Nghiên cứu bệnh vàng lá gân xanh (candidatus lileribacter asiaticus) trên cây có múi

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NƠNG HỌC KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH (Candidatus Liberibacter asiaticus) TRÊN CÂY CÓ MÚI Người thực : ĐỖ VĂN HÒA Mã SV : 632032 Lớp : K63BVTVA Người hướng dẫn : PGS.TS HÀ VIẾT CƯỜNG Bộ môn : BỆNH CÂY HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu báo cáo hoàn toàn trung thực chưa sử dụng, công bố báo cáo, luận văn, luận án cơng trình nghiên cứu khoa học trước Tôi xin cam đoan thơng tin trích dẫn sử dụng luận văn ghi nguồn gốc rõ ràng, đảm bảo trích dẫn theo quy định Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2022 Sinh viên Đỗ Văn Hịa i LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp tơi thầy cơ, gia đình bạn bè hướng dẫn tận tình chu đáo Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Hà Viết Cường, người trực tiếp hường dẫn cho số kỹ thuật bệnh cây, giúp vật chất, kiến thức tinh thần để hồn thành thật tốt khóa luận tốt nghiệp Khóa luận thực Trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam số vùng trồng ăn có múi huyện Văn Giang, tỉnh Hưng n Tơi nhận giúp đỡ tập thể cán Bộ môn Bệnh khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Các chị kỹ thuật viên trung tâm bệnh nhiệt đới suốt trình thực đề tài nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu dành cho Chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị bạn nhóm khóa luận nghiên cứu bệnh chia sẻ kinh nghiệm quý báu nghiên cứu giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần tơi phương diện, để tơi hồn thành tốt khóa luận Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2022 Sinh viên Đỗ Văn Hòa ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix PHẦN 1.MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu nước nước 2.1.1 Nghiên cứu nước 2.1.2 Nghiên cứu nước 2.2 Tổng quan có múi 2.2.1 Cây có múi Hưng Yên 2.3 Thành phần bệnh gây tượng vàng có múi 2.3.1 Bệnh chảy gôm (Phytophthora citrophthora citrus) 2.3.2 Bệnh tàn lụi (Citrus tristeza closterovirus, CTV) 2.3.3 Bệnh thiếu kẽm (Zinc deficiency) 2.3.4 Bệnh vàng gân xanh (Candidatus Liberibacter asiaticus) 2.4 Tổng quan bệnh vàng gân xanh (HLB) 2.4.1 Lịch sử phân bố bệnh vàng gân xanh 2.4.2 Tác nhân gây bệnh – Vi khuẩn Candidatus liberibacter (Ca.L) 11 2.4.3 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh 11 2.5 HỆ THỐNG BIỂU HIỆN VÀ CÁC KĨ THUẬT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 15 2.5.1 Hệ thống biểu 15 2.5.2 Hệ thống vector biểu 16 iii 2.5.3 Các kỹ thuật dung nghiên cứu 17 PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu 22 3.2.1 Sinh Phẩm 22 3.2.2 Các chất kháng sinh 22 3.2.3 Hóa chất 22 3.2.4 Môi trường 24 3.2.5 Các thiết bị máy chủ yếu 24 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh vàng greening mức độ phổ biến đồng ruộng 25 3.4.2 Phương pháp tách chiết DNA RNA tổng số CTAB(Doyle, 1991) 26 3.4.