Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lan hoàng thảo bản địa ở phía nam việt nam

Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRỊNH THỊ HƯƠNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐỒN LAN HỒNG THẢO (DENDROBIUM) BẢN ĐỊA Ở PHÍA NAM VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI, NĂM 2011 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRỊNH THỊ HƯƠNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM) BẢN ĐỊA Ở PHÍA NAM VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.72 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Khuất Hữu Trung PGS.TS Nguyễn Xuân Viết HÀ NỘI, NĂM 2011 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Khuất Hữu Trung PGS TS Nguyễn Xuân Viết tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến GS TSKH Trần Duy Quý, ThS Trần Duy Dương giúp đỡ, hướng dẫn, bảo cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo viện Di truyền nơng nghiệp, cán phịng kỹ thuật di truyền tạo điều kiện giúp đỡ tơi thời gian nghiên cứu để hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học sư phạm Hà Nội, ban chủ nhiệm khoa Sinh học thầy cô giáo môn Di truyền học giảng dạy tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Học viên Trịnh Thị Hương Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acide AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Bp Base pair Cs Cộng CTAB Cetyl-trimethyl-amonium-bromid dNTPs Deoxynucleotide triphotphates EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilo base pair PCR Polymerase Chain Reaction PVP Polyvinyl Pyrrolidone QTL Quantitative Trait Loci RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSR Simple sequence repeat TAE Tris-Acetic acid-EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris-EDTA MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Lí chọn đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài .2 1.3.1 Ý nghĩa khoa học .2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược chi lan Hoàng thảo .4 2.1.1 Phân loại, vị trí, phân bố 2.1.2 Đặc điểm thực vật học lan Hoàng thảo 2.1.3 Sinh thái lan Hoàng thảo 2.2 Giá trị kinh tế nhu cầu thực tiễn lan Hoàng thảo 2.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa lan giới Việt Nam 2.3.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa lan giới 2.3.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa lan Việt Nam 11 2.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền hoa lan giới Việt Nam Error! Bookmark not defined 2.4.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền hoa lan giới 13 2.4.1.1 Nghiên cứu mức hình thái 13 2.4.1.2 Nghiên cứu mức phân tử 14 2.4.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền hoa lan Việt Nam .18 2.5 Tổng quan phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền 19 2.5.1 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào thị hình thái .19 2.5.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào thị phân tử 20 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu 25 3.1.1 Thực vật .25 3.1.2 Hóa chất: 26 3.2 Phương pháp nghiên cứu: 26 3.2.1 Phương pháp mô tả hình thái: 26 3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA: 27 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ 3.2.3 Điện di kiểm tra kết tách chiết ADN tổng số (gel agarose) 28 3.2.4 Phương pháp nhân gen kỹ thuật PCR: 28 3.2.5 Điện di sản phẩm PCR (gel agarose) 30 3.2.6 Phương pháp phân tích số liệu 30 3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu: 31 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết nghiên cứu đa dạng di truyền mức hình thái 32 4.1.1 Điều tra, thu thập các mẫu giớ ng/loài lan Hồng thảo phía Nam 32 4.1.2 Đánh giá đa dạng di truyền mức hình thái 32 4.2 Kết nghiên cứu đa dạng di truyền mức độ phân tử 48 4.