Các giống hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trên thị trường rất đa dạng và phức tạp, rất khó để phân biệt giữa giống này với giống khác vì đặc điểm hình thái bên ngoài của chúng rất giống nhau trước khi phát triển hoa. Bài viết trình bày đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp (Dendrobium anosmum) bằng giải trình tự vùng ITS (Internal transcribed spacer).
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN HOA LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP (DENDROBIUM ANOSMUM) BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG ITS (INTERNAL TRANSCRIBED SPACER) Khuất Hữu Trung1, Trương Quốc Chính2, Trần Duy Dương1, Kiều Thị Dung1, Trần Đăng Khánh1* TÓM TẮT Các giống hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp (Dendrobium anosmum) thị trường đa dạng phức tạp, khó để phân biệt giống với giống khác đặc điểm hình thái bên chúng giống trước phát triển hoa Trong nghiên cứu này, 118 mẫu giống Hoàng Thảo Phi Điệp (Dendrobium anosmum) thu thập vùng khác khuếch đại giải thành công vùng ITS1, 5.8S ITS2 (Internal Transcribed Spacer) với chiều dài từ 700 - 800 bp Dựa kết giải trình tự vùng ITS xác định 02 mẫu giống khác biệt mẫu giống L28 (Hạc vĩ - Dendrobium aphyllum) mẫu giống L35 (Hoàng Thảo trầm - Dendrobium parishii), mẫu giống lại thuộc lồi Dendrobium anosmum Qua kết so sánh trình tự đoạn ITS mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp địa Việt Nam giới cho thấy chúng có độ tương đồng cao so với mẫu giới, có sai khác số vị trí nucleotide từ đoạn 592-646 bp phân thành nhóm khác Dựa vào trình tự sai khác nhận dạng số mẫu giống lồi Vì vậy, muốn xác định xác giống lồi Dendrobium anosmum Việt Nam, cần tiếp tục sử dụng thêm thị khác SSR ISSR giải trình tự hệ gen giống nhóm Từ khóa: Hồng Thảo Phi Điệp (Dendrobium anosmum), Hồng Thảo trầm (Dendrobium parishii), vùng ITS (internal transcribed spacer), Hạc vĩ (Dendrobium aphyllum), mã vạch DNA ĐẶT VẤN ĐỀ Chi lan Hồng Thảo (Dendrobium) có số lượng lớn, đa dạng hình dáng, màu sắc kích thước với 1.148 loài khác nhau, đứng thứ họ hoa lan, sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) (Leitch cs., 2009) Vùng Đơng Nam Á coi q hương chi lan Hoàng Thảo với hàng trăm loài, chúng biết đến loài hoa tràn đầy sức sống mạnh mẽ Chúng sống bám thân hốc đá rừng sâu Với phong phú chủng loại màu sắc, kích thước hoa Hồng thảo có nhiều lồi có giá trị thẩm mỹ kinh tế cao Ở Việt Nam, chi lan Hoàng Thảo có đến 100 lồi khác xếp 14 tông phân biệt phức tạp thân, lá, hoa (Trần Hợp, 2009) Đã có số cơng trình nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền với chi lan Hoàng Thảo Việt Nam tác giả Tran Duy Duong cs., 2018; Trần Viện Di truyền Nơng nghiệp Resort Hoa lan Chính Trương *Email: tdkhanh@vaas.vn Hoàng Dũng cs., 2012; Nguyễn Thị Pha cs., 2012, nhiên tác giả chủ yếu tập chung vào loài thuộc chi lan Hồng Thảo, chưa có tác giả nghiên cứu sâu loài lan Hoàng Thảo Phi Điệp Dendrobium anosmum Rất nhiều loài lan Hoàng Thảo Phi Điệp khác với lồi lân cận điểm hình thái nhỏ tinh tế, khó để nhận diện chúng phương pháp hình thái thơng thường (Liu cs., 2014) Trong tự nhiên D anosmum có vài biến dị biến dạng hồng nhạt, hồng thẫm cánh trắng lưỡi