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 27 3.4.4 Quy trình tinh chiết DNA phương pháp NaOH(Wang, 1993) 27 3.4.5 Điện di SDS - PAGE 28 3.4.6 Phương pháp PTA- ELISA (Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immune Sorbent Assay)( Hà Viết Cường, (2020)) 29 3.4.7 Phục hồi dòng vi khuẩn Rosetta 30 3.4.8 Biế n na ̣p plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta kĩ thuật xung điện 30 3.4.9 Phương pháp gây miễn dịch thỏ 30 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Tình hình bệnh vàng gân xanh có múi Văn Giang (Hưng Yên) văn chấn (Yên Bái) năm 2022 32 4.1.1 Tình hình bệnh vàng gân xanh Văn Giang (Hưng Yên) năm 2022 32 4.1.2 Tình hình bệnh vàng gân xanh Văn Chấn (Yên Bái) năm 2022 33 iv 4.2 Đánh giá khả chẩn đoán bệnh vành gân xanh kỹ thuật PCR 34 4.2.1 Đánh giá khả phát vi khuẩn Ca.Las lá, thân, rễ cam bệnh sử dụng phương pháp chiết nhanh NaOH 35 4.2.2 Đánh giá khả phát vi khuẩn Ca.Las lá, thân, rễ cam bệnh sử dụng phương pháp chiết CTAB 37 4.3 Chẩn đoán bệnh vàng gân xanh kĩ thuật PCR mẫu thu thập miền bắc 2022 40 4.3.1 Chẩn đoán bệnh vàng gân xanh kỹ thuật PCR mẫu bưởi đầu dòng thu tỉnh Hải Dương năm 2022 40 4.3.2 Chẩn đoán bệnh vàng gân xanh kỹ thuật PCR mẫu cam thu Yên Bái năm 2022 44 4.3.3 Chẩn đoán bệnh vàng gân xanh kỹ thuật PCR mẫu cam thu Văn Giang (Hưng Yên) năm 2022 49 4.3.4 Chẩn đoán bệnh vàng gân xanh kỹ thuật PCR mẫu quýt Jeju thu Quỳ Hợp (Nghệ An) năm 2022 52 4.4 Lây nhiễm Ca.las từ cam sang dừa cạn cà chua 54 4.5 Đánh giá khả ức chế vi khuẩn ca.las kháng sinh cành cam giâm 57 4.6 Nghiên cứu tạo kháng huyết thỏ chẩn đoán Ca.Las 60 4.6.1 Chuẩn bị kháng nguyên tái tổ hợp Ca.Las 61 4.6.2 Gây miễn dịch thỏ 64 4.6.3 So sánh kháng huyết thu kỹ thuật PTA-ELISA 65 4.6.4 Đánh giá khả phát Ca Las xử lý kháng nguyên với Urea 69 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 5.1 Kết luận 72 5.2 Kiến nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 Phụ lục……………………… 99 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AP APS Ca L Ca Las Dream Taq MM CTAB CTV DNA E.coli OMP HLB TPTG OMP Kb kDa PCR RT - PCR l Ml NPP OD ELISA PTA - ELISA LB SDS-PAGE TAE TEMED β-ME Alkaline phosphate Amonium persulfate Candidatus Liberibacter Candidatus Liberibacter aseaticus Dream Taq Master Mix Cetyltrimethylammonium bromide Bệnh tàn lụi (Citrus tristeza closterovirus) Deoxyribonucleic acid Escherichia coli Outer membrain protein Huanglongbinh Isopropyl – b, D – thiogalactoside Outer membrain protein Kilo base Kilodalton Polymerase Chain Reaction Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction Microliter Mililiter Nitro Phenyl Phosphate Optical density Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Luria Bertani Sodium dedecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis Tris acetate EDTA Tetramethyl ethylenediamine β - Mercaptoethanol vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 3.3 Thành phần gel dung SDS – PAGE 28 Bảng 4.1 Điều tra bệnh vàng gân xanh cam xã Liên Nghĩa (Văn Giang – Hưng Yên) năm 2022 33 Bảng 4.2 Điều tra bệnh vàng gân xanh cam Văn Chấn (Yên Bái) năm 2022 34 Bảng 4.3 PCR phát vi khuẩn Ca Las từ loại mô cam (gân lá, thân, rễ) chiết nhanh NaOH 36 Bảng 4.4 PCR phát vi khuẩn Ca Las từ loại mô cam (gân lá, thân, rễ) chiết CTAB 38 Bảng 4.5 Kết kiểm tra PCR 23 mẫu bưởi đầu dòng làm vật liệu chọn giống thu tại Hải Dương năm 2022 42 Bảng 4.6 PCR phát Ca Las 33 mẫu cam thu thập Văn Chấn (Yên Bái) năm 2022 (kết hợp lần PCR) 45 Bảng 4.7 PCR phát Ca Las 10 mẫu cam thu thập Văn Giang (Hưng Yên) năm 2022 (kết hợp lần PCR) 50 Bảng 4.8 PCR phát Ca Las mẫu quýt Jeju thu Quỳ Hợp (Nghệ An) năm 2022 53 Bảng 4.9 Kết lây nhiễm Ca Las từ cam sang cà chua dừa cạn dây tơ hồng 56 Bảng 4.10 PCR phát Ca Las từ mọc cành giâm cam phun kháng sinh 59 Bảng 4.11 Kết cảm ứng biểu protein OMP-N OMP-C vi khuẩn E coli chủng Rosetta DE3 62 Bảng 4.12 PTA-ELISA so sánh khả phát Ca Las kháng huyết HLB-N năm 2021, 2022 66 vii Bảng 4.13 PTA-ELISA so sánh khả phát Ca Las kháng huyết HLB-C năm 2020, 2021, 2022 68 Bảng 4.14 Đánh giá ảnh hưởng xử lý Urea đến khả phát Ca Las kháng huyết HLB-N năm 2021 năm 2022 70 Bảng 4.15 Đánh giá ảnh hưởng xử lý Urea đến khả phát Ca Las kháng huyết HLB-C năm 2021 năm 2022 71 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân bố bệnh vàng gân xanh (HLB) Thế giới 10 Hình 2.2 Triệu chứng bệnh vàng gân xanh có múi vi khuẩn Ca.Las gây (Bové, 2006a; Kumar, 2018; Nehela & Killiny, 2020a) 13 Hình 2.3 Vector rầy chổng cánh châu Á (Diaphorina citri) truyền bệnh vàng gân xanh 14 Hình 2.4 Cấu trúc vector pET 28a(+) 17 Hình 4.1 PCR phát vi khuẩn Ca Las từ loại mô cam (gân lá, thân, rễ) chiết nhanh NaOH Phản ứng thực với cặp mồi OMP-N5 OMP-N3m M: Generuler kb DNA ladder (Thermo) Các giếng L1, L2, L3: số thứ tự mẫu lá; T1,T2,T3: số thứ tự mẫu thân; R1, R2, R3: Số thứ tự mẫu rễ 37 Hình 4.2 PCR phát vi khuẩn Ca Las từ loại mô cam (gân lá, thân, rễ) chiết CTAB Phản ứng thực với cặp mồi OMPN5 OMP-N3m M: Generuler kb DNA ladder (Thermo) Các giếng L1, L2, L3: số thứ tự mẫu lá; T1,T2,T3: số thứ tự mẫu thân; R1, R2, R3: Số thứ tự mẫu rễ 39 Hình 4.3 PCR 23 mẫu bưởi đầu dòng làm vật liệu chọn giống thu tại Hải Dương năm 2022 Phản ứng PCR với cặp mồi OMP-N5 OMP-N3m DNA chiết từ gân tươi phương pháp CTAB Phản ứng PCR thực ngày 16/3/2022 M: Generuler kb DNA ladder (Thermo) +Ve: Đối chứng dương (cam bệnh) – 23: số thứ tự mẫu Bảng 4.5 43 Hình 4.4 Kiểm tra băng PCR không đặc hiệu mẫu bưởi 15 Sản phẩm PCR mẫu đối chứng dương +ve (Hình 4.3) hịa loãng 10 lần với nước Thời gian điện di tăng lên 40 phút M: Generuler kb DNA ladder (Thermo) 43 ix Đối với kháng huyết HLB-C (Bảng 4.15), xử lý kháng nguyên với Urea không dẫn tới cải thiện khả phát Ca Las Giá trị OD kháng huyết khỏe bệnh khơng có thay đổi nhiều so với trước sử lý thí nghiệm Cụ thể giá trị OD cam khỏe giao động khoảng 0.199 - 0.867 với nồng độ (1/200), giá trị OD bưởi khỏe giao động khoảng 0.167 – 0.234 với nồng độ (1/200), giá trị OD chanh khỏe giao động khoảng 0.159 – 0.250 với nồng độ (1/200), giá trị OD cam bệnh giao động khoảng 0.185 – 0.806 Bảng 4.15 Đánh giá ảnh