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số 48 4.2.2 Kết phân tích đa hình DNA mẫu giống lan Hoàng Thảo 48 4.2.3 Kết phản ứng PCR-RAPD 49 4.2.4 Hệ số đồng dạng mối quan hệ di truyền mầu giống lan Hoàng Thảo: 59 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .63 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Lí chọn đề tài Hoa lan loài hoa đẹp kỳ lạ giới loài hoa Hoa lan biểu tượng cho thiện, cho đẹp tinh khiết cao, người Việt Nam biết đến hoa lan bao ngàn năm qua Những vị thuốc chữa bệnh có hoa lan lưu truyền từ đời qua đời khác ngày hôm Vua Trần Anh Tơng sưu tầm 500 lồi lan quý lập nên “Ngũ bách viên” vườn lan tương truyền “ phương Đơng có khơng hai”… Ngày hoa lan trở thành mặt hàng có giá trị kinh doanh, xuất giới [4] Họ Lan, hay họ Phong lan, (Orchidaceae) họ thực vật có hoa, thuộc Măng tây (Asparagales), lớp thực vật mầm (Monocotydonea) Họ Lan (Orchideceae) họ lớn thực vật phân bố toàn giới, ngoại trừ châu Nam Cực Các nhà khoa học chia hoa Lan thành nhóm: Phong Lan, Địa Lan Thạch lan Phong Lan loài sống gửi nhờ vào thân cao ẩm mục rừng núi cao Bên cạnh có lồi mọc đất, tức địa lan có số lồi mọc đá tức thạch lan [55] Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) có số lượng lớn với 1500 loài khác nhau, chi lớn thứ họ hoa Lan, sau chi Lan Lọng (Bulbophyllum) Vùng Đông Nam Á coi quê hương chi lan Hoàng thảo với hàng trăm loài khác nhau, riêng Việt nam có 100 lồi (Trần Hợp, 1998; Averyanoce cs., 2003), chúng phân bố rộng rãi khắp vùng miền Bắc, Trung miền Nam Việt Nam Với số lượng lớn lồi chi Lan Hồng Thảo có giá trị vậy, chưa có cơng trình nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hoá mức độ phân tử đa dạng di truyền tập đoàn Lan Hoàng Thảo Việt Nam cách sâu rộng, có hệ thống Do đó, việc đặt tên cho giống lộn xộn từ tên giống dịch sang từ tiếng Anh tiếng Latin, có nhiều tên giống trùng giống vùng, miền khác lại có tên khác Bên cạnh đó, việc di chuyển giống lan Hoàng Thảo Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ vùng, nước khác gây nhầm lẫn hiểu sai xuất xứ, nguồn gốc địa mối quan hệ di truyền giống với Điều gây khơng khó khăn việc bảo tồn, khai thác có hiệu kể thương mại giống hoa thị trường nước quốc tế Trong công tác bảo tồn sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá quỹ gen công đoạn vô quan trọng không phục vụ cho việc xác định giống/loài khác mà cịn nhằm tìm hiểu mối quan hệ di truyền giống/loài để bảo tồn đa dạng nguồn gen Sự phát triển mạnh mẽ phương pháp kỹ thuật lĩnh vực sinh học phân tử tạo công cụ hữu hiệu nhanh chóng ứng dụng nghiên cứu bảo tồn đa dạng sinh học Ưu kỹ thuật phân tử có khả xác định đa dạng mức độ gen, tạo sở để đánh giá giá trị bảo tồn loài quần thể Chính vậy, việc tạo lập sở liệu ADN (DNA fingerprinting) giống/loài Lan Hoàng Thảo vấn đề quan trọng, cấp bách, mang tính khoa học thực tiễn cao, khơng phục vụ cho lợi ích trước mắt mà cịn định hướng mục tiêu lâu dài công tác bảo tồn khai thác hiệu qủa nguồn gen phục vụ chương trình kinh tế trọng điểm Trên sở đó, tiế n hành đề tài nghiên cứu: “ Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lan Hoàng thảo (Dendrobium) địa phía Nam Việt Nam.” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Đánh giá đa dạng di truyền mức độ phân tử kết hợp với đặc điểm hình thái để xác định nguồn gốc, mối quan hệ di truyền giống/loài lan Hoàng thảo địa phía Nam Việt Nam, phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn, chọn lai tạo giống 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ - Hiểu biết đa dạng di truyền mức hình thái phân tử giống Lan Hoàng thảo địa sở để tuyển chọn nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn lai tạo giống mới; - Kết đề tài có ý nghĩa việc xây dựng tiêu chuẩn hoá phương pháp đánh giá nguồn gen làm sở cho việc xác định quyền thực quyền sở hữu trí tuệ tên giống hoa lan quý, đặc hữu nước ta, góp phần nâng cao thương hiệu cho sản phẩm giống hoa Phong Lan Việt Nam 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài góp phần thu thập lưu giữ nguồn gen lan Hồng thảo địa phía Nam Việt