tím, mũi trắng (Trần Hợp, 2009) Hiện tại, thị trường hoa lan Việt Nam, số giống hoa lan Phi điệp giống cánh trắng: Bảo Duy, Vĩnh Khang, Cờ đỏ, Bướm Đại Ngàn, Bạch Tuyết… số giống phi điệp hồng Tuyết Đỉnh Hồng, Hồng Mỹ Nhân, Hồng Minh Châu có giá trị cao gây sốt thị trường hoa lan Các giống lan Phi Điệp thị trường đa dạng phức tạp khó để phân biệt giống với giống khác hình dáng bên chúng giống trước phát triển hoa Với phát triển mạnh mẽ phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử hin ó cú nhiu Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 5/2021 11 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ứng dụng để giúp xây dựng mã vạch (bacode) nhận diện đánh giá đa dạng di truyền loài sinh vật sống thị phân tử AFLP, ISSR, SSR, RAPD, ITS (Williams cs., 1990; Tsai cs., 2002; Paromik Suman, 2014; Prattana Phuekvilai cs., 2009; Sharma cs., 2012; Wangvà cs., 2011; Swati Das cs., 2014; Parab Krishman, 2008; Liu cs., 2014; Xu cs., 2015) Mã vạch ADN sử dụng trình tự ADN ngắn nằm genome sinh vật chuỗi ký tự giúp phân biệt hai giống/loài sinh vật với Có nhiều đoạn gen nhân gen nằm lục lạp thực vật sử dụng phân tích phân loại thực vật như: ITS15.8S-ITS2, 18 rRNA, rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL 2012; Trần Duy Dương cs., 2018) Trong nghiên cứu 118 mẫu lan Hồng Thảo Phi Điệp (D anosmum) giải trình tự vùng ITS để định hướng xây dựng thị phân tử nhận dạng xác lồi phi điệp địa quí Việt Nam VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Vật liệu 118 mẫu/giống lan thu thập nhà vườn miền Nam, miền Trung miền Bắc nhà vườn Resort Hoa Lan Chính Trương thu thập cung cấp (Bảng 1) 10 11 12 13 14 Bảng Danh sách mẫu nghiên cứu Tên mẫu Ký TT Tên mẫu hiệu cánh trắng Văn Lang L1 26 Hồng nguyên thủy Người đẹp Bình Dương L2 27 Mắt trâu Bạch tuyết L3 28 Phi điệp xọc Gái nhảy L4 29 cánh trắng Củ Chi cánh trắng Phú Quý L5 30 mắt cánh trắng Nghệ An L6 31 Hồng lộc Hồng yên thủy L7 32 cánh trắng Phú Thọ Thảo nguyên L8 33 GSQHL Trầm bạch tạng L9 34 cánh trắng HO Phi điệp tía L10 35 cánh trắng HO Hồng gia lai L11 36 Hồng Quý cánh trắng HO1 L12 37 Ngọc nữ Tây Nguyên Người đẹp không tên L13 38 cánh trắng Ngọc Sơn Cước Mắt mờ Hải Dương L14 39 Người đẹp Không tên 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 51 52 53 54 55 cánh trắng mũi trắng Xước Đường Lâm Hồng hạc cánh trắng HO2 Hồng ngạc sơng Đà cánh trắng Phan Giang Hồng xịe Hồng Minh Châu Xước Chính Trương Tuyết đỉnh hồng cánh trắng Tản Viên cánh trắng Thủy Tinh Năm Hồng Hồng Điện Biên Hồng Bình An cánh trắng Bảo An TT 12 matK… giúp phân định loài họ Dendrobium (Takamiya cs., 2011; Singh cs., L15 L16 L17 L18 L19 L20 L21 L22 L23 L24 L25 L51 L52 L53 L54 L55 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 85 86 87 88 89 Ký hiệu L26 L27 L28 L29 L30 L31 L32 L33 L34 L35 L36 L37 L38 L39 cánh trắng Bảo Duy L40 cánh trắng Thảo Chi cánh trắng Bảo Duy Hoa hậu Xứ Mường Bướm đại ngàn cánh trắng Cờ Đỏ cánh trắng Kim cánh trắng Cố hương Ngọc Sơn Cước cánh trắng Mắt ngọc sông Đà Hồng Cao Bằng Kiều Phi Yến Đôi mắt Pleiku cánh trắng Nguyễn Ng Vinh cánh trắng Dầu Tiếng cánh trắng Vô thường) L41 L42 L43 L44 L45 L46 L47 L48 L49 L50 L85 L86 L87 L88 L89 