hưởng xử lý Urea đến khả phát Ca Las kháng huyết HLB-C năm 2021 năm 2022 OD (60 phút) HLB-C (2021) HLB-C (2022) Bệnh 0.5281 0.1635 Bệnh 0.8062 0.1855 Bệnh 0.4891 0.1637 Cam Trung bình 0.6078 0.1709 Độ lệch chuẩn 0.1729 0.0126 Khỏe 0.7722 0.1996 Khỏe 0.6684 0.1747 Khỏe 0.8674 0.1911 Cam Trung bình 0.7693 0.1885 Độ lệch chuẩn 0.0995 0.0127 Khỏe 0.2013 0.1673 Khỏe 0.2346 0.179 Khỏe 0.2006 0.1737 Bưởi Trung bình 0.2122 0.1733 Độ lệch chuẩn 0.0194 0.0059 Khỏe 0.2503 0.1998 Khỏe 0.1765 0.1591 Khỏe 0.182 0.1758 Chanh Trung bình 0.2029 0.1782 Độ lệch chuẩn 0.0411 0.0205 Ghi chú: Độ hòa loãng KHT: 1/200 Tỷ lệ nghiền mẫu đệm chiết 1:10; Cây Mẫu chất sở dụng dung dịch chất NPP (ready to use, Sigma) 71 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Điều tra bệnh vàng gân xanh dựa có múi, chủ yếu cam, dựa vào triệu chứng Văn Giang – Hưng Yên (đại diện vùng Đồng Bằng Sông Hồng) Văn Chấn - Yên Bái (đại diện vùng Đông Bắc) năm 2022 thấy bệnh phổ biến địa điểm Tất vườn điều tra (5 vườn Văn Giang, 11 vườn Văn Chấn) nhiễm bệnh Mức độ nhiễm bệnh địa điểm cao, trung bình 58.4 % Văn Giang 83.4 Văn Chấn Đánh giá loại mơ phương pháp chiết DNA cho chẩn đốn bệnh vàng gân xanh cho thấy mô gân phù hợp mô vỏ thân mô rễ Phương pháp chiết nhanh DNA từ mơ có múi NaOH phù hợp để chẩn đốn bệnh Phương pháp có ưu điểm nhanh, giảm thiểu nhiễm chéo mẫu 10 Kiểm tra PCR 23 mẫu bưởi đầu dòng (phần lớn không biểu triệu chứng) thu Hải Dương năm 2022 cho thấy tất mẫu không nhiễm vi khuẩn Ca Las Kiểm tra PCR 10 mẫu cam biểu triệu chứng thu Văn Giang (Hưng Yên) năm 2022 cho thấy có tới 9/10 mẫu bị nhiễm vi khuẩn Ca Las Kiểm tra PCR 33 mẫu cam, quýt biểu triệu chứng thu Văn Chấn (Yên Bái) năm 2022 cho thấy có tới 21/33 (63 %) mẫu bị nhiễm vi khuẩn Ca Las Cuối kiểm tra PCR mẫu quýt JeJu thu Quỳ Hợp (Nghệ An) năm 2022 cho thấy 3/5 mẫu bị nhiễm vi khuẩn Ca Las 11 Thí nghiệm đánh giá khả phịng chống vi khuẩn Ca Las kháng sinh với hỗ trợ chất hoạt động bề mặt cho thấy chất hoạt động bề mặt Silwett 408 không vận chuyển đủ kháng sinh ampicillin Streptomycin qua bề mặt cành cam qua lần phun 12 Thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn Ca Las từ cam sang cà chua dừa cạm tơ hồng cho thấy tơ hồng tiếp nhận dễ dàng hiệu vi khuẩn không truyền vi khuẩn sang cà chua dừa cạn 72 13 Đã sản xuất tạo kháng huyết thỏ từ nguồn protein tái tổ hợp protein OMP-N OMP-C Sử dụng qui trình PTA-ELISA thơng thường cho thấy trừ kháng huyết HLB-C (tạo năm 2021) tất kháng huyết thỏ tạo năm 2020, 2021 2022 không phản ứng với khỏe không phát Ca Las bệnh 14 Đáng ý, xử lý kháng nguyên sau cố định vào ELISA Urea 8M cải thiện đáng kể khả phát Ca Las kháng huyết HLB-N tạo năm 2021 Kháng huyết không phản ứng với dịch cam, bưởi chanh khỏe có phản ứng rõ rệt với dịch cam bệnh 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục tối ưu hóa điều kiện phản ứng PTA-ELISA nguồn kháng huyết thỏ thu được, - Tiếp tục thử nghiệm chất hoạt động bề mặt số lần xử lý nhằm phòng chống hiệu bệnh vàng gân xanh kháng sinh 