Nghiên cứu xác định hàm lượng một số amin thơm giải phóng ra từ thuốc nhuộm azo có trong sản phẩm da, giả da bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò khối phổ kép

Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học – Tập 20, số 3/2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ AMIN THƠM GIẢI PHÓNG RA TỪ THUỐC NHUỘM AZO CÓ TRONG SẢN PHẨM DA, GIẢ DA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KẾT NỐI ĐẦU DỊ KHỐI PHỔ KÉP Đến tịa soạn 30 - - 2015 Tạ Thị Ngọc Ánh, Lê Thị Băng, Trần Mạnh Quân, Trần Quốc Trung Trung tâm Phân tích Công nghệ Môi trường, Viện Nghiên cứu Da Giầy SUMMARY RESEARCH ON DETERMINATION OF AROMATIC AMINES RELEASED FROM AZO DYES IN LEATHER, IMITATION LEATHER BY USING HPLC-MS/MS METHOD An analytical procedure based on the use of high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry/mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was applied for the determination of banned azo dyes in leather and imitation leather For the identification of the analytes one parent ion and two product ions were selected and the LC-MS/MS parameters optimized to obtain high sensitivity and selectivity This method be able to determine 18 aromatic amines derived from azo colorants using C18 column and using MeOH: H2O as a mobile phase Sample was extracted in 17 mL of 0.06 M citrate buffer solution at pH at a temperature of 70 °C Then, the extracted colorants were reduced to aromatic amines using mL of 200 mg/sodium dithionite solution After an incubation of 30 at 70°C, the mixture was allowed to cool to room temperature The amines released in the process of reductive cleavage ware transferred to a t-butyl methyl ether phase by means of liquid-liquid extraction, the t-butyl methyl ether extract was concentrated and was then filtered with syringe filters of 0.45-µm pore size Method detection limit was 0.5 mg/Kg MỞ ĐẦU Thuốc nhuộm chất màu hữu tạo thành hợp chất diazoni kết hợp với phenol amin thơm Chúng chất màu sử dụng rộng rãi tất sản phẩm thực phẩm, giấy, da dệt may Tuy nhiên, nhóm azo số loại thuốc nhuộm bị khử thể sống tạo thành amin gây đột biến gây ung thư [1,2] Với nhận thức ngày cao nguy tiềm ẩn cho người tiêu dùng, Nghị viện châu Âu chấp nhận việc sửa đổi thứ 19 Hội 293 đồng số 76/769/EEC ban hành Chỉ thị Châu Âu 2002/61/EC [3] Chỉ thị đặc biệt hạn chế bán sử dụng thuốc nhuộm azo, mà sau khử phân tách tạo thành amin danh sách 22 amin thơm có hại sản phẩm dệt da tiếp xúc trực tiếp, lâu dài với da người khoang miệng Hiện nay, số phương pháp phân tích mơ tả tài liệu để xác định thuốc nhuộm azo Thuốc nhuộm azo thường xác định gián tiếp cách đo amin tương ứng chúng, hình thành sau khử natri dithionit thiếc (II) clorua Có số phương pháp ứng dụng phân tích cho mẫu da Phương pháp sử dụng rộng rãi phương pháp DIN 53316 [4] Bên cạnh đó, Eskilsson tiến hành phân tích mẫu da thật