NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 77TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 Ngày nhận bài 2/7/2020 Ngày phản biện 12/8/2020 Ngày chấp nhận đăng 18/8/2020 Định lượng diethyltoluamid trong kem bôi da bằng phương pháp[.]
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Định lượng diethyltoluamid kem bôi da phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Phạm Đức Thịnh1, Nguyễn Trọng Điệp1, Phan Thị Tú Uyên1 Phan Đình Châu2, Nguyễn Văn Thư 1, Vũ Bình Dương1 Học viện Quân y Đại học Bách khoa Hà Nội TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng diethyltoluamid (DEET) kem bôi da sắc ký lỏng hiệu cao Từ ứng dụng phương pháp để đánh giá chất lượng số chế phẩm kem DEET Phương pháp: Khảo sát chọn điều kiện sắc ký phù hợp; thẩm định phương pháp định lượng theo hướng dẫn ICH gồm: Tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Kết quả: lựa chọn điều kiện sắc ký gồm: cột C18, 5µm, 4,6 x 250 mm, detector UV bước sóng 235 nm, pha động hỗn hợp acetonitril acid phosphoric 0,1% tỉ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dòng 0,5 ml/phút Phương pháp thẩm định đạt yêu cầu độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng theo yêu cầu ICH Kết luận: Đã xây dựng thẩm định phương pháp lượng DEET chế phẩm kem HPLC, từ ứng để xác định hàm lượng DEET kem bơi da Từ khóa: N,N-diethyl-m-toluamid, HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ Diethyltoluamid (DEET) hoạt chất có tác dụng xua đuổi nhiều loại côn trùng ruồi, muỗi, bọ chét [1] Đặc biệt DEET có phổ tác dụng rộng có hiệu hầu hết lồi muỗi (cả véc-tơ truyền bệnh sốt xuất huyết) [2], thời gian huy tác dụng kéo dài tới [3] Vì vậy, DEET coi hoạt chất tiềm để bào chế sản phẩm xua đuổi trùng nói chung loại muỗi nói riêng Các sản phẩm chứa DEET sử dụng thích hợp cho đội luyện tập chiến đấu khu vực nguy cao mắc rừng rậm, đồi núi, sình lầy… Năm 2018, Học viện Quân y Bộ Quốc phòng cho triển khai đề tài nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu bào chế kem bôi da chứa DEET nhằm phục vụ cho đội Để có đánh giá chất lượng sản phẩm trình sử dụng bảo quản, tiêu chuẩn hóa chất lượng chế phẩm kem chứa DEET cần có quy trình định lượng hoạt chất phương pháp phân tích đại có độ xác cao Do vậy, nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu xây dựng thẩm định quy trình định lượng DEET chế phẩm kem phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Ngày nhận bài: 2/7/2020 Ngày phản biện: 12/8/2020 Ngày chấp nhận đăng: 18/8/2020 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 77 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị * Nguyên liệu hóa chất - DEET hàm lượng 97% (Sigma - Aldrich, Đức) - Acid phosphoric đặc (H3PO4) PA, Methanol (CH3OH) PA, Acetonitril, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích - Kem DEET 20% (số lơ 1, 2, 3) * Thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Water 2489, Detector UV/Visible, Singapor, kênh dung mơi, detector UV/VIS; bình chiết siêu âm Soniclean; cân phân tích Sartorius độ xác 0,1 mg Phương pháp nghiên cứu * Chuẩn bị mẫu Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc DEET có nồng độ 200 µg/ml hỗn hợp MeOH - nước (45 : 55) Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với dung mơi để có dung dịch chuẩn làm việc Mẫu trắng: hỗn hợp methanol - nước (45 : 55) * Khảo sát điều kiện sắc ký Bước sóng định lượng: Tham khảo tài liệu [4], [5], [6], tiến hành khảo sát bước sóng định lượng 230, 235 240 nm Lựa chọn bước sóng có tỉ lệ đáp ứng