N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 5/2021 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 Hồng Hà My cánh trắng Mắt Phương cánh trắng Trường Sa cánh trắng Mẹ tơi cánh trắng Khánh Ngọc Hồng Bích Quyết Hồng Nhật Hạ Ngọc nữ thác mơ Bạch trà cánh trắng Thanh Hóa Hồng Như ý Hồng Á hậu cánh trắng Lê Chăm cánh trắng ướt mi Hồng mỹ nhân cánh trắng Thiên Thi Hồng Lâm Hải cánh trắng Thuận Thiên cánh trắng Thảo Chi cánh trắng Vĩnh Khang cánh trắng Mắt Trâu Người đẹp không tên Hồng Diệp Hồng Sao Hỏa Hồng Dầu Tiếng Hồng Minh Châu cánh trắng Mày ngài cánh trắng Mắt lệ cánh trắng Kinh Bắc L56 L57 L58 L59 L60 L61 L62 L63 L64 L65 L66 L67 L68 L69 L70 L71 L72 L73 L74 L75 L76 L77 L78 L79 L80 L81 L82 L83 L84 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 2.2 Phương pháp nghiên cứu ADN tổng số tách chiết theo kit Thermo (GeneJet Plant genomic DNA purification mini kit) kiểm tra nồng độ phương pháp điện di gel agarose 1% Phản ứng PCR tiến hành máy Veriti 96 well Thermal cycler Tổng thể tích phản ứng 15 µl, bao gồm: µl ADN; 0,15 µM cặp mồi ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATT GATATGC) (Vilgalys cs., 1994); 0,2 mM dNTPs; 1X Buffer PCR; 2,5 mM MgCl2 0,25 U Taq polymerase Chu trình nhiệt phản ứng PCR gồm: 94C (5 phút), 36 chu kỳ [94C (1 phút), 56C (45 giây), 72C (50 giây)] kết thúc 72C (7 phút), giữ 4C - Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% sử dụng đệm TAE (1X) Gel nhuộm cánh trắng mũi L90 cánh trắng Xuân Phúc L91 Tiên xa L92 cánh trắng Hai Phụng L93 cánh trắng Sơn nữ L94 Hồng Hờn L95 Không tên L96 cánh trắng Lạp Bảo L97 cánh trắng Cát Tường L98 cánh trắng Euro L99 cánh trắng Ngọc Hiền L100 Da vàng L101 Ngọc Minh Tâm L102 cánh trắng Như ý L103 Vô thường L104 Pleiku xanh L105 cánh trắng SH L106 cánh trắng Vĩnh Khang L107 cánh trắng cố hương L108 cánh trắng Cờ Đỏ L109 cánh trắng vọng xưa L110 Hồng ngọc L111 Mắt ngọc Bạch Đằng L112 Ngọc Lan 68 L113 Hồng L114 cánh trắng Vĩnh Khang L115 cánh trắng Ngọc Nam Kinh L116 cánh trắng Dream Hiếu Hoàng L117 Kiều Phi Yến L118 Ethidium Bromide 0,5 mg/ml soi máy Alpha Imager 1220 (Alpha Innotech, CA, USA) - Sản phẩm PCR thơi gel theo quy trình hướng dẫn kit Qiagen - Giải trình tự: Sản phẩm PCR sau tinh sạch, giải trình tự Công ty Apical Scientific (Malaysia) - Phương pháp xử lí số liệu: Dữ liệu trình tự nucleotid xác định mơ hình tiến hóa tối ưu cách sử dụng chuẩn thông tin Akaie hiệu chỉnh (corrected AICc – Akaike Information Criterion) phần mềm jModelTest 0.1 (Posada, 2008) chạy Java Kết giải trình tự so sánh với trình tự tham chiếu NCBI phân tích chương trình MEGA v6.06 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khuếch đại vựng ITS bng PCR Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 5/2021 13 KHOA HC CÔNG NGHỆ Kết cặp mồi ITS1 ITS4 khuếch đại thành công đoạn ITS, sản phẩm PCR thu có chất lượng tốt với băng rõ cho mẫu giống lan Hoàng Thảo Phi Điệp gel agarose sau điện di Các băng có kích thước khoảng 700–800 bp Kết phù hợp với kết nghiên cứu tác giả khác khuếch đại vùng ITS lan Hoàng Thảo (Xu cs., 2015; Chiang cs., 2012; Trần Hoàng Dũng cs., 2012; Liu cs., 2014; Tran Duy Duong cs., 2018) Sản phẩm đoạn ITS sau khuếch đại PCR tinh Qiagen Kit Chất lượng ADN kiểm tra