Tinh Sạch Kháng Thể Đơn Dòng Bằng Sắc Ký Ái Lực Protein A Sử Dụng Hạt Gel Và Màng Hấp Phụ

Tinh Sạch Kháng Thể Đơn Dòng Bằng Sắc Ký Ái Lực Protein A Sử Dụng Hạt Gel Và Màng Hấp Phụ

Tinh Sạch Kháng Thể Đơn Dòng Bằng Sắc Ký Ái Lực Protein A Sử Dụng Hạt Gel Và Màng Hấp Phụ

I TỔNG QUAN

I.1 Giới Thiệu Chung

Phương pháp sắc ký cho đến nay là kỹ thuật sử dụng rộng rãi nhất để tinh sạch và phân tích protein có độ phân giải cao Chi phí tinh sạch được ước tính chiếm tới 80% chi phí sản xuất và do đó là một mục tiêu để kiểm soát tài chính Xu hướng nghiên cứu lựa chọn phương pháp sắc ký thích hợp để giảm số lần các bước tinh sạch và tăng năng suất thu hồi sản phẩm tại mỗi bước sẽ góp phần hạ thấp chi phí sản xuất và nâng cao chất lượng

Kháng thể đơn dòng tinh khiết được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ sinh học và y học hàng năm thu về lợi nhuận vô cùng lớn

Nghiên cứu của Mellado và cộng sự đã chỉ ra rằng phương pháp sắc ký ái lực và hấp phụ màng có khả năng tinh sạch và cô đặc nồng độ IgG rất tốt chỉ với một bước tinh sạch Nó góp phần giảm giá thành sản phẩm là phương pháp sắc ký được ứng dụng rộng rãi ngày nay

I.2 Sắc ký ái lực

I.2.1 Khái niệm

Sắc ký ái lực là phương pháp tách hỗn hợp các chất dựa trên tương tác sinh học đặc trưng giữa: Kháng nguyên – kháng thể

Enzyme – cơ chất Chất nhận – chất gắn Sắc ký ái lực được xem như là phương pháp sinh học hiện đại tinh sạch axit nucleic, protein tái tổ hợp, dịch chiết tế bào,…

I.2.2 Cơ sở khoa học

Sắc ký ái lực dựa trên sự hấp phụ chọn lọc của phân tử mục tiêu với các phối tử (ligand) được cố định trên chất mang (matrix)

Hầu hết mỗi phân tử mục tiêu có một vùng nhận biết chuyên biệt, tại vị trí này sẽ gắn kết chặt chẽ với các phối tử ái lực thích hợp Sự tương tác giữa phân tử đích và phối tử được lựa chọn là đặc thù và thuận nghịch

Hình 1 Các bước tiến hành chạy sắc ký ái lực

Khi hỗn hợp cần phân tích đi qua giá thể hấp phụ, phân tử mục tiêu sẽ gắn kết chặt chẽ với các phối tử cố định tại các vị trí liên kết đặc hiệu Quá trình rửa trôi sẽ loại bỏ những phân tử không gắn kết hoặc gắn kết lỏng lẻo với phối tử Cân bằng đệm sau đó tiến hành rửa giải thu phân tử mục tiêu bằng cách sử dụng phối tử cạnh tranh hoặc không canh tranh như thay đổi điều kiện môi trường ( pH, nồng độ ion) để làm vỡ liên kết giữa phối tử và phân tử mục tiêu

I.2.3 Bản chất

- Sắc ký hấp phụ

- Hấp phụ đặc trưng đối với chất gắn (ligand)

- Quá trình thuận nghịch

- Chất gắn được cố định vào chất mang không tan (matrix)

I.2.4 Thành phần cấu tạo

- Matrix: Để gắn phối tử Chất mang phải trơ về mặt hoá – lý

- Spacer arm (tay đệm): Do thực tế rằng vị trí liên kết của các phân tử mục tiêu đôi khi nằm ở vị trí khó tiếp cận do trở ngại về không gian Nên tay đệm được sử dụng

để gắng phối tử với matrix tạo điều kiện và môi trường liên kết hiệu quả hơn

Hình 1 Sắc ký đồ cho thấy sự gắn kết và rửa giải tốt hơn khi sử dụng tay đệm nối

giữ phối tử và matrix.

