Thông tin tài liệu
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu tơi số kết đồng tác giả với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, đặc biệt trình tự gen RpoC trình tự RbcL Đại diệp Đằng (Tinomiscium petiolare) Thanh Hóa kết đƣợc công bố Việt Nam, phần đƣợc cơng bố tạp chí Proceedings on Applied Botady, Genetics and Breeding với đồng ý cho phép đồng tác giả có 08 trình tự gen đƣợc công bố ngân hàng gen quốc tế Phần cịn lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Thanh Hóa, ngày 12 tháng 06 năm 2021 Tác giả Nguyễn Thị Liên i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành tới TS Lê Đình Chắc Trƣởng Bộ môn Sinh học, ngƣời thầy tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ chia sẻ khó khăn với tơi suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Bộ môn Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa KHTN Trƣờng Đại học Hồng Đức Thanh Hóa Tơi xin cảm ơn giúp đỡ Phòng Quản lý Sau đại học Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian học tập làm nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ quý báu BGH trƣờng THPT Quảng Xƣơng 1, chị em tổ chuyên môn Sinh học – CN nhà trƣờng Tất anh, chị em bạn lớp K12 cao học Thực vật học Cuối cùng, muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất ngƣời thân gia đình ln sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn này! Trân trọng cảm ơn cảm ơn! Thanh Hóa, ngày 12 tháng 06 năm 2021 Tác giả Nguyễn Thị Liên ii MỤC LỤC Trang M ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cây Đại diệp đằng 1.1.1 Đặc điểm phân loại hình thái lồi Đại diệp đằng 1.1.2 Một số công dụng Đại diệp đằng 1.1.3 Nghiên cứu Đại diệp đằng Việt Nam giới 1.2 Mã vạch dna (DNA Barcode) 1.2.1 Giới thiệu DNA barcode 1.2.2 Các đặc điểm trình tự barcode 1.2.3 Một số trình tự đƣợc sử dụng DNA barcode thực vật 1.3 Ứng dụng mã vạch DNA nhận biết dƣợc liệu Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU 11 VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 11 2.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị 11 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 11 2.3.2 Hóa chất, máy móc thiết bị 12 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Phƣơng pháp thu mẫu 13 2.4.2 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 13 2.4.3 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide đoạn gen RpoC, RbcL 17 iii 2.3 Phƣơng pháp tách chiết tinh dầu xác định thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng 17 2.5 Phƣơng pháp chiết xuất nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu 18 2.5.1 Xử lý mẫu nguyên liệu 18 2.5.2 Phƣơng pháp cất tinh dầu 18 2.5.3 Phƣơng pháp cất nƣớc 18 2.5.4 Phƣơng pháp xử lý tinh dầu 19 2.6 Phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu dầu béo hệ thống máy sắc ký khí GC-MS 20 2.7 Xử lý số liệu thu đƣợc 20 2.8 Yêu cầu kết phân tích 20 2.9 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hóa tinh dầu rễ Đại diệp đằng 21 2.9.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu rễ Đại diệp đằng 21 2.9.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu rễ Đại diệp đằng 22 3.1 Kết phân tích đặc điểm hình thái Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) 24 3.2 Kết phân tích đoạn gen RpoC RbcL Đại diệp đằng 28 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ Đại diệp đằng 28 3.2.2 Kết nhân bản, xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn gen RpoC 28 3.2.3 Kết nhân bản, xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn gen RbcL 36 3.3 Kết phân tích thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng 43 3.4 