Nam nói riêng Việt Nam nói chung; - Kết nghiên cứu có ý nghĩa phân loại nhận dạng số lồi lan Hồng thảo đặc trưng, góp phần bảo tồn sử dụng hợp lí nguồn gen Hồng thảo quí Việt Nam Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược chi lan Hoàng thảo 2.1.1 Phân loại, vị trí, phân bố Phân loại: Chi Hồng thảo (Dendrobium) thuộc họ Lan (Orchidaceae),bộ Lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp Một mầm (Liliopsida), ngành thực vật Hạt kín (Angiospermanophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia), giới thực vật (Plantae) [21], [42] Vị trí, tiến hóa: Một nghiên cứu đăng tạp chí Nature nguồn gốc họ Lan có xuất phát điểm lâu đời so với dự tính ban đầu, có lẽ khoảng 76-84 triệu năm trước Một ong loài ong khơng ngịi tuyệt chủng, với danh pháp Proplebeia dominicana, tìm thấy bị mắc hổ phách Miocen khoảng 15-20 triệu năm trước Con ong mang phấn hoa lồi lan trước khơng rõ, Meliorchis caribea, cánh Đây chứng lan hóa thạch Lồi lan tuyệt chủng M caribea đặt tông Cranichideae, phân tông Goodyerinae (phân họ Orchidoideae) Điều họ Lan có nguồn gốc cổ đại phát sinh khoảng 76-84 triệu năm trước thời kỳ Hậu Creta Nói cách khác, lồi lan tồn với khủng long Nó vào thời gian trùng sinh vật thụ phấn tích cực cho lồi lan Theo M.W Chase ctv (2001) địa lý sinh học chung mơ hình phát sinh lồi họ Orchidaceae chúng chí cịn cổ phát sinh khoảng 100 triệu năm trước Sử dụng phương pháp đồng hồ phân tử, người ta xác định niên đại nhánh họ Lan Điều xác nhận phân họ Vanilloideae nhánh phân đôi sở lan với nhị đơn, phải tiến hóa sớm tiến hóa họ Do chi Vanilla phân họ có mặt nhiều nơi giới khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới, từ châu Mỹ qua châu Á, New Guinea Tây Phi, lục địa bắt đầu tách khoảng 100 triệu năm trước, nên trao đổi quần sinh vật đáng kể phải xảy sau chia tách (do niên đại Vanilla ước tính khoảng 60-70 triệu năm trước) [54] Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ Các số liệu bảng 4.3 thu cho thấy: với 368 phản ứng PCR nhân lên 1977 băng thuộc 608 loại băng có kích cỡ khác nhau, tất loại băng cho đa hình, khơng có băng đơn hình Kích thước băng có chiều dài nhỏ có kích thước khoảng 250bp, băng có chiều dài lớn khoảng 6000bp Xuất 159 băng xuất mẫu Trong số 23 mồi nghiên cứu, mồi OPA18 nhân lên tổng số băng nhiều 150 băng, mồi OPN10 nhân lên tổng số băng 42 băng Mồi OPA3 nhân lên tổng số 84 băng, gồm 28 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt; mẫu giống H6 băng có vị trí có kích thước khoảng 4000bp, mẫu giống H13 có băng vị trí có kích thước khoảng 1750bp, mẫu giống H5 có băng vị trí có kích thước khoảng 1500bp, mẫu giống H11 có băng vị trí có kích thước 800bp, băng mẫu giống H16 có kích thước khoảng 550bp băng mẫu giống H4 có kích thước khoảng 450bp Mồi OPA6 nhân lên tổng số 53 băng thuộc 25 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có tới băng cá biệt, băng nhất; xuất mẫu giống H12 (vị trí có kích thước khoảng 4000bp), mẫu giống H2 (vị trí có kích thước khoảng 3000bp), mẫu giống H3 (ở vị trí có kích thước khoảng 2500bp, 2200bp 1900bp), mẫu giống H13 (ở vị trí có kích thước khoảng 2100bp 950bp), mẫu giống H1 (ở vị trí có kích thước khoảng 1500bp) mẫu giống H9 (ở vịt trí có kích thước khoảng 375bp) Mồi OPN1 nhân lên tổng số 65 băng thuốc 27 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, xuất băng cá biệt băng nhất; mẫu giống H9 có băng vị trí có kích thước khoảng 2750bp, mẫu giống H3 có vị trí có kích thước khoảng 2250bp, mẫu giống H13 có kích thước khoảng 1250bp, mẫu giống H12 có vị trí có kích thước khoảng 1200bp, mẫu giống H10 có vị trí có kích thước khoảng 900bp, mẫu giống H2 có vị trí có kích thước khoảng 800bp, mẫu giống H4 có vị trí khoảng 500bp 450bp, mẫu giống H1 có vị trí có kích thước khoảng 380bp Mồi OPN2 nhân lên tổng số 96 băng thuộc 23 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng 56 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ đơn hình, có băng cá biệt băng xuất mẫu giống H1 (ở vị trí có kích thước khoảng 870bp), mẫu giống H3 (ở vị trí có kích thước khoảng 630bp) mẫu giống H16 (ở vị trí có kích thước khoảng 560bp) Mồi OPN3 nhân lên tổng số 68 băng thuộc 24 loại băng với kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt băng nhất; băng xuất mẫu giống H1 (ở vị trí có kích thước khoảng 3500bp), mẫu giống H7 (ở vị trí có kích thước khoảng 1500bp), mẫu giống H4 (ở vị trí có kích thước khoảng 450bp), mẫu giống H11 (ở vị trí có kích thước khoảng 625bp), mẫu giống H5 (ở vị trí có kích thước khoảng 500bp) mẫu giống H4 (ở vị trí có kích thước khoảng 300bp) Mồi OPN4 nhân lên tổng số 61 băng thuộc 21 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có tới băng cá biệt băng nhất; băng xuất mẫu giống H7 (ở vị trí có kích thước khoảng 1480bp), H13 (ở vị trí có kích thước khoảng 100bp, H7 ( vị trí có kích thước khoảng 950bp), H10( vị trí có kích thước khoảng 630bp), H9 (ở vị trí có kích thước khoảng 600bp), H3 (ở vị trí có kích thước khỏng 280bp) Mồi OPN7 nhân lên tổng số 61 băng gồm 21 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt băng nhất; băng có vị trí có kích thước khoảng 3100bp (mẫu giống H14), 1900bp (mẫu giống H1), 1600 (mẫu giống H7), 850bp (mẫu giống H9) 500bp (mẫu giống H3) Mồi OPN8 nhân lên tổng số 116 băng gồm 24 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt băng nhất; mẫu giống H3 có băng xuất vị trí có kích thước khoảng 3500bp, mẫu giống H2 có băng vị trí có kích thước khoảng 2700bp, mẫu giống H15 có băng xuất vị trí có kích thước khoảng 2400bp mẫu giống H4 có băng xuất vị trí có kích thước khoảng 300bp Mồi OPN9 nhân lên tổng số 123 băng thuộc 29 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt băng nhất; mẫu giống H7 có băng vị trí có kích thước khoảng 3400bp, mẫu giống H9 có băng vị trí có kích thước khoảng 1600bp, mẫu giống H1 có vị trí có kích thước khoảng 290bp 57 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ mẫu giống H3 có vị trí có kích thước khoảng 260bp Mồi OPN10 nhân lên tổng số 42 băng thuộc 15 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt băng nhất; băng xuất vị trí có kích thước khoảng 3500bp (mẫu giống H6), 3000bp (mẫu giống H12), 2750bp (mẫu giống H6), 2250bp (mẫu giống H5) 300bp (mẫu giống H1) Mồi OPN12 nhân lên tổng số 46 băng thuộc 20 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có tới băng cá biệt; băng cá biệt băng xuất vị trí có kích thước khoảng 1050bp (mẫu giống H4), 700bp (mẫu giống H16), 625bp (mẫu giống H9), 500bp (mẫu giống H10), 450bp 375bp (mẫu giống H1) 300bp (ở mẫu giống H10) Mồi OPN13 nhân lên tổng số 93 băng thuộc 30 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt băng nhất, xuất vị trí có kích thước khoảng 4000bp (mẫu giống H10), 3800bp (mẫu giống H12), 3500bp (mẫu giống H3), 2000bp (mẫu giống H12), 1300bp (mẫu giống H13), 1150bp (mẫu giống H11) 625bp (mẫu giống H9) Mồi OPN14 nhân lên tổng số 65 băng thuộc 23 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt băng nhất; mẫu giống H15 có băng xuất vị trí có kích thước khoảng 2500bp, mẫu giống H6 có băng vị trí có kích thước khoảng 550bp, mẫu giống H3 có băng vị trí có kích thước khoảng 500bp 300bp, mẫu giống H4 có băng vị trí có kích thước khoảng 375bp Mồi OPN17 nhân lên 74 băng thuộc 30 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có tới 10 băng cá biệt băng nhất; băng có vị trí có kích thước khoảng 3000bp (mẫu giống H6), 2700bp (mẫu giống H10), 2400bp (mẫu giống H11), 1950bp (mẫu giống H6), 1300 (mẫu giống H12), 850bp (mẫu giống H11), 820bp (mẫu giống H3), 780bp (mẫu giống H8), 750bp 450bp (mẫu giống H3) Mồi OPN18 nhân lên 81 băng thuộc 29 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có tới 12 băng cá biệt băng nhất; băng xuất vị trí có kích thước khoảng 3700bp 2600bp (đều mẫu giống H8), 2250bp (mẫu giống H7), 2100bp (mẫu 58 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ giống H10), 2000bp (mẫu giống H16), 1700bp (mẫu giống H11), 950bp (mẫu giống H10), 600bp 500bp (mẫu giống H1), 550bp 450bp (mẫu giống H 11), 350bp (mẫu giống H3) Mồi OPN19 nhân lên tổng số 58 băng thuộc 28 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có tới 15 băng cá biệt băng xuất vị trí có kích thước 6000bp (mẫu giống H6), 3400bp (mẫu giống H10), 3000bp 2750bp (mẫu giống H2), 2600bp (mẫu giống H3), 1900bp (mẫu giống H6), 1600bp (mẫu giống H5), 1550bp (mẫu giống H4), 1400bp (mẫu giống H8), 1200bp (mẫu giống H14), 1150bp (mẫu giống H15), 625bp (mẫu giống H2), 500bp (mẫu giống H12), 400bp (mẫu giống H3) 250bp (mẫu giống H13) Mồi OPN20 nhân lên 98 băng thuộc 29 loại băng có kích thước khác nhau, khơng có băng đơn hình, có băng cá biệt băng nhất; mẫu giống H7 có băng vị trí có kích thước khoảng 2700bp, mẫu giống H12 có băng vị trí có kích thước khoảng 2500bp, mẫu giống H9 có băng vị trí có kích thước khoảng 800bp, mẫu giống H3 có băng vị trí có kích thước khoảng 400bp, mẫu giống H12 có băng vị trí có kích thước khoảng 350bp mẫu giống H4 có băng vị trí có kích thước khoảng 250bp Số băng nhân lên trung bình cho 23 mồi 85,96 băng/mồi, số loại băng có kích thước khác trung bình cho 23 mồi 26,43 loại băng/mồi 4.2.4 Hệ số đồng dạng mối quan hệ di truyền mầu giống lan Hoàng Thảo: Số liệu thu từ 23 mồi RAPD thống kê phân tích phần mềm NTSYSpc2.02, từ thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền (bảng 4.4) sơ đồ hình mối quan hệ di truyền (hình 8) 59 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ Bảng 4.4: Hệ số tương đồng di truyền mẫu giống lan Hoàng Thảo H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H1 1.00 H2 0.70 1.00 H3 0.68 0.72 1.00 H4 0.71 0.70 0.69 1.00 H5 0.69 0.67 0.68 0.77 1.00 H6 0.66 0.65 0.60 0.64 0.64 1.00 H7 0.68 0.69 0.67 0.69 0.66 0.70 1.00 H8 0.68 0.65 0.64 0.67 0.66 0.61 0.67 1.00 H9 0.66 0.67 0.63 0.65 0.63 0.62 0.63 0.70 1.00 H10 0.66 0.65 0.62 0.68 0.63 0.64 0.66 0.64 0.64 1.00 H11 0.73 0.73 0.70 0.73 0.69 0.68 0.71 0.70 0.67 0.72 1.00 H12 0.70 0.70 0.65 0.73 0.68 0.65 0.69 0.69 0.65 0.66 0.73 1.00 H13 0.66 0.63 0.64 0.67 0.63 0.60 0.66 0.64 0.65 0.65 0.68 0.67 1.00 H14 0.72 0.69 0.69 0.71 0.68 0.65 0.71 0.70 0.70 0.68 0.73 0.71 0.81 1.00 H15 0.72 0.72 0.69 0.72 0.68 0.69 0.72 0.69 0.66 0.71 0.80 0.73 0.68 0.75 1.00 H16 0.70 0.68 0.69 0.71 0.65 0.65 0.70 0.68 0.67 0.67 0.73 0.71 0.67 0.72 0.73 1.00 Qua kết bảng 4.4 cho thấy hệ số tương đồng di truyền 16 mẫu giống lan Hoàng Thảo dao động khoảng từ 0,61 đến 0,81 Cặp mẫu giống (H6-H8) có mức sai khác di truyền lớn (hệ số tương đồng di truyền nhỏ 0,61) Kết phù hợp với đánh giá hình thái: mẫu giống H6 có thân mập, hình trụ, mềm cong hay bng xuống Lá mềm hình giáo, chia thuỳ nhỏ đỉnh, cịn mẫu giống H8 có thân hình chùy có hình thn, dày, cứng Mặt khác, đặc điểm hình thái hoa khác nhau, mẫu giống H6 có cánh hoa hình mác, mép nhẵn, đỉnh tù, cánh mơi hình gần trịn, mép mơi xẻ mịn Cịn mẫu giống H8 có cánh hoa hình thn, cánh mơi hình thoi cụt, đỉnh trịn có hai thùy lợp mép lên nhau, mép nhăn nheo, phần đỉnh mang u lồi tròn màu vàng có phủ nhú mịn Cặp mẫu giống (H13-H14) có hệ số tương đồng di truyền cao 0,81 60 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ Hình 8: Biểu đồ mối quan hệ di truyền giống lan Hồng Thảo Từ sơ đồ hình mối quan hệ di truyền giống lan Hoàng Thảo cho thấy mức độ đa dạng di truyền giống Hoàng Thảo lớn Kết xử lý số liệu cho thấy mức tương đồng 70% chia 16 mẫu giống lan Hoàng Thảo thành nhóm lớn: Nhóm I: Gồm mẫu giống H1, H11, H15, H16, H12, H4 H5 chia thành nhóm phụ: Nhóm I.1: Gồm mẫu giống: H1, H11, H15, H16 H12 Nhóm có hệ số di truyền dao động từ 0,70 (H1 – H12, H1 – H16) đến 0,80 (H11 – H15) Nhóm I.2: Gồm mẫu giống H4 H5 có hệ số tương đồng di truyền 0,77 Nhóm II: Gồm mẫu giống H2 H3, có hệ số di truyền 0,72 Nhóm III: Gồm mẫu giống H13 H14, có hệ số di truyền 0,81 Nhóm IV: Gồm mẫu giống H6 