- Ligand: là phân tử liên kết đặc thù và thuận nghịch với phân tử mục tiêu hoặc nhóm phân tử mục tiêu cụ thể

I.2.5 Ưu điểm

- Kết quả đáng tin cậy, có độ tinh sạch cao

- Tỷ lệ thu hồi sản phẩm cao

- Thời gian phân tích nhanh

- Giảm số lượng các bước cần thiết để tinh sạch phân tử đích, nên giảm giá thành sản phẩm

- Sử dụng ít dung môi

- Giá ái lực giữ hoạt tính ổn định sau nhiều lần sử dụng (khoảng 1 năm)

I.2.6 Nhược điểm

- Áp lực trên giá thể có xu hướng tăng theo thời gian

- Sự tích luỹ các vật chất keo tụ theo thời gian gây bít lỗ cột

- Một hạn chế lớn là sự dịch chuyển của các phân tử chất tan đến đúng vị trí liên kết chậm và tốc độ dòng giảm, do đó thể tích rửa giải tăng làm giảm nồng độ rửa giải

 Một cách tiếp cận mới để khắc phục những hạn chế này là sử dụng màng hấp phụ

lỗ siêu nhỏ để hỗ trợ phương pháp sắc ký ái lực

I.3 Sắc ký màng hấp phụ ái lực

Thường có 3 bước để chuẩn bị màng hấp phụ:

1) Chuẩn bị màng cơ sở

2) Hoạt hoá màng cơ sở

3) Kết hợp các phối tử ái lực để hoạt hoá màng cơ sở

Vật liệu màng thường được sử dụng trong sắc ký màng ái lực cần có các điều kiện sau:

1) Cơ cấu thích hợp, có độ bền cơ học, chịu được tốc độ dòng cao

2) Có sẵn các nhóm phản ứng (như -OH, -NH2, -SH, -COOH) để phối tử kết hợp

3) Tính lý hoá ổn định trong điều kiện khắc nghiệt của rửa giải và khử trùng 4) Bề mặt thấm nước để tránh hấp phụ không chuyên biệt

Vật liệu màng thường được sử dụng cho phân tách sinh học là cellulose, polyamide, polyethylene và polyethersulfone Hiện nay, một số màng thương mại chứa nhóm phản ứng sẵn sàng để gắn với phối tử như Sartobind Epoxy® (Đức) là một màng cellullose tái sinh với kích thước lỗ màng 0.45µm chứa nhóm epoxy –O– (cầu oxy) có thể liên kết với phối tử chứa nhóm -OH, -NH2, -SH

Có nhiều loại màng được sử dụng để tách protein, nhưng loại bản mỏng được ứng dụng rộng rãi nhất Trong hấp phụ màng bản mỏng chất lỏng được tiếp xúc bình thường với bề mặt màng và đi xuyên qua các lỗ do sự chênh lệch áp suất thuỷ tĩnh

I.4 Kháng thể đơn dòng_Monoclonal Antibodies (MAbs)

I.4.1 Kháng nguyên (antigen)

Kháng nguyên là phân tử kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể, những đáp ứng

đó được gọi là "sự đáp ứng miễn dịch" Thông thường kháng nguyên là một protein hay một polysaccharide, nhưng nó cũng có thể là bất cứ loại phân tử nào Kháng thể phản ứng với một phần (kháng thể đơn dòng) hay nhiều phần (kháng thể đa dòng) của kháng nguyên được gọi là "vị trí tiếp xúc" (epitope) Một kháng nguyên thường có nhiều vị trí tiếp xúc tiềm tàng, do đó cần được bộc lộ trước khi cho tiếp xúc với kháng thể

I.4.2 Kháng thể (antibody)

Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein) được sản xuất bởi những những tế bào lympho B khi có sự kích ứng đáp ứng miễn dịch bởi kháng nguyên trên cơ thể vật chủ Phần lớn kháng thể được dùng là IgG, kế đến là IgM Có hai loại kháng thể:

- Kháng thể đa dòng: Tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên

- Kháng thể đơn dòng (Mabs): chỉ đáp ứng với một loại kháng nguyên chuyên biệt, chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn Tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào

I.5. Tinh sạch kháng thể

Mỗi kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chuyên biệt của nó Những kháng thể này có thể được phân lập từ huyết thanh động vật, dịch cổ trướng hoặc dịch nổi canh trường Các phương pháp sắc ký tinh sạch kháng thể đã chỉ ra rằng “ái lực” là yếu tố quan trọng nhất để ứng dụng các phương pháp Phối tử ái lực thường được gắn với các hạt gel hoặc màng là: kháng nguyên, Protein A, protein G, lectins, các ion kim loại như Cu2+ Trong đó sắc ký ái lực protein-A là phương pháp phổ biến nhất để tinh sạch kháng thể Protein-A là một protein nặng 42 kDa, cấu tạo nên thành tế bào vi

khuẩn Staphylococcus aureus đặc trưng bởi ái lực liên kết với phần Fc của

immunoglobulins Ưu điểm chính của phối tử này là khả năng gắn kết cao ổn định và được sinh tổng hợp số lượng lớn từ vi khuẩn tái tổ hợp