với quy trình dựa trình chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE) định lượng sử dụng ngoại chuẩn thông thường Mặc dù thu số cải tiến đáng kể tính xác so với phương pháp DIN 53316, độ thu hồi thu thấp (99,9%), natri hiđroxit (NaOH) (độ tinh khiết >96%), axit citric (độ tinh khiết >99,5%), natri đithionit (hoá chất kỹ thuật – Labosi), axit acetic (độ tinh khiết >95,5%), amoni acetat (độ tinh khiết >98%) nước cất deion Thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Ultimate 3000 HPLC kết nối đầu dò lần khối phổ Thermo TSQ Quantum Access Max Cột sắc ký lỏng Hypersil Gold C18 (150x2,1 mm, µm), Hypersil Gold aQ (150x2,1 mm, µm) Hypersil Gold PFP (150x2,1mm, µm) Trong nghiên cứu sử dụng đồng thời thiết bị phịng thí nghiệm thiết bị lắc gia nhiệt, bể siêu âm, hệ thống thổi khí nitơ, màng lọc dụng cụ thủy tinh khác KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát trình tách sắc ký Khảo sát cột sắc ký Tiến hành khảo sát trình tách sắc ký cột sắc ký khác cột C18, aQ PFP Pha động sử dụng trình khảo sát theo tiêu chuẩn ISO 17234-1: 2010 [7] với kênh A đệm phosphat kênh B MeOH Chế độ chạy gradien 10% kênh B đến 80% kênh B 45 phút, nhiệt độ lò cột 40oC (CH3COONH4 25mM), B-MeOH; Pha RT: 0.00 - 44.21 110000 100000 động 3: A-H2O; B-MeOH Ở ba điều kiện, pha động chạy chế độ gradien: bắt 90000 80000 70000 uAU 60000 đầu từ 10% kênh B tăng dần đến 80% kênh B vòng 45 phút, cột 50000 40000 30000 20000 10000 Hypersil Gold C18 Trong Hình sắc đồ phân tách amin thơm cột C18 với -10000 10 15 20 25 Time (min) 30 35 40 Phân tách sắc ký chất amin thơm cột Hypersil Gold C18 pha động khác RT: 0.00 - 40.00 240000 RT: 0.00 - 44.97 220000 200000 40000 180000 160000 30000 140000 uAU 20000 uA U 10000 120000 100000 80000 60000 40000 -10000 20000 -20000 -20000 -30000 -40000 -40000 0 10 15 20 25 30 35 10 15 20 Time (min) 25 30 35 40 40 Time (min) Phân tách chất amin thơm với pha động Phân tách sắc ký chất amin thơm RT: 0.00 - 42.00 30000 cột Hypersil Gold aQ 20000 10000 RT: 0.00 - 40.00 400000 350000 300000 -10000 uA U NL: 4.07E5 Total Scan PDA Mix20chat_ 5ppm_0811 13_10ul_P FP -20000 250000 u AU -30000 200000 -40000 150000 -50000 100000 -60000 50000 -70000 0 10 15 20 Time (min) 25 30 35 10 15 20 Time (min) 25 30 35 40 40 Phân tách sắc ký chất amin thơm cột Hypersil Gold PFP Phân tách amin thơm với pha động Mix21chat_10ppm_2ul_H2O_01 Hình Sắc phổ đồ khảo sát cột sắc ký Kết khảo sát từ Hình cho thấy điều RT: 0.00 - 42.00 kiện tách sắc ký cột C18 tối ưu Toàn amin thơm tách khỏi 14000 với độ phân giải cao, độ rộng chân píc nhỏ Vì vậy, sử dụng cột sắc ký C18 để tách 11/15/2013 4:40:00 PM NL: 2.80E4 Total Scan PDA Mix21chat_ 10ppm_2ul _H2O_01 22000 20000 18000 16000 uA U 12000 10000 8000 6000 4000 2000 -2000 10 15 20 Time (min) 25 30 35 40 chất amin thơm nghiên cứu Phân tách chất amin thơm với pha động Hình Sắc phổ đồ khảo sát pha