H7, có hệ số di truyền 0,70 Nhóm V: Chỉ có mẫu giống H10 Hệ số tương đồng di truyền mẫu giống H10 với 15 mẫu giống lại dao động từ 0,63 (H10 – H3) đến 0,68 (H10 – H4) Hệ số tương đồng di truyền H10 với nhóm I dao động từ 0,63 đến 0,68 Giữa H10 với nhóm II 0,62 – 0,68; H10 với nhóm III 0,65 – 0,68; 61 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ H10 với nhóm IV 0,64 – 0,66; H10 với nhóm VI 0,64 Như mẫu giống H10 có sai khác tương đối so với 15 mẫu giống nghiên cứu Nhóm VI: Gồm mẫu giống H8 H9, có hệ số di truyền 0,70 62 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận: Đánh giá đa dạng di truyền đặc điểm hình thái 15 mẫu giống Hồng Thảo thuộc chi Dendrobium địa phía Nam Việt Nam cho thấy: mẫu giống Lan Hoàng Thảo nghiên cứu đa dạng phong phú số lượng, hình dạng, kích thước, đặc điểm hình thái màu sắc thân, hoa Các mẫu giống có đặc trưng riêng hình dạng, kích thước thân; đặc trưng riêng số lượng lá, độ cứng lá, màu sắc Số lượng, kích thước màu sắc hoa đa dạng; đặc biệt cách trang trí cánh hoa, kiểu dáng, màu sắc trang trí cánh mơi đa dạng, đặc trưng riêng cho giống để phân biệt giống với toàn tập đoàn Ở mức phân tử, kết thực 368 phản ứng PCR-RAPD với 23 mồi ngẫu nhiên thu tổng số 1977 băng thuộc 608 băng có kích thước khác nhau, băng đa hình, khơng có băng đơn hình Dựa kết phân tích mức phân tử kỹ thuật PCR-RAPD, 16 mẫu giống nghiên cứu chia thành nhóm phụ thuộc nhóm lớn khác nhau: nhóm I gồm mẫu giống Hoàng Thảo Sợi, Hoàng Thảo Vani, Tiểu Bạch Hạc, Đại Bạch Hạc, Hồng Thảo Mơi Tơ, Tiểu Hồng Lạp Đại Hồng Lạp; nhóm II gồm mẫu giống Vảy rồng nhỏ vảy rồng trung; nhóm III gồm mẫu giống Hồng Hạc Hồng Hạc; nhóm IV gồm mẫu giống Hồng thảo Long Tu Nam Ý thảo; nhóm V có mẫu giống Hồng Thảo Tua; nhóm VI gồm mẫu giống Vảy cá Xương cá Kết nghiên cứu cho thấy: mẫu giống Hoàng Thảo thu thập đa dạng phong phú, nhiều mẫu giống thu thập địa phương có đặc điểm hình thái khác nhau, có giống thu thập vùng sinh thái khác lại nằm nhóm Vì cần có bổ sung hỗ trợ phương pháp phân loại mức hình thái phân loại dựa vào đa hình di truyền mức phân tử để cơng việc phân loại trở nên xác Kết đánh giá đa dạng mức hình thái kết hợp với phân tích mức phân tử sở để xây dựng tiêu nhận dạng loài lan Hoàng Thảo địa 63 Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ phía Nam Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác sử dụng cách có hiệu nguồn gen Hồng Thảo địa Việt Nam 5.2 Đề nghị: Cần tiếp tục điều tra, thu thập thêm giống/loài Lan Hoàng Thảo địa, xây dựng tập đoàn Hoàng Thảo phục vụ cho công tác nghiên cứu phân loại, bảo tồn; Tiếp tục nghiên cứu sâu mức phân tử để xác định marker /chỉ thị nhận dạng xác nguồn gen địa quý Việt Nam 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt: Nông Văn Duy, Nguyễn Thị Lang cs (2001), Các loại lan Lâm Đồng, Thông tin khoa học công nghệ Lâm Đồng, (1), tr – 11 Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997), Sinh học phân tử, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Trần Hợp (1990), Phong lan Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Phan Thúc Huân (2010) Hoa Lan - Nuôi trồng & Kinh Doanh, Nhà xuất Phương Đông Nguyễn Hữu Huy, Phan Ngọc Cấp (1995), “Mấy nét cội nguồn Phong lan – Đặc sản quý nước nhiệt đới”, Việt Nam hương sắc, (1), tr 15 – 16 Dương Đức Huyến (2007), “Họ lan – Orchidaceae Juss Chi Hoàng Thảo – Dendrobium”, Thực vật chí Việt Nam, tr – 11 Leonid V Averyanov, Anna L Averyanov (2993), Trích yếu cập nhật hóa lồi lan Việt Nam, Nhà xuất Đại học Quốc Gia, tr 12 – 18 Phạm Thị Liên, 2001 Nghiên cứu đánh giá phát triển số giống Địa lan miền Bắc Việt Nam Luận án Tiến sỹ Khoa học nông nghiệp Nguyễn Xuân Linh (2002), Điều tra thu thập, đánh giá bảo tồn nguồn gen hoa cảnh khu vực miền Bắc Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp 10 Nguyễn Xuân Linh (2002), Điều tra thu thập, đánh giá bảo tồn nguồn gen hoa cảnh khu vực miền