Kháng thể tinh sạch được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực công nghệ sinh học và y học Đầu tiên, chúng có thể kết hợp để hỗ trợ phương pháp sắc ký tinh sạch immunoaffinity Thứ hai, các kháng thể chuẩn đoán và phân tích được sử dụng trong phương pháp ELSA, RIA,… Cuối cùng, kháng thể trị liệu được sử dụng trong điều trị các bệnh khác nhau, đặc biệt là các loại bệnh ung thư khác nhau

Để tinh sạch immunoglobulins, Miyazaki và cộng sự (1988) đã sử dụng protein A-agarose trong khi đó Gokana và cộng sự (1997) sử dụng protein G-A-agarose để phân tách kháng thể đơn dòng anti-EPO từ dịch cổ trướng Protein A (PrA) được cố định vào màng hấp phụ cũng đã được sử dụng để tinh sạch một số kháng thể

Trong nghiên cứu của Mellado và cộng sự sử dụng hai phương pháp dựa trên sắc

ký ái lực protein A để tinh sạch IgGs đơn dòng Trong phương pháp sắc ký ái lực, một cột cố định với hạt Streamline®-PrA đã được sử dụng và trong phương pháp màng hấp phụ màng Sartobind Epoxy® được sử dụng (PrA đã được gắn sẵn trong màng Sartobind Epoxy® trước đó) Tiến hành chạy sắc ký với cả hai phương pháp

Trong bài báo cáo này tôi sẽ nêu và phân tích nghiên cứu của Mellado và cộng sự

để hiểu rõ hơn về phương pháp tinh sạch kháng thể đơn dòng bằng sắc ký ái lực và màng hấp phụ

II Vật Liệu và Phương Pháp

II.1 Pha tĩnh

II.1.1 Sắc ký ái lực

Pha tĩnh sử dụng là 2ml cột cố định chứa hạt gel Streamline®-PrA (Thuỵ Điển)

II.1.2 Sắc ký màng hấp phụ ái lực

Pha tĩnh sử dụng là PrA tái tổ hợp ( Đức) đã được cố định vào bảy đĩa màng Sartobind Epoxy® (Đức) Đĩa màng có d = 47mm, h = 275µm đặt trong buồng polypropylene có 4,7 mL dung địch đệm chứa: 1mg/mL dung dịch PrA đã chuẩn bị trước trong 1M dung dịch đệm phosphate pH 7.0 trong 6 ngày ở nhiệt độ phòng Sau phản ứng đĩa màng được rửa với nước cất và giữ trong sodium azide 0,02% ở 5°C Trong tất cả các thí nghiệm màng tốc độ dòng là 1 mL/phút

II.2 Chạy sắc ký

II.2.1 Sắc ký ái lực

- Pha tĩnh được cân bằng với dung dịch đệm phosphate 0,1M pH 7,4

- Mẫu chạy là 5mL dịch cổ trướng (chiết xuất từ chuột Balbc và trước đó đã được lọc trong màng 0,8µm) được đưa vào cột Streamline®-PrA

- Bước rửa được thực hiện với đệm cân bằng

- Rửa giải với dung dịch axit phosphate/phosphoric 0,1M pH 3

- Gel được tái sinh với ethanol 20%, NaOH 1mM và NaCl 2M

- Streamline®-PrA được giữ trong ethanol 20% ở 4°C

- Tổng nồng độ protein trong từng phân đoạn chạy sắc ký được đo theo phương pháp Bradford (1975)

- Mẫu sau đó được xử lý với dung dịch đệm để giảm tốc độ dòng

- Tiến hành chạy điện di với SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

- Cuối cùng gel được nhuộm với Coomassie Brilliant Blue R-250

II.2.2 Sắc ký màng hấp phụ ái lực

- Pha tĩnh được cân bằng với dung dịch đệm phosphate 0,1M pH 7,4

- Mẫu được tiêm vào là IgG thương phẩm của người hoặc dịch nổi canh trường Chinese Hamster Ovary (CHO) lấy từ tế bào buồng trứng của người có IgG anti-HIV

- Bước rửa được thực hiện với đệm cân bằng

- Rửa giải với dung dịch axit phosphate/phosphoric 0,1M pH 3

- Màng được tái sinh với ethanol 20%, NaOH 1mM và NaCl 2M

- Màng PrA được giữ trong dung dịch sodium azide 0,02% ở 4°C

- Các buồng được nối với hệ thống FPLC trong đó sử dụng các tia UV để kiểm tra định lượng hấp phụ dòng chảy qua

- Mẫu sau đó được xử lý với dung dịch đệm để giảm tốc độ dòng

- Tiến hành chạy điện di với SDS-PAGE

- Cuối cùng gel được nhuộm với bạc nitrat

III Kết Quả

III.1 Tinh sạch kháng thể sử dụng hạt gel (sắc ký ái lực)

Sắc ký ái lực sử dụng hạt gel Streamline®-PrA để tinh sạch kháng thể đơn dòng anti-erythropoietin (EPO) của chuột từ dịch cổ trướng cho sắc ký đồ trong hình 2 Sắc

ký đồ cho thấy đỉnh rửa giải rõ nét

Hình 2 Sắc ký tinh sạch kháng thể đơn dòng anti-EPO từ 5mL dịch cổ trướng sử

dụng cột cố định chứa 2mL hạt gel Streamline®-PrA.