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật chống oxy hóa tinh dầu rễ Đại diệp đằng 46 iv 3.4.1 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu rễ Đại diệp đằng 46 3.4.2 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu rễ Đại diệp đằng 46 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC P1 v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Trình tự nucleotide hai cặp mồi PCR khuếch đại đoạn gen RpoC RbcL 14 Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR 15 Bảng 1: Nồng độ độ tinh mẫu 28 Bảng 3.2 Kết so sánh trình tự RpoC phân lập đƣợc với trình tự RpoC cơng bố gen bank 34 Bảng 3.3 Kết so sánh trình tự RbcL phân lập đƣợc với trình tự RbcL công bố gen bank 41 Bảng 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng 43 Bảng 3.5 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu rễ Đại diệp đằng 46 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu rễ Đại diệp đằng 47 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1 Ảnh chụp cành Đại diệp đằng 24 Hình 3.2 Ảnh chụp lát cắt ngang thân Đại diệp đằng 25 Hình 3.3 Ảnh chụp mặt Đại diệp đằng 26 Hình 3.4: Ảnh chụp hình thái rễ Đại diệp đằng 27 Hình 3.5: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen RpoC từ hai mẫu Đại diệp đằng 29 Hình 6: Kết so sánh trình tự gen RpoC thu đƣợc Bến En Pù Lng Hình 3.7 Sơ đồ so sánh quan hệ di truyền trình tự RpoC thu đƣợc với trình tự RpoC công bố gen bank 35 Hình 3.8: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen RbcL từ hai mẫu Đại diệp đằng với cặp mồi RbcL -F/RbcL -R 36 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự RbcL thu đƣợc với trình tự RbcL cơng bố gen bank 40 Hình 3.10 Sơ đồ so sánh quan hệ di truyền trình tự RbcL thu đƣợc với trình tự RbcL cơng bố gen bank 42 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BioEdit DNAstar: Phần mềm Tin sinh học phân tích liệu DNA Blast : Basic Local Alignment Search Tool BE : Bến En CTAB : Cetyl trimethyllammonium Bromide RpoC : RNA polymerase C subunit gene RbcL : Rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/oxygenase Large PCR : Polymerase chain reaction PL : Pù Luông viii MỞ ĐẦ Đ t vấn ề Việt Nam với 75% diện tích tự nhiên vùng đồi núi, chịu ảnh hƣởng khí hậu nhiệt đới gió mùa; đó, Việt Nam trở thành quốc gia có hệ thực vật rừng vô phong phú đa dạng, đặc biệt loài dƣợc liệu Nằm vùng phân bố loài Việt Nam (trong có Thanh Hóa) đƣợc ghi nhận có phân bố loài Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) (PHH, 2003) Tuy nhiên nghiên cứu dƣợc học đặc điểm gen phân loại, thành phần hóa học tinh dầu lồi cịn hạn chế, đặc biệt Việt Nam chƣa có nghiên cứu cụ thể đặc điểm gen phân loại, thành phần hóa học tinh dầu Đại diệp đằng Đây nguyên nhân làm cho Đại diệp đằng Việt Nam nói chung, Thanh Hóa nói riêng chƣa đƣợc biết đến nhiều Trên thực tế, có số cơng trình nghiên cứu giới Đại diệp đằng gần cho thấy, Đại diệp đằng dƣợc liệu q, có nhiều cơng dụng y học, nhiên nghiên cứu chƣa đề cập đến đặc điểm gen phân loại, thành phần hóa học lồi Do đó, việc nghiên cứu gen phân loại, thành phần hóa học tinh dầu lồi cần thiết nhằm cung cấp thêm tƣ liệu khoa học cho loài Cây Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) thuộc họ Tiết Dê (Menispermaceae) Tại Trung Quốc, nhà Y học cổ truyền sử dụng Đại diệp đằng để chữa đau phong tê thấp, bị tê liệt trẻ em sau di chứng, phình đại, viêm cột sống, trị vết thƣơng hở … Ngoài ra, rễ thân Đại diệp đằng đƣợc sử dụng để điều trị phong thấp đau xƣơng, đau mắt đỏ, đau lƣng, … đƣợc dùng trị ngoại thƣơng xuất huyết Xuất phát từ giá trị dƣợc học nhiều mặt Đại diệp đằng, đồng thời với mục