0,1 Cao thịt 2,2 ± 0,2 3,25 ± 0,1 3,55 ± 0,1 4,1 ± 0,2 4,4 ± 0,2 4,7 ± 0,2 (NH4)2SO4 2,75 ± 0,1 3,55 ± 0,1 5,6 ± 0,2 6,1 ± 0,2 6,9 ± 0,2 7,33 ± 0,15 NH4NO3 2,95 ± 0,1 3,45 ± 0,1 4,4 ± 0,2 ± 0,05 5,85 ± 0,1 6,6 ± 0,2 Ure 2,15 ± 0,1 3,1 ± 0,2 3,45 ± 0,1 4,35 ± 0,3 4,8 ± 0,2 5,55 ± 0,1 66 4,33 ± 0,05 OD 530nm 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 0.0164x + 0.0569 R² = 0.9757 20 40 60 Nồng độ IAA (mg /l ) 80 100 Hình Đường chuẩn tương quan tuyến tính nồng độ IAA giá trị OD bước sóng 530 nm 1.4 y = 0.2317x - 0.2045 R² = 0.9891 OD820 nm 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Hoạt độ phân giải Phosphate (mg/l) Hình Đường tương quan tuyến tính hoạt độ phân giải phosphate khó tan giá trị OD bước sóng 820 nm 67 a c b e d Ngày thứ a c b d e d e d e d e Ngày thứ 11 a c b Ngày thứ 12 a c b Ngày thứ 13 a c b Ngày thứ 14 Hình Biểu lạc qua ngày bố trí thí nghiệm (a: lây nhiễm S rolfsii; b: lây nhiễm S rolfsii trước bổ sung H5; c: lây nhiễm S rolfsii sau bổ sung H5; d: bổ sung H5; e: lạc đối chứng) 68