diện tích peak/nhiễu đường lớn Hệ dung môi pha động: Căn vào [4], [7], khảo sát hệ pha động khác với thành phần bảng Bảng Thành phần hệ pha động sử dụng phân tích Thành phần Tỷ lệ MeOH : acid phosphoric 0,1% 45 : 55 ACN : acid phosphoric 0,1% 78 70 : 30 20 : 80 80 : 20 60 : 40 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 Thể tích tiêm 10 µl, tốc độ dịng ml/phút, nhiệt độ cột 26°C Qua khảo sát thực nghiệm, chọn điều kiện sắc ký thích hợp cho peak DEET tách hoàn toàn khỏi peak tạp (nếu có) có hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 - 1,5 Tốc độ dòng: Khảo sát tốc độ dòng pha động khác nhau: 0,5; 0,75 ml/phút Căn vào hệ số bất đối, khả tách riêng biệt với peak lại sắc ký đồ, đồng thời đảm bảo thời gian lưu (tR) phù hợp để lựa chọn tốc độ dòng phù hợp * Khảo sát điều kiện xử lý mẫu thử Dung môi chiết mẫu: Căn vào USP 41 [4], tiến hành khảo sát dung môi chiết: ethanol tuyệt đối, hỗn hợp MeOH - nước (45 : 55) Cân xác khoảng 0,1gam kem DEET vào bình định mức 100ml, bổ sung khoảng 80ml dung môi chiết mẫu, lắc siêu âm 60 phút, để nguội, bổ sung vừa đủ đến vạch với dung mơi pha lỗng 10 lần Lọc qua màng 0,45µm, phân tích HPLC, tính hiệu suất chiết Mỗi khảo sát lặp lại lần Dung mơi chọn có khả hịa tan tối đa dược chất hòa tan tối thiểu tá dược; độ lặp lại tốt lần Thời gian chiết: Tiến hành xử lý mẫu nêu phần trước với thời gian lắc siêu âm khoảng thời gian 30 phút 60 phút Tính hiệu suất chiết Lặp lại thời gian khảo sát lần Thời gian lựa chọn thời gian chiết DEET với hiệu suất cao, độ lặp lại tốt lần * Thẩm định phương pháp Phương pháp phân tích thẩm định theo hướng dẫn chung ICH (International conference on Harmonisation) thẩm định phương pháp phân tích [8] gồm: - Tính tương thích hệ thống; - Độ đặc hiệu; - Khoảng nồng độ tuyến tính; - Độ lặp lại; - Độ đúng; NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG - Giới hạn định tính (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) * Xử lý số liệu Số liệu phân tích thống kê phần mềm Microsoft Excel Office 2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết khảo sát điều kiện sắc ký Trên sở tham khảo tài liệu [4-6] qua khảo sát tìm điều kiện sắc ký phù hợp, lựa chọn điều kiện sắc ký cho định lượng DEET sau: Cột Select C18 (5µm 4,6 x 250mm); detector UV bước sóng 235 nm; pha động: dung dịch Acetonitril : acid phosphoric 0,1% (với tỷ lệ 60:40); tốc độ dịng 0,5 ml/phút chạy 13 phút; thể tích bơm mẫu 10 µl; cột nhiệt độ phịng Với điều kiện lựa chọn, kết sắc ký đồ hình cho thấy píc DEET đẹp, cân đối thời gian lưu khoảng 9,48 phút phù hợp cho phân tích DEET kem xua muỗi Vì vậy, lựa chọn điều kiện cho trình khảo sát Kết lựa chọn điều kiện xử lý mẫu Căn theo mô tả trình bày phần phương pháp, chuẩn bị mẫu có nồng độ khoảng 20,02 µg/ml để tiến hành khảo sát lựa chọn dung môi chiết thời gian chiết Kết thể bảng 3: Bảng Kết lựa chọn dung môi chiết mẫu Dung môi MeOH : nước = 45:55 Cồn tuyệt đối Lần Lần Lần Lần Lần Lần m DEET lý thuyết (g) m DEET thực tế (g) 0,0196 0,0210 0,0202 0,0212 0,0200 0,0210 0,0222 0,0266 0,0198 0,0227 0,0205 0,0242 Hiệu suất (%) 107,1 104,9 105,0 119,8 114,6 118,0 X ± SD (%) RSD (%) 105,7 ± 1,24 117,5 ± 2,64 1,17 2,25 Kết bảng cho thấy: Mỗi dung mơi khảo sát có lặp lại lần đo Tuy nhiên, dùng cồn tuyệt đối hiệu suất chiết lớn (117,5 ± 2,64%, nằm khoảng 95 -110%) cồn tuyệt đối dung môi dễ bay hơi, làm tăng nồng độ chất phân tích Sử dụng dung mơi MeOH: nước (45:55) theo tài liệu [8] thu hiệu suất chiết 105,7 ± 1,24%, độ lệch chuẩn lần phân tích 1,17% (