Bắc Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp 11 Võ Thị Thương Lan (2005), Sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 12 Lưu Chấn Long (2003), Trồng thưởng thức lan nghệ thuật, Nhà xuất Đà Nẵng 13 Leonid V Averyanov, Anna L Averyanova, 2003 Trích yếu cập nhật hố loài lan Việt Nam Nxb Đại học Quốc gia, tr 12-18 Trịnh Thị Hương 14 Luận văn thạc sĩ Lê Đình Lương, Nguyễn Đình Thi (2000), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 15 Võ Thị Bạch Mai, Nguyễn Trần Đông Phương (1999),khả tạp tiền củ giống lan Hồ Điệp Dtps Putuz Beaty-king Shiang Beauty x Kour’s Valentine, Báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 1999 16 Đường Lợi Na, Kỹ xảo nuôi trồng thưởng thức đánh giá sản phẩm tinh hoa, NXB Nông nghiệp Trung Quốc, tr 35-50 17 Nacy Laws – Đà Thị Lược (dịch giả) (2003), “Hoa cảnh”, Hội hoa lan cảnh Thành phố Hồ Chí Minh, 79(1), tr.36 – 40 18 Nguyễn Công Nghiệp (1998), Trồng hoa lan, NXB Thành Phố Hồ Chí Minh 19 Đặng Qn (1985), Ni trồng hoa lan, Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh 20 Trần Duy Quý (1997), Các phương pháp chọn tạo giống trồng, Nhà xuất Nông nghiệp 21 Trần Duy Quý (2005), Sổ tay người Hà Nội chơi lan, NXB Nông nghiệp 22 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Xuân Trường, Đỗ Năng Vịnh (2003), Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống nuôi trồng phong lan Phalaenopsis, Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 2003, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 23 Nguyễn Quang Thạch (2005), Kỹ thuật trồng lan Hồ Điệp, nhà xuất Nơng nghiệp 24 Nguyễn Nghĩa Thìn (1997), Cẩm nang nghiên cứu đa dạng sinh vật, Nhà xuất Nông nghiệp 25 Trần Thị Thúy, 2007 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) Việt Nam, Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp I 26 Lê Thị Kim Tuyến (1999), Tìm enzyme giới hạn từ vi khuẩn thiên nhiên Việt Nam nhằm ứng dụng nghiên cứu dịch tễ học chẩn đoán bệnh Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ phương pháp RFLP, Luận án tiến sĩ khoa học y dược, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 27 Trần Duy Vương, Khuất Hữu Trung cs (2006), “Nghiên cứu đa dạng di truyền mức hình thái tập đồn Lan Kiếm Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, (14), tr 16 – 19 28 Khuất Hữu Trung cs., 2007 “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn Địa lan mức phân tử kĩ thuật PCR - RAPD” Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn năm 2007, số14, tr 26-30 29 Bộ Khoa học Công nghệ - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 2007, “Thực vật chí Việt Nam – Flora of VietNam – tập 9” NXB Khoa học kĩ thuật B Tài liệu Tiếng Anh: 30 Aceto S., Caputo P., Cozzolino S., Gaudio L., and Moretti A., 1999 Phylogeny and evolution of Orchids and allied genera based on ITS DNA variation: morphological gaps and molecular continuity Molecular Phylogenetics and Evolution 13, pp 67–76 31 Baldwin B G., Sanderson M J., Porter J M., Wojciechowski M F., Campbell C S and Donoghue M J (1995), “The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny”, Annals of the Misouri Botanical Garden, 82, pp 247 – 277 32 Bateman R M., 2001 “Evolution and classification of European orchids: insights from molecular and morphological characters”, Journal Europsischer Orchideen, 33, pp 33-119 33 Bernatzkyb R And Tanksley S D (1986), “Toward a saturated map in tomato base on isozymes and random cDNA sequences”, Genetics, 112, pp 887 – 898 34 Chase M W., Cameron K M., Hills H G and Jarrell D C (1994), DNA sequenses and phylogenetics of the Orchidaceae and other lilioid monocots, Proceedings of the 14th World Ochid Conferen, Edinburgh: HMSO Trịnh Thị Hương 35 Luận văn thạc sĩ Chase M W (1999), “Molecular systematics, parsimony, and orchid classification”, In Pridgeon A M., Gribb P J., Chase M C., Rasmussen F N., eds Genera Orchidacearum General introduction, Apostasioideae, Cypripedioideae, Oxford: Oxford University Press, pp 81 – 88 36 Cozzolino S., Caputo P., Aceto S., Rossi W., De Luca P., 1996 Testing the usefulness of ITS1 sequence as a tool to infer relationships in Orchids L Delpinoa 33/34, pp 77– 85 37 Cozzolino S., Aceto S., Caputo P., Gaudio L., and Nazzaro R., 1998 Phylogenetic relationships in Orchis and some related genera: an approach using chloroplast DNA Nordic Journal of Botany 18, pp 79–87 38 Cozzolino S., Aceto S., Caputo P., Gaudio L and Nazzaro R., 2001 “Phylogenetic relationships in Orchids and some related genera: an approach using chloroplast DNA”, Nordic Journal of Botany, 18, pp 79-87 39 Delforge, P., Jul-Aug (1995), “ Some obervations on the orchids of the island of Euboea (Greece)”, Nateralistes-Belges (Belgium), pp25 – 29 40 Douzery E.J.P., Pridgeon A.M., Kores P., Linder H.P., Kurzweil H., and Chase M.W., 1999 Molecular phylogenetics of Diseae (Orchidaceae): a contribution from nuclear ribosomal ITS sequences American Journal of Botany 86, pp 887–899 41 Freudenstein J V., Senyo D M and Chase M W., 2000 “Phylogenetic implications and comparative utility of 26S and ITS2 sequences in Orchidaceae”, Americal Journal of Botany, 87, pp 127-128 42 Johan, Clare H., David D P., Philip C and Jean B (2007), Orchids of Madagascar, Kew Publishing, 2nd Edition, pp 305-310 43 Li Dong-meil., YE Qing-sheng and ZHU Gen-fa., 2007 “Analysis of the Germ plasm Resources and Genetic Relationships among Hybrid Cymbidium Cultivars and Native Species with RAPD Markers”, Agricultural Sciences in China, pp 922-929 Trịnh Thị Hương 44 Luận văn thạc sĩ Lin and K Ishiki (2002), “Genetic diversity of Mimocarpus longan in China revealed by AFLP markers and partial rbcL gene sequences”, Sci Horticult, 103, pp 489 – 498 45 Murata K., Fujiwara M., Kaneda C., Takumi S., Mori N and Nakamura C (1998), “RFLP mapping of a brown planthopper (Nilaparvata lugens) resistance gên bph2 of indica rice introgressed into a japonika breeding line Norin-PL4”, Genes and Genetic Systems, 73, pp 359-364 46 Obara-Okeyo P and Kako S., 1998 Genetic diversity and identification of cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers Euphytica, 99, pp 95-101 47 Olson M., Hood L., Cantor C and Botstein D A (1989), “Common languege for physical mapping ò the human genom”, Science, 245, pp 1434 – 1435 48 Pellegrino G., Musacchio A., Noce M E., Palermo A M and Widmer A , 2005 “Reproductive Versus Floral Isolation Among Morphologically Similar Serapias L Species (Orchidaceae)”, Journal of Heredity, 96(1) pp 15-23 49 Pridgeon A M., Bateman R M., Cox A V., Hapeman J R and Chase M W., 1997 “Phylogenetics of the subtribe Orchidinae (Orchidoideae, Orchidaceae) based on nuclear ITS sequences”, 12, pp 89-109 50 Salazar G A (2003), Phylogeny and classification of Subtribe Spiranthinae (Orchidaceae, Orchidoideae), Unpublished PhD Thesis, University of London/Royal Botanic Gardens, Kew 51 Serikawa T., Kuramoto T., Hilbert P., Mori M., Yamada J., Dubay C J., Lindpainter K., Ganter D and Guenet J L (1992), “Rat gene mapping using PCR – analyzed microsatellite”, Genetics, 131, pp 701- 722 52 Williams J G K., Kubelik A R and Livak D L (1990), RAPD Protocols, CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory, pp 40 – 41 53 http://www.huaf.edu.vn/index Trịnh Thị Hương Luận văn thạc sĩ 54 http://www.academicjournals.org/jmpr/ 55 http://www.botanyvn.com/cnt.asp? 56 http://www.bukisa.com/articles/329145_orchids-medicinal-value 57 http://www.ethnoleaflets.com/leaflets/duggal.htm 58 http://healthmad.com/health/orchids-beauty-and-medicinal-value/ 59 http://www.hoanggiaporchid.com/index 60 http://www.hrt.msu.edu/faculty/Runkle/Orchid 61 http://qjmed.oxfordjournals.org/content/98/9/625.full#T4 62 http://www.rauhoaquavietnam.vn/default.aspx 63 http://www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn 64 http://vi.wikipedia.org/wiki/Lan_hoang_thao