động Khảo sát pha động Tiến hành khảo sát điều kiện pha động để Với điều kiện pha động A-H2O (0,1% FA) B-MeOH, nhiều amin thơm có chân píc trùng phát chất amin hệ thống HPLC-MS/MS: Pha động 1: A-H2O (FA Với hai điều kiện pha động lại, amin thơm phân tách rõ ràng chân 0,1%), B-MeOH; Pha động 2: A-H2O píc không bị trùng lấp Tuy nhiên, qua số 295 tài liệu tham khảo trình thực nghiệm, Khảo sát thơng số cho nguồn ion hóa nhận thấy sử dụng đệm ammoni acetat làm giảm cường độ ion hóa số chất ESI Các thơng số đầu dò ESI thường amin thơm 4-chloroaniline, 4-chloro-otoluidin Do vậy, pha động gồm A-H2O B- thiết lập dựa tốc độ dịng dung mơi đưa vào Ngồi ra, nhóm thực tiến hành MeOH lựa chọn để phân tách chất amin thơm hệ thống HPLC-MS/MS khảo sát tối ưu hóa thông số để thu cường độ ion tối đa cho amin thơm 3.2 Khảo sát thơng số tối ưu cho đầu dị khối phổ Bảng Các thông số tối ưu thiết lập cho nguồn ion hóa ESI STT Thơng số Positive (+) Spray Voltage 4000 V Sheath gas pressure 40 psi Aux gas pressure 10 psi Capillary Temperature 270o C SkimmerOffset Tube Lens Offset -10 90 V Khảo sát mảnh phổ amin thơm E:\tai lieu\ \FullscanQ1MS 7/11/2013 4:08:39 PM E:\tai lieu\ \FullscanProduct 144.09 127.09 100 90 90 80 80 70 70 Relative A bund anc e Re la tive Abu nda nce 100 60 50 40 60 50 144.04 40 142.95 117.14 30 30 20 145.11 20 10 101.17 103.16 100 7/11/2013 4:11:59 PM FullscanProduct #882 RT: 1.99 AV: NL: 9.32E5 T: + c ESI Full ms2 144.120 [100.000-145.000] FullscanQ1MS #1203 RT: 2.31 AV: NL: 2.99E6 T: + c ESI Q1MS [100.000-150.000] 105 117.16 110 115 121.20 124.16 120 125 m/z 135.06 128.20 130 126.11 149.09 133.17 127.12 114.14 109.14 113.06 143.17 139.35 135 140 Chế độ Fullscan Parent mass: m/z 144,12 146.15 145 150 10 100 115.11 103.43 105.15 105 112.03 114.03 110 115 117.72 128.95 122.83 120 125 130 135 140 145 Chế độ Fullscan – product Product mass: m/z 127,09 m/z 117,14 Năng lượng bắn phá m/z 117 (16V), m/z 127 (22V) Hình Tối ưu hóa detector MS-MS cho chất 2-naphthylamine 296 133.37 135.72 138.95 m/z Chế độ ion hoá amin thơm thực chế độ ion dương (positive) Các dung dịch chuẩn có nồng độ 200 ppb pha nước cất de ion MeOH với tỉ lệ H2O: MeOH = 50:50 Dung dịch chuẩn đưa vào buồng ion hoá nhờ vịng mẫu (loop) µL dịng dung mơi pha động 250 µL (H2O: MeOH = 50:50) Đầu dị khối phổ TSQ Quantum để tìm mảnh mẹ chạy chế độ quét scan Fullscan Q1MS, tìm mảnh chạy chế độ Fullscan – Product Sắc đồ 2naphthylamine biểu diễn Hình Mảnh mẹ, mảnh thời gian lưu amin lại thể Bảng Bảng Tổng hợp mảnh phổ hợp chất amin lượng bắn phá tối ưu TT Amin thơm Parent Product CE mass mass (eV) RT Product CE mass (eV) 2,4-Diaminanisol 173,3 141,1 10 1,78 113,1 15 2,4-Diaminotoluen 123,1 108,2 14 3,69 79,2 19 2-Anisidine 124,2 109,1 14 11,62 80,3 29 O-Toluidine 108,1 93 15 12,35 91 17 Benzidine 185 167,9 17 12,43 151 32 4,4-Oxydianiline 201,1 108 23 13,78 80 19 