đích cung cấp thêm tƣ liệu hóa lồi dƣợc liệu này, phục vụ khai thác phát triển nguồn gen dƣợc liệu quý thuộc danh lục thuốc quý Việt Nam Thanh Hóa, chúng tơi chọn “N n cứu c ểm hình thái, gen phân loại tinh dầu Đại diệp ằng (Tinomiscium petiolare) tạ T an Hóa” làm đề tài nghiên cứu Mục t u n n cứu Phân tích đƣợc đặc điểm hình thái, đặc điểm trình tự số gen phân loại thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng, phục vụ cho việc bảo tồn phát triển nguồn gen Đại diệp đằng Thanh Hóa Phạm vi nghiên cứu Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài tập trung phân tích đặc điểm hình thái, thành phần hóa học tinh dầu bƣớc đầu tạo liệu phân loại học phân tử dựa sở phân tích đặc điểm đoạn gen RpoC gen RbcL phân lập đƣợc, phục vụ nhận diện Đại diệp đằng Thanh Hóa Ý n ĩa k oa ọc t ực t ễn Kết phân tích đặc điểm hình thái, thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng phân bố nhƣ đặc điểm sinh học khác Đại diệp đằng cung cấp thêm liệu để đƣợc tƣ liệu khoa học cho Đại diệp đằng Thanh Hóa Đặc biệt trình tự nucleotide đoạn gen RpoC gen RbcL phân lập từ Đại diệp đằng liệu khoa học quý giúp nhận diện Đại diệp đằng cơng nghệ gen Kết nghiên cứu vừa có ý nghĩa khoa học vừa có nhiều ứng dụng thực tiễn Hình 3.9 Kết so sánh trình tự RbcL thu với trình tự RbcL cơng bố gen bank Kết hình 3.9 cho thấy, trình tự RbcL Đại diệp đằng thu đƣợc Bến En Pù Lng Thanh Hóa, Việt Nam khơng có khác nhau, điều khẳng định mẫu Đại diệp đằng chúng tơi thu Bến En Pù Lng có quan hệ di truyền nhóm lồi nhóm lồi Tinomiscium petiolare với trình tự RbcL cơng bố gen bank 40 mang mã số KF181577 tác giả Roeder,M (2013) Trung Quốc trình tự mang mã số EF173675 tác giả Wang,W and Chen, Z.-D (2006) Trung Quốc Mặt khác trình tự RbcL chúng tơi thu đƣợc có khác khơng nhiều so với trình tự RbcL cơng bố gen bank mang mã số FJ626591, JN051687, HQ620781, FJ026499, FJ026485 EU526983 Sự sai khác đƣợc khẳng định bảng 3.5 Bảng 3.3 Kết so sánh trình tự RbcL phân lập với trình tự RbcL công bố gen bank Kết bảng 3.5 cho thấy, trình tự RbcL mẫu Đại diệp đằng thu Bến En Pù Luông Thanh Hóa, Việt Nam có độ tƣơng đồng 100% khơng có sai khác so với trình tự RbcL loài Tinomiscium petiolare tác giả Roeder, M (2013) mang mã số KF181577 Trung Quốc trình tự mang mã số EF173675 tác giả Wang,W and Chen,Z.-D (2006) Trung Quốc Nhƣ vậy, quan hệ di truyền trình tự RbcL chúng tơi thu đƣợc hai trình tự RbcL cơng bố gen bank mã số KF181577 EF173675 nhóm lồi Trong sai khác trình tự RbcL chúng tơi thu đƣợc so với trình tự RbcL số lồi khác chi đƣợc cơng bố gen bank mang mã số FJ626591, JN051687, HQ620781, FJ026499, FJ026485 EU526983 lần lƣợt 0,057%; 0,019%; 0,019%; 0,019%; 0,019% 0,057% Mối quan hệ di truyền đƣợc thể hình 3.10 41 Hình 3.10 Sơ đồ so sánh quan hệ di truyền trình tự RbcL thu với trình tự RbcL cơng bố gen bank Kết hình 3.10 cho thấy, trình tự RbcL từ mẫu Đại diệp đằng thu đƣợc Bến En Pù Lng, Thanh Hóa, Việt Nam có quan hệ di truyền lồi lồi Tinomiscium petiolare với trình tự RbcL tác giả Roeder,M công bố năm 2013 mã số KF181577 trình tự RbcL tác giả Wang,W and Chen,Z.