Để đánh giá mức độ tinh khiết của rửa giải khi so sánh với các mẫu thí nghiệm khác, và khả năng liên kết có chọn lọc của Streamline®-PrA với IgG, SDS-PAGE đã được tiến hành (hình 3) Kết quả cho thấy, mặc dù nồng độ của 1 số protein trong dịch

cổ trướng (AF) là rất cao nhưng mẫu rửa giải (E) chỉ xuất hiện 2 band chính (50 và 25 kDa) tương ứng với chuỗi IgG nặng và nhẹ Bên cạnh đó còn xuất hiện 2 band khác rất mờ của tạp chất ở khoảng 30 và 75 kDa Vì vậy, kết quả cho thấy rằng chỉ trong một bước tinh sạch để thu được IgG với độ tinh khiết cao từ một hỗn hợp protein bất

ổn, như dịch cổ trướng, chỉ ra rằng PrA là một phối tử đặc hiệu cao với IgGs

Tuy có sự hiện diện của một vài tạp chất nhưng đây không phải là vấn đề chính Ứng dụng tinh sạch IgG anti-EPO bằng phối tử ái lực miễn dịch là một ứng dụng cho phép yêu cầu độ tinh sạch không cao

Hình 3 Nhuộm màu Coomassie Blue SDS-PAGE của mẫu Streamline®-PrA

AF – dịch cổ trướng, E – Rửa giải, S – Tiêu chuẩn khối lượng phân tử (kDa)

III.2 Tinh sạch kháng thể sử dụng màng hấp phụ

Sử dụng màng ái lực bao gồm protein A tái tổ hợp gắn kết với màng Sartobind Epoxy® đã được nghiên cứu để tinh sạch kháng thể đơn dòng người Trong hình 4, sắc ký đồ cho thấy đỉnh rửa giải rõ nét, nồng độ protein cao hơn mẫu rửa giải từ dịch

cổ trướng, điều này cho thấy màng hấp phụ có khả năng cô đặc IgG

Hình 5 cho thấy mẫu phân tích SDS-PAGE được thực hiện với dịch nổi canh trường CHO có chứa IgG tái tổ hợp người Màng rửa giải (lane 1) cho kết quả 2 band giống với IgG tiêu chuẩn (lane 3), tương ứng với chuỗi IgG nặng và nhẹ Thậm chí sử dụng bạc nitrat để nhuộm màu gel SDS-PAGE cũng không xuất hiện tạp chất trong mẫu rửa giải (lane 1) mặc dù một lượng lớn protein ban đầu có trong dịch nổi canh trường (lane 4)

Hình 4 Sắc ký tinh sạch IgG tái tổ hợp người hấp phụ trên Sartobind Epoxy®-PrA.

Hình 5 Bạc nitrat nhuộm màu SDS-PAGE mẫu Sartobind Epoxy®-PrA:

1 – Màng rửa giải: 2 – Tiêu chuẩn khối lượng phân tử;

3 – IgG thương mại; 4 – dịch nổi canh trường CHO.

IV Kết luận

Nghiên cứu của Mellado và cộng sự về sắc ký ái lực PrA sử dụng hạt gel và màng hấp phụ để tinh sạch IgG từ dịch cổ trướng và dịch nổi canh trường cho kết quả chạy sắc ký đều rất tốt Cho chúng ta hiểu rõ hơn bản chất cũng như ưu nhược điểm của phương pháp sắc ký ái lực, từ đó có những định hướng ứng dụng hợp lý, kinh tế

V Tài Liệu Tham Khảo

1 Bài giảng “ Quá trình thu hồi và hoàn thiện sản phẩm” Gv PGS.TS Quản Lê Hà

ĐH Bách Khoa Hà Nội

2 Luận Văn “Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng” Svth: Nguyễn Vũ Bảo GVHD: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3 Furification of monoclonal antibodies by protein A affinity chromatography using gel beads and membrane adsorbers Mellado et al, COPPE – Universidade do Ria Janeiro, Brazil

4 Affinity chromatography: Principles and applications Sameh Magdeldin et al