4-Cloroaniline 128,1 111 23 16,41 93 17 4-Cresidine 138,1 123 14 18,68 106 21 4,4'-Diaminodiphenylmethane 199,1 182 19 19,36 106 23 10 3,3'-Dimethoxybenzidine 245,7 231,1 17 20,99 213,9 18 11 3,3'-Dimetylbenzidine 213,1 196 18 21,4 181 23 12 2-Napthylamine 144,1 127 22 21,91 117 16 13 4,4'-Thiodianiline 217 200 18 21,91 124 19 14 4-Cloro-o-toluidine 142,1 125 21 23,43 107 16 15 2,4,5-Trimetylaniline 136,2 121,1 14 25,58 91,2 22 16 3,3'-Dimetyl-4,4'diaminodiphenylmethane 227,1 195 21 27,41 120 26 17 4-Aminobiphenyl 170,1 151,9 29 29,47 128,2 23 18 3,3'-Diclobenzidine 253,9 218 20 31,87 183 26 19 4-Aminoazobenzen 198,2 93 20 32,65 77 19 20 4,4'-Metylen-bis-2 (cloroaniline) 269,9 231 18 33,91 140 27 21 O-Aminoazotoluen 226 106,3 29 40,0 91,1 20 297 Trong q trình nghiên cứu, nhóm tác giả phát mảnh mẹ mà thực trình khử natri đithionit Tuy nhiên, để tối ưu hóa cho q khơng thể phát mảnh chất 2-amino-4-nitrotoluene Điều trình xử lý mẫu, nhóm thực tiến hành khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến phù hợp với tài liệu nhóm thực tham khảo [9] độ thu hồi phương pháp pH, dung môi chiết, số lần chiết Khảo sát điều kiện tối ưu cho xử lý mẫu Quá trình xử lý mẫu kế thừa theo tiêu pH Độ pH ảnh hưởng đến khả ion hóa chuẩn CEN ISO/TS 17234 với bước thực là: loại mỡ; chiết thuốc amin thơm, thay đổi khả tan amin thơm nước ảnh nhuộm azo; khử thuốc nhuộm azo thành amin thơm; làm dung dịch chiết hưởng đến hiệu suất trình chiết lỏng-lỏng Kết khảo sát phụ thuộc đem phân tích hệ thống HPLC-MSMS Đối với mẫu giả da, trình xử lý mẫu hiệu suất thu hồi (tỉ lệ diện tích píc mẫu mẫu chuẩn nồng độ dự kiến) vào theo ISO 24362-1:2014, theo hướng dẫn tiêu chuẩn này, mẫu giả da độ pH dung dịch chiết Hình chiết chlorobenzene nhiệt độ sôi trước Ảnh hưởng pH đến độ thu hồi Ảnh hưởng pH đến độ thu hồi (pH=4,13) (pH= 8,93) Hình Khảo sát ảnh hưởng pH đến độ thu hồi amin thơm Khi dung dịch chiết có mơi trường bazơ pH = diaminodiphenylmethane) Các chất bị 8,93 phần lớn amin thơm chuyển sang trạng thái trung hịa, khơng bị ion hóa ion hóa nên độ tan nước tăng lên, làm giảm độ thu hồi chiết lỏng lỏng hiệu suất thu hồi amin thơm tăng lên Khi dung dịch chiết có mơi Dumg mơi chiết số lần chiết Ngồi việc sử dụng dung môi chiết MTBE, trường axit pH = 4,13 độ thu hồi số amin bị giảm đáng kể (benzidien; 4,4'- nhóm thực tiến hành khảo sát chiết với dung mơi n-hexan Hình 5.1 phản ánh độ oxydianiline; 4,4-diaminodiphenylmethane; 3,3-dimetylbenzidine; 3,3-dimethyl-4,4- thu hồi MTBE n-hexan Tiến hành khảo sát hiệu suất thu hồi thơng qua số lần 298 chiết để tìm số lần chiết thích hợp Khảo sát tiến hành với lần 10mL MTBE Kết thể Hình 5.2 5.1 Khảo sát ảnh hưởng dung mơi chiết đến 5.2 Khảo sát ảnh hưởng số lần chiết độ thu hồi đến độ thu hồi Hình Khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết số lần chiết đến độ thu hồi amin thơm Qua Hình 5.1, kết luận sử dụng dung mơi để đạt yêu cầu độ thu hồi >50%, cần chiết MTBE cho độ thu hồi tốt so tiến hành chiết lần với 10 mL MTBE với dung môi n-hexan Khi sử dụng dung 3.