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hà Viết Cường, Lê Thị Tuyết, Trần Nguyễn Hà, Nguyễn Đức Huy, Đỗ Tấn Dũng Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (2020) Tạo kháng huyết đa dòng Protein vỏ tái tổ hợp Passiflora mottle vius nhiễm chanh leo Việt Nam Trang Kiên Bush, Trần Văn Hâu, Trần Sỹ Hiếu & Huỳnh Lê Anh Nhi (2019) Ảnh hưởng Brassinolide đến bệnh vàng gân xanh, suất phẩm chất trái quýt đường (Citrus reticulata Blanco) thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang 55(3): 49-57 Hà Minh Trung (1998) Ứng dụng phương pháp vi ghép đỉnh sinh trưởng để làm bệnh số giống có múi,, Kết nghiên cứu khoa học Viện Bảo vệ thực vật Đặng Vũ Thị Thanh, Hà Minh Trung (1997), Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, tập 1, Phương pháp điều tra dịch hại trồng nông nghiệp thiên địch chúng, NXB Nông nghiệp, tr 46-57 Lê Mai Nhất (2014), Nghiên cứu bệnh vàng greening hại ăn có múi số tỉnh phía bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Tài liệu tiếng anh Bové J M (2006a) Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus Journal of plant pathology 7-37 Doyle J J N A S (1991) DNA protocols for plants Molecular techniques in taxonomy 57: 283-293 Duan Y., Gottwald T., Zhou L & Gabriel D J P d (2008) First report of dodder transmission of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ to tomato (Lycopersicon esculentum) 92(5): 831-831 10 Francischini F., Oliveira K., Astúa-Monge G., Novelli A., Lorenzino R., 74 Matiolli C., Kemper E., Da Silva A & Kitajima E J P D (2007) First report on the transmission of ‘Candidatus Liberibacter americanus’ from citrus to Nicotiana tabacum cv Xanthi 91(5): 631-631 11 Garnier M & Bové J M J P (1983) Transmission of the organism associated with citrus greening disease from sweet orange to periwinkle by dodder 73(10): 1358-1363 12 Hartung J S., Paul C., Achor D & Brlansky R J P (2010) Colonization of dodder, Cuscuta indecora, by ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ and ‘Ca L americanus’ 100(8): 756-762 13 Hocquellet A., Toorawa P., Bove J.-M & Garnier M (1999) Detection and identification of the two Candidatus liberobacter species associated with citrus huanglongbing by pcr amplification of ribosomal protein genes of theβ operon Molecular and cellular probes 13(5): 373-379 14 Hosford R M J T B R (1967) Transmission of plant viruses by dodder 33(4): 387-406 15 Jagoueix S., Bové J M., Garnier M J M & probes c (1996) PCR detection of the two «Candidatus» liberobacter species associated with greening disease of citrus 10(1): 43-50 16 Kamińska M & Korbin M J A p p (1999) Graft and dodder transmission of phytoplasma affecting lily to experimental hosts 21(1): 21-26 17 Kumar N., Kiran F & Etxeberria E (2018) Huanglongbing-induced anatomical changes in citrus fibrous root orders HortScience 53(6): 829-837 18 Laemmli U K J n (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 227(5259): 680-685 19 Nehela Y & Killiny N (2020a) Revisiting the complex pathosystem of huanglongbing: Deciphering the role of citrus metabolites in symptom development Metabolites 10(10): 409 75 20 Nehela Y & Killiny N J M (2020b) Revisiting the complex pathosystem of huanglongbing: Deciphering the role of citrus metabolites in symptom development 10(10): 409 21 Pitino M., Allen V & Duan Y J F i P S (2018) LasΔ5315 effector induces extreme starch accumulation and chlorosis as Ca Liberibacter asiaticus infection in Nicotiana benthamiana 113 22 Shokrollah H., Abdullah T L., Sijam K & Abdullah S N A (2010) Ultrastructures of Candidatus Liberibacter asiaticus and its damage in huanglongbing (HLB) infected citrus African Journal of Biotechnology 9(36) 23 Sun G., Xu Y., Liu H., Sun T., Zhang J., Hettenhausen C., Shen G., Qi J., Qin Y & Li J J N c (2018) Large-scale gene losses underlie the genome evolution of parasitic plant Cuscuta australis 9(1): 1-8 24 Tirtawidjaja S (1981) Insect, dodder and seed transmissions of citrus vein phloem degeneration (CVPD) Proc International Soc Citriculture 469-471 25 Wang H., Qi M & Cutler A J J N a r (1993) A simple method of preparing plant samples for PCR 21(17): 4153 26 Warnert J (2012) Asian citrus psyllid and huanglongbing disease threaten California citrus California Agriculture 66(4): 127-130 27 Yang C., Zhong Y., Powell C A., Doud M S., Duan Y., Huang Y & Zhang M (2018) Antimicrobial compounds effective against Candidatus Liberibacter asiaticus discovered via graft-based assay in citrus Scientific reports 8(1): 1-11 76 PHỤ LỤC PTA-ELISA so sánh khả phát Ca Las kháng huyết HLB-N, HLB- C năm 2020, 2021, 2022 đệm Carbonat nồng độ 1/200 PTA-ELISA so sánh khả phát Ca Las kháng huyết HLB-N, HLB- C năm 2020, 2021, 2022 đệm Carbonat nồng độ 1/200 77 Xử lý Urea đến khả phát Ca Las kháng huyết HLBC, HLB-N năm 2021 năm 2022 78 Bảng đo giá trị OD bệnh HLB với nồng độ 1/200 ( xử lý đệm Carbonat) A 10 11 12 0.0642 0.0548 0.0458 0.0372 0.0689 0.0423 0.0607 0.0414 0.0399 0.0574 0.0525 0.059 B 0.059 0.611 0.4558 0.318 0.3362 2.0038 0.6117 0.3309 0.3083 0.5313 0.4971 0.0565 C 0.0573 0.4711 0.318 0.2541 0.2051 2.0406 0.2704 0.2437 0.2219 0.5451 0.4382 0.0562 D 0.049 0.4234 0.2701 0.2377 0.2102 1.8925 0.2867 0.2555 0.2202 0.4892 0.4116 0.0587 E 0.0646 0.3652 0.2548 0.2569 0.1881 0.2643 2.0202 0.3226 0.1992 0.5504 0.3578 0.0562 F 0.0518 0.3703 0.2717 0.2886 0.2206 0.2678 2.0215 0.3221 0.3309 0.5283 0.4529 0.0487 G 0.0469 0.4272 0.2479 0.3066 0.2023 0.0637 1.979 0.2742 0.2703 0.4621 0.0479 0.0525 H 0.062 0.2947 0.2133 0.2013 0.2023 0.2322 0.2092 0.17 0.1727 0.1815 0.1822 0.0715 HLB-C 2020 A B C D E F G H HLB-N 2021 HLB-C 2021 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe chanh khỏe cam khỏe cam khỏe2 chanh khòe cam khỏe2 chanh khòe cam khỏe2 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe chanh khỏe cam khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe Đối chứng Đối chứng Đối chứng Đối chứng Đối chứng KHT HLB-C 2020- THIỆU KHT HLB-N 2021- SƠN HLB-N 2022 chanh khỏe chanh khòe chanh khỏe cam bệnh cam bệnh cam bệnh