gel agarose 0,8% sau gửi giải trình tự Kết đọc trình tự 118 mẫu giống lan Hồng Thảo Phi Điệp rõ hai trình tự xi trình tự ngược Sau có trình tự, kết mẫu giống trình tự đem so sánh với trình tự hoa lan Hoàng Thảo giới dựa ngân hàng GenBank cơng cụ BLAST Hình Ảnh điện di đoạn ITS 118 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp khuếch đại PCR với cặp mồi ITS1 ITS4 L1-L118: Các mẫu giống lan Phi điệp M: 100b ladder 3.2 Kết phân tích trình tự mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trình tự vùng ITS Trình tự mẫu phân tích kiểm tra tính tương đồng với trình tự sẵn có ngân hàng GenBank cơng cụ BLAST Kết tìm kiếm cho thấy tất trình tự nói tương đồng với trình tự vùng ITS loài Dendrobium, độ bao phủ tương đồng đạt 99-100% Điều cho thấy mẫu thu thập ngồi thực địa khơng bị lẫn tạp mẫu khác, trình bảo quản mẫu tốt, quy trình tách chiết DNA, giải trình tự đạt độ tin cậy cao Trình tự mẫu phân tích đệ trình lên ngân hàng GenBank để xác nhận số gia nhập/truy cập (acession number) Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) cho thấy vùng ITS1 mẫu phân tích có chiều dài 270-277 bp Vùng 5.8S ITS2 có chiều dài khơng đổi tất mẫu 164 244 bp Hơn vùng 18S, 23S 5.8 S có mức độ bảo tồn cao Trong vùng ITS1 ITS2 lại có biến thiên lớn Các kết hồn tồn phù hợp với nhiều cơng bố vùng ITS chi Dendrobium (Takamiya cs., 2011; Singh cs., 2012; Xu cs., 2015) Việc so sánh với sở liệu GenBank nhằm mục đích cho kết tham chiếu với 14 nhóm lồi tương đồng với trình tự truy vấn Kết BLAST cho thấy mẫu thu thập có 116 mẫu thuộc lồi Dendrobium anosmum, có 02 mẫu L28 thuộc loài Dendrobium aphyllum (Hạc vĩ) L35 thuộc loài Dendrobium parishii (Hoàng Thảo Trầm) Xét hình thái, hai mẫu giống thân giống mẫu giống Phi điệp hoa chúng có điểm khác biệt có mùi thơm đặc trưng Kết tương tự kết nghiên cứu Trần Hoàng Dũng cs, 2012 sử dụng trình tự vùng ITS phương pháp xây dựng tiến hóa xác lập vị trí tiến hóa hai loài D Parishii D anosmum cho thấy D anosmum D parishii tiến hóa từ tổ tiên chung, D parishii phân kỳ sớm D anosum Q trình tiến hóa gần đặc tính hình thái ngồi hai lồi chưa có khác biệt rõ rệt Cũng dựa vị trí phát sinh chủng lồi, số mẫu định danh hình thái D parsihii xác lập lại tên khoa học D anosmum Ngoài dựa tốc độ tiến hóa, phân tích trình tự quan sát hình thái, gợi ý thấy đột biến màu sắc hương thơm diễn độc lập gen nhóm gen liên quan không liên quan đến vùng ITS (Trn Hong Dng v cs., 2012) Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 5/2021 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ 3.3 Kết so sánh trình tự đoạn ITS số mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo địa Việt Nam giới Để so sánh khác biệt trình tự mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp (D anosmum) Việt Nam giới, tiến hành phân tích trình tự mẫu giống lan Hoàng Thảo Phi Điệp Việt Nam giới dựa phân tích cột thẳng hàng (Hình 2) Hình Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp với mẫu giống giới Qua kết phân tích cho thấy mẫu hoa lan Hồng Thảo Phi Điệp Việt Nam có độ tương đồng cao so với mẫu giới, có sai khác số vị trí nucleotide từ đoạn 592-646 bp nên khó để phân biệt khác biệt mẫu giống lồi Chính vậy, việc sử dụng thị ITS nhận