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương môi chiết MTBE, độ thu hồi đặc biệt tốt pháp cho chất amin thơm có độ phân cực cao Độ chọn lọc như: bezidine; 2,4-diaminotoluen; 4,4'Độ chọn lọc đánh giá dựa oxydianilin; 4,4-diaminodiphenylmetan; khác biệt sắc đồ mẫu trắng 4,4'-thiodianilin Hình 5.2 cho thấy, ngoại mẫu thêm chuẩn Nếu mẫu trắng khơng trừ 2,4-diaminotoluen amin cịn lại phát píc thời gian lưu chất chiết gần hoàn toàn sau lần chiết mẫu thêm chuẩn xuất píc với độ thứ 2,4-diaminotoluen có độ thu hồi thấp, cao rõ rệt (S/N>3) phương pháp phân tích chọn lọc cho chất cần phân tích 20131129-TestForBlankLeather_5uL_Samp 20131129-TestSpikedrBlankLeather_250p 11/30/2013 3:45:19 PM NL: 3.57E2 TIC F: + c ESI SRM ms2 217.000 [199.500-200.500] MS 20131129TestForBlankLeather_5u L_Sample01 200 180 160 RT: 22.33 SN: 3441 180000 NL: 1.80E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 217.000 [199.500-200.500] MS ICIS 20131129TestSpikedrBlankLeather_25 0ppb_5uL_Sample01 160000 140000 140 120000 (1) 100 Intensity 120 In te n s ity 11/30/2013 4:43:45 PM RT: 16.12 - 25.40 RT: 10.77 - 27.79 SM: 7G 22.57 80 40000 Đường 16.15 40 23.25 16.49 17.76 20 17.48 19.56 22.10 20.46 20000 19.47 12 13 14 15 16 17 18.04 18 19 20 Time (min) 21 22 23 24 25 Đường 23.68 24.27 17 11 (2) 80000 60000 20.68 21.39 60 100000 26 18 19 20 21 Time (min) 22 23 24 25 27 Hình Độ chọn lọc phương pháp phân tích chất 4,4'-thiodianiline (1-Mẫu da trắng; 2-Mẫu da trắng thêm chuẩn 0,25 mg/kg) 299 Từ thực nghiệm cho thấy phương pháp Kết đánh giá độ thu hồi (Hình 7) cho phân tích amin thơm giải phóng từ thuốc nhuộm azo HPLC – MSMS có thấy, độ thu hồi 18 amin thơm tốt với phần lớn chất có độ thu hồi trung bình độ chọn lọc cao >70%; ngoại trừ 2,4-diaminotoluen có độ thu hồi trung bình 53% Độ thu hồi Hình Độ thu hồi phương pháp Do 2,4-diaminoanisol có độ phân cực lớn độ bền thấp dẫn đến độ thu hồi thấp Đánh giá chung kết thực nghiệm, tính tốn giới hạn phát phương trình chiết lỏng lỏng xử lý mẫu 2-amino-4-nitrotoluene không phân đưa giới hạn phát chung MDL = 0,5 mg/Kg cho chất amin thơm tích khơng bắn phá thành sản phẩm da mảnh ion chế độ MS/MS [9] 4aminoazobenzene o-aminoazotuluen có Độ tuyến tính Đường chuẩn chất amin thơm độ thu hồi thấp tương tác với chất khử natri đithionit trình xử lý mẫu xây dựng với khoảng nồng độ từ mg/kg; 2,5 mg/kg; 5,0 mg/kg; 7,5 mg/kg; 10 mg/kg [10] cách thêm chuẩn vào mẫu da trắng thực toàn trình xử lý mẫu Độ lặp lại Độ lặp lại phương pháp đánh giá dựa độ lệch chuẩn tương đối – RSD phân tích mẫu thật Từ kết nghiên cứu, hệ số tương quan amin thơm (%) Nhóm nghiên cứu thực thí nghiệm với số lần lặp lại n = mẫu thêm R2>0,99 khoảng tuyến tính từ mg/Kg – 10 mg/Kg Diff (%)