Đối chứng KHT HLB-C 2021- SƠN 79 HLB-C 2022 10 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe cam khỏe2 chanh khòe cam khỏe2 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe Đối chứng Đối chứng Đối chứng KHT HLB-N 2022- HÒA 11 chanh khỏe chanh khòe chanh khỏe cam bệnh cam bệnh cam bệnh Đối chứng KHT HLB-C 2022- HÒA 12 Bảng đo giá trị OD bệnh HLB với nồng độ 1/1000 ( xử lý đệm Carbonat) 10 11 12 A 0.0619 0.0613 0.0535 0.0508 0.0483 0.0465 0.057 0.0399 0.0429 0.0773 0.0697 0.0703 B 0.0591 0.268 0.2322 0.2316 0.2188 1.4637 0.2876 0.2572 0.2597 0.3211 0.3847 0.0476 C 0.0702 0.2226 0.1841 0.1674 0.1794 1.2789 0.1936 0.1917 0.2398 0.2271 0.3295 0.0539 D 0.0465 0.2074 0.1731 0.1739 0.1915 1.2678 0.1866 0.1951 0.1822 0.215 0.3406 0.0581 E 0.0495 0.1847 0.2002 0.1859 0.1702 0.2012 1.1678 0.1857 0.203 0.2403 0.2613 0.0499 F 0.0684 0.1881 0.1893 0.1913 0.1812 0.1753 1.4218 0.2147 0.185 0.2477 0.2935 0.0548 G 0.0684 0.1655 0.1869 0.1808 0.1621 0.177 0.9289 0.1933 0.2526 0.2265 0.2688 0.0425 H 0.0629 0.1768 0.1666 0.1686 0.166 0.1693 0.1592 0.169 0.1609 0.1639 0.1749 0.0668 HLB-C 2020 A B C D E F G H HLB-N 2021 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe2 chanh khòe cam khỏe chanh khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh Đối chứng Đối chứng KHT-C 2020- THIỆU HLB-C 2021 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe2 chanh khòe cam khỏe chanh khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh Đối chứng Đối chứng KHT-N 2021- SƠN HLB-N 2022 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe2 chanh khòe cam khỏe chanh khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh Đối chứng Đối chứng KHT-C 2021- SƠN 80 HLB-C 2022 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe2 chanh khòe cam khỏe chanh khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh Đối chứng Đối chứng KHT-N 2022- HÒA 10 11 cam khỏe chanh khỏe cam khỏe2 chanh khòe cam khỏe chanh khỏe bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh bưởi khỏe cam bệnh Đối chứng Đối chứng KHT-C 2022- HỊA 12 81 Hình ảnh thỏ thí nghiệm kháng huyết thỏ gây miễn dịch với protein OMP-N OMP-C Các kháng huyết ký hiệu HLB-C HLB-N 82 Cấy trang vi khuẩn sau transformasion Plasmid ( HLB-C4, HLB-N2, CTV-CP, PET 28a)28/3/2022 dương Monday, March 28, 2022 3:05 PM Ngày Nguồn Môi trường Plasmid Kết (29/3/22) 28/3/22 Ross LB Cam + PET28 HLB-C4 Khuẩn lạc hình thành nhiều khoảng 200 đến 250 khuẩn Kanamycin lạc 28/3/22 Ross LB Cam + PET28 HLB-N2 Khuẩn lạc hình thành nhiều khoảng 200 đến 250 khuẩn Kanamycin lạc 28/3/22 Ross LB Cam + PET28 Khuẩn lạc hình thành nhiều Kanamycin CTV-CP1 khoảng 200 đến 250 khuẩn lạc 28/3/22 Ross LB Cam + XL1- PET28a Khuẩn lạc hình thành nhiều khoảng 200 đến 250 khuẩn Kanamycin lạc 28/3/22 Ross LB Cam + Không có khuẩn lạc Kanamycin Cấy mơi trường LB kháng sinh Cam + Kanamycin để tủ ủ ấm 35oC 83 Trồng cam, bưởi mọc lên từ hạt, hoa dừa cạn, dây tơ hồng để chuẩn bị cho lây nhiễm chiết protein (11/2/2022) Friday, February 11, 2022 3:16 PM 84 85