-D (2006) mã số EF173675 Tuy nhiên, trình tự RbcL chúng tơi thu đƣợc trình tự RbcL đƣợc công bố gen bank số loài Anamirta cocculus mã số FJ626591 Wang,W.et all năm 2009 Trung Quốc; Sphenocentrum jollyanum mã số JN051687 Wang,W., et all năm 2011 Trung Quốc; Fibraurea tinctoria mã số HQ620781 Jacques, F.M.B.,et all năm 2011 Trung Quốc; Penianthus longifolius mã số FJ026499 Hoot, S.B., et all năm 2008 Mỹ; Fibraurea tinctoria mã số FJ026485 Hoot, S.B., et all năm 2008 Mỹ; Anamirta cocculus mã số EU526983 Jacques, F.M.B and Bertolino, P năm 2008 Trung Quốc có hệ số phân ly di truyền không 42 nhiều, nhiên thể đƣợc nhóm lồi khác sơ đồ phát sinh 3.3 Kết p ân tíc t àn p ần óa ọc t n dầu rễ Đạ d ệp ằn Sau thu đƣợc tinh dầu rễ Đại diệp đằng, chúng tơi tiến hành xác định thành phần hóa học tinh dầu rễ để làm sở cho nghiên cứu tiếp theo, kết đƣợc trình bày bảng 3.6 Bảng 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng Rễ Đạ d ệp ằn Số hiệu mẫu : 2005211101 Kí hiệu Phân loại : mẫu thực vật Ngày nhận mẫu : 25/05/2020 Đặc trƣng : Rễ Dung lƣợng mẫu : 100 g Đóng gói : túi nilon Niêm phong : có Kiểu mẫu : mẫu phân tích Ngày trả : 22/06/2020 # time RI hit % chemical name : Rễ integral %FID 11.78 986 89 6-Methylhept-5-en-2-one 1968291 0.25 11.96 992 93 Myrcene 4255631 0.54 13.20 1029 15502705 1.48 13.36 1034 85 Limonene 1145937 0.21 14.37 1063 94 Terpinene 55463205 5.50 15.31 1091 14683296 1.21 15.66 1101 52 Linalool 3797195 0.55 18.56 1184 51 Isogeranial 4756470 0.52 19.05 1198 67 Terpineol 2321854 0.60 10 20.12 1229 94 Citronellol 9082806 1.23 11 20.21 1231 Nerol 109728 0.15 12 20.72 1246 75 Neral 87633091 9.69 13 21.07 1256 87 Geraniol 41861011 4.82 unknown (119, 134, RI 1029) unknown (119, 134, RI 1091) 43 14 21.72 1275 87 Geranial 147134345 16.65 15 22.70 1304 60 Geranyl formate 1215076 0.14 16 23.43 1326 75 Methyl geranate 1464786 0.11 17 24.34 1353 90 Citronellyl acetate 4898724 0.40 18 25.36 1384 89 Geranyl acetate 49381855 4.70 19 25.53 1389 95 Copaene 8712612 0.67 20 25.98 1403 91 Elemene 3360553 0.28 21 26.68 1425 35 Bergamotene 1561172 0.27 Caryophyllene 22 27.04 1437 91 (=Caryophyllene ) 33760309 3.07 23 27.33 1446 91 Bergamotene 33183040 2.71 24 27.45 1450 86 Cinnamyl acetate 243066 0.37 25 27.50 1452 86 Guaiene 450483 0.18 26 27.78 1460 96 Farnesene 8127385 0.97 27 28.12 1471 98 Humulene 7842553 0.92 28 28.36 1479 80 Caryophyllene 2268653 0.19 29 28.72 1490 58 Muurolene 8600373 0.76 30 28.94 1498 55 Zingiberene 21368414 2.18 31 29.16 1505 5314725 0.49 32 29.33 1510 81 Bisabolene 156280 0.42 33 29.38 1512 95 Farnesene 24593896 2.14 34 29.43 1514 39 Muurolene 3667709 0.90 35 29.55 1518 86 Bisabolene 58780240 5.07 410451 0.23 3654870 0.48 Selinene Bulnesene (=Guaiene 36 29.65 1521 51 ) 37 29.73 1524 88 Cuparene 38 29.91 1530 94 Cadinene 16828451 1.38 39 30.11 1537 92 Cadinene 23235855 1.59 44 40 30.28 1542 40 Bisabolene 5419269 0.29 41 30.44 1548 71 Kessane 3233624 0.45 42 30.53 1551 96 Bisabolene 461395 0.58 43 30.60 1553 12 Cadinene 1483337 0.26 44 30.79 1559 74 Calacorene 5194079 0.33 45 30.88 1562 42 Elemol 4768631 0.37 46 31.07 1569 76 Nerolidol 4114370 0.38 47 31.72 1591 54 Caryophyllenyl alcohol 2433402 0.17 48 32.03 1601 59 Junenol 730853 0.24 49 32.12 1604 70 Caryophyllene oxide 9233927 0.79 50 32.24 1609 75 Dodecyl acetate 10337459 0.79 51 32.87 1631 63 Humulene Epoxide II 2635087 0.25 52 33.09 1639 13 Eudesmol 17888933 1.35 Cadinol (=Tau53 33.62 1658 77 Cadinol) 2227595 0.50 54 34.04 1672 79 Cadinol 8850905 0.53 55 34.54 1690 85 Butylidenphthalide 9218537 0.80 56 36.32 1756 79 Ligustilide 59644121 4.45 57 41.66 1965 23 Palmitic acid 47089638 0.83 Total 87.31 Kết bảng 3.6 cho thấy, thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng, chúng tơi thu đƣợc có 57 hợp chất khác nhau, tỉ lệ hoạt chất giao động từ 0,11 % (Methyl geranate) đến 16,65 % (Geranial) Trong có 19 hoạt chất có giá trị y học dƣợc học, điển hình số hoạt chất có giá trị việc chống viêm, kháng khuẩn, tăng cƣờng chuyển hóa chất tế bào, tăng đề kháng … nhƣ Terpinene với hàm lƣợng 5,5%; Neral 9,69%; Ligustilide hàm lƣợng 4,45% số hoạt chất có mùi thơm 