dạng loài với chi, khó nhận dạng hết cá thể (các giống) với loài 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loài Để tạo sở liệu vùng ITS cần thiết để xây dựng phát sinh chủng loài mẫu giống lan Hoàng Thảo Phi Điệp (Dendrobium anosmum) nghiên cứu này, thu thập thêm trình tự trình tự vùng ITS lồi Dendrobium anosmum (KJ944630.1; KP743544.1), Dendrobium parishii (HM 590378.1; KJ944629.1) có quan hệ gần với D anosmum D parishii loài Dendrobium aphyllum Ngồi 01 trình tự ITS lồi Dendroium lituiflorum (KJ944624.1) thu thập để làm nhóm đối chng ngoi (outgroup) (Hỡnh 3) Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 5/2021 15 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Dựa sơ đồ hình phát sinh loài cho thấy, mẫu giống hoa lan Phi điệp chia làm nhóm khác anosmum (KJ944630.1; KP743544.1) giới Riêng mẫu giống L116 (5 cánh trắng Ngọc Nam Kinh) nằm xa so với mẫu giống khác Nhóm thứ gồm mẫu giống L28 (Phi điệp xọc) lại tách riêng nhóm với mẫu giống Dendrobium aphyllum (KJ944622.1) giới nên khẳng định mẫu L28 Dendrobium aphyllum phi điệp Nhóm thứ mẫu giống L35 (HO4) xác định BlAST Dendrobium parishii nằm chung nhóm với 02 mẫu giống Dendrobium parishii HM 590378.1; KJ944629.1) Nhóm thứ bao gồm 115 mẫu giống chia thành nhóm phụ khác nằm chung nhóm với 02 mẫu giống thuộc Dendrobium Nhóm thứ Dendroium (KJ944624.1) nhóm đối chứng ngoại lituiflorum Nhóm thứ mẫu giống cánh trắng mũi trắng (L15) nằm riêng biệt nhóm Hình Sơ đồ phát sinh lồi dựa trình tự vùng ITS 116 mẫu giống cịn lại thuộc lồi Dendrobium KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ anosmum 4.1 Kết luận - Dựa kết so sánh trình tự đoạn ITS - Kết nghiên cứu giải trình tự vùng ITS mẫu giống lan Hoàng Thảo Phi Điệp cho thấy 118 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo xác định mẫu hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp Việt Nam 02 mẫu giống khác biệt, mẫu giống L28 thuộc lồi có độ tương đồng cao so với mẫu giới, Dendrobium aphyllum - Hạc vĩ mẫu giống L35 có sai khác số vị trí nucleoide từ đoạn 592thuộc lồi Dendrobium parishii - Hồng Thảo trầm 646 16 N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 5/2021 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - Kết đánh giá đa dạng di truyền cho thấy, hầu hết mẫu giống Việt Nam tập chung vào nhóm với có độ tương đồng di truyền cao Có hai mẫu giống L35 L15 nằm riêng biệt thành 02 nhóm khác mẫu giống L35 nằm chung nhóm với 02 mẫu giống Dendrobium parishii HM 590378.1; KJ944629.1 giới 4.2 Kiến nghị Để xây dựng tiêu ADN (barcode) nhận dạng xác giống lồi Dendrobium anosmum Việt Nam, cần tiếp tục sử dụng thêm thị khác SSR ISSR giải trình tự hệ gen mẫu giống nhóm LỜI CẢM ƠN Cảm ơn Resort Hoa lan Chính Trương cung cấp mẫu vật tài trợ kinh phí để thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Hoàng Dũng, Trần Lệ trúc Hà, Vũ Thị Huyền Trang, Đỗ Thành Trí, Trần Duy Dương (2012) Ứng dụng công nghệ ADN để phân loại nhận diện lan Hoàng Thảo trầm rừng (Dendrobium parishii) Phi điệp (Dendrobium anosmum) Việt Nam Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn số (18), tr.3 -9 Trần Hợp (2009) Phong lan Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Thị Pha, Nguyễn Thị Liên, Trần