45 nhƣ Geranial chiếm 16,65%; Geranyl acetate hàm lƣợng 4,70%; Geraniol hàm lƣợng 4,82% Với thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng nhƣ trên, cở để tiếp tục thực nghiên cứu để khẳng định giá trị Đại diệp đằng 3.4 Kết t oạt tín k án v s n vật c ốn oxy óa t n dầu rễ Đạ d ệp ằn 3.4.1 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật c a tinh dầu rễ Đại diệp đằng Sau thu đƣợc thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng, tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu rễ Đại diệp đằng, kết đƣợc thể bảng 3.7 Bảng 3.5 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu rễ Đại diệp đằng STT mẫu Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, µg/mL) Kí hiệu 9539 rễ Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm mốc Nấm men E.coli P.aeruginosa B.subtilis S.arueus A.niger F.oxysporum C.albicans >200 >200 >200 >200 200 >200 >200 Đại diệp đằng Kết bảng 3.5 cho thấy, mẫu 9539 tinh dầu rễ Đại diệp đằng biểu hoạt tính kháng nấm mốc chủng A niger tƣơng đối tốt giá trị MIC = 200 µg/mL Điều hồn tồn phù hợp giá trị đông y Đại diệp đằng đƣợc công bố tác giả giới [25], [29] việc điều trị bệnh viêm nhiễm 3.4.2 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa c a tinh dầu rễ Đại diệp đằng Với đa dạng thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng, đặc biệt xuất số hợp chất quan trọng nhƣ Terpinene với hàm lƣợng 5,5%; Neral 9,69%; Ligustilide hàm lƣợng 4,45% ; chúng tơi tiến 46 hành thử hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu rễ Đại diệp đằng, kết đƣợc trình bày bảng 3.8 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu rễ Đại diệp đằng TT Ký hiệu mẫu Khả năn trun tự (SC,%) Kiểm chứng (+) òa ốc SC50 (µg/mL) 87,53 ± 0,3 11,5 0,0 ± 0,0 - 11,87 ± 0,8 ≥ 200 [axit ascorbic] Kiểm chứng (-) DPPH/EtOH+DMSO] Rễ Đại diệp đằng Kết bảng 3.8 cho thấy, mẫu thử khơng có biểu chống oxy hóa thử nghiệm khả trung hòa gốc tự tạo DPPH tới nồng độ thử nghiệm 200 µg/mL Nhƣ vậy, tinh dầu rễ Đại diệp đằng có tính kháng nấm A niger tƣơng đối tốt, nhiên khơng có tính chống oxy hóa 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Về đặc điểm hình thái, giải phẫu giá trị Đại diệp đằng i) Cây Đại diệp đằng thu Bến En Pù Lng (Thanh Hóa) thuộc chi Chi Tinomiscium Họ Tiết Dê (Menispermaceae) Đây dạng thân gỗ bụi, vỏ thân trƣởng thành có nhiều nếp nứt dọc theo thân, thân non có màu xanh, có rễ phát triển, màu nâu sẫm, khả xuyên sâu không cao Lá Đại diệp đằng có cuống tƣơng đối dài, 6,5 – 11 cm, phiến có màu xanh tƣơng đối đậm, kích thƣớc lá, rộng khoảng từ 9,0 đến 16 cm, dài khoảng 15-25 cm, gân hình xƣơng cá, mép khơng có cƣa Hoa màu trắng, mọc thành cụm, cuống hoa ngắn, mọc từ nách đỉnh thân cành, Đại diệp đằng hoa khoảng từ tháng 12 năm trƣớc đến tháng đầu tháng năm ii) Hai mẫu Đại diệp đằng thu Bến En Pù Lng (Thanh Hóa) giống hình thái đƣợc xác định loài iii) Đại diệp đằng loài dƣợc liệu quý, đƣợc sử dụng chữa số bệnh nhƣ tiêu hóa, kháng khuẩn, chữa vết thƣơng, chống viêm 1.2 Về đặc điểm phân loại học phân tử i) Hai đoạn gen lục lạp đƣợc phân lập từ hai mẫu Đại diệp đằng thu Bến En Pù Lng (Thanh Hóa) Đoạn gen RpoC có kích thƣớc 479 nucleotide đoạn gen RbcL có kích thƣớc 527 nucleotide ii) Dựa trình tự nucleotide đoạn gen RpoC RbcL, hai mẫu Đại diệp đằng thu Bến En Pù Lng (Thanh Hóa) thuộc lồi Tinomiscium petiolare 1.3 Về Thành phần hóa học tinh dầu hiệu kháng vi sinh vật chống oxy hóa tinh dầu rễ Đại diệp đằng Thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng tƣơng đối đa dạng, có tới 57 hợp chất, có nhiều hợp chất có giá trị dƣợc học, đặc biệt, 48 tinh dầu rễ Đại diệp đằng có tính kháng nấm A niger tƣơng đối tốt giá trị MIC = 200 µg/mL; nhiên khơng có tính chống đƣợc oxy hóa 1.4 Đã cơng bố trình tự gen ngân hàng gen banks Với mã số MW123080; MW123081; MW123082; MW123083 trình tự RbcL mã số MW123084; MW123085; MW123086; MW123087 trình tự RpoC Đề n ị Cần tiếp tục nghiên cứu đặc điểm sinh học khác phân tích thêm tác dụng dƣợc học Đại diệp đằng trình tự gen phân loại khác phục vụ thiết lập mã vạch DNA cho Đại diệp đằng Việt Nam nói chung Thanh Hóa nói riêng 49 TÀI LIỆ THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) cộng sự, Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập II-III, Nxb Nông nghiệp, 2003, 2005, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, III, tr.502-503 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Tiếng Anh Aron J F., Kevin S B., Prasad R K., Sean W G., Steven G N., Brian C H., Diana M P., Mehrdad Hajibabaei, Spencer C H B (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well” PLoS ONE, 3(7), pp 2802 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and longterm goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 18891895 German Serino and Pal Maliga (1998), “RNA Polymerase SubunrpoB2 Encoded by the Plastid rpo Genes Are Not Shared with the NucleusEncoded Plastid Enzyme” PlantPhysiol Aug, 117(4): 1165-1170 Hollingsworth Pm, G.S., Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PLoS ONE, (5) Kim S, Kim J, Liu J (2009) Genetic discrimination of Catharanthus roseus cultivars by pyrolysis mass spectrometry J Plant Biol 52: 462465 doi:10.1007/s12374-009-9059-1 50 10 Kress JW, Wurdack KJ, Zimmer EA, Wei LA, Janzen DH (2005) Use of DNA barcodes ti identify flowering plants Proc.Natl.Acad.Sci USA 102: 8369-8374 11 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 12 Ole S and Gitte P (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 13 Sandelius, Anna Stina (2009) The Chloroplast Interactions with the Environment Springer p 18 ISBN 978-3-540-68696-5 14 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 15 Paul D N Hebert*, Alina Cywinska, Shelley L Ball and Jeremy R deWaard (2003) Biological identifications through DNA barcodes Proc R Soc Lond B (2003) 270, 313-321 313 Ó 2003 The Royal Society DOI 10.1098/rspb.2002.2218 16 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (RPOB2) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 17 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 18 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle 51 ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 19 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 20 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 21 Wouter G van Doorn (2009), Role of chloroplasts and other plastids in ageing and death of plants and animals: a tale of Vishnu and Shiva Ageing research reviews, (2) :117-30 DOI: 10.1016/j.arr.2009.08.003 22 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 1407-1420 23 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of RPOB22 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 24 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 Tài liệu Internet 25 https://amp.thaythuoccuaban.com/vithuoc/dai-diep-dang.html 26 http://www.barcoding.si.eu) 27 http://www.kew.org/barcoding/protocols.html 28 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC561139 29 http://thaoduocsinhphuong.com/dai-diep-dang/ 30 http://webbook.nist.gov/chemistry/ 52 PHỤ LỤC Kết Blast en RpoC mẫu Đạ d ệp ằn t u tạ Thanh Hóa P1 PHỤ LỤC Kết Blast en RbcL mẫu Đạ d ệp ằn t u tạ Thanh Hóa P2
Ngày đăng: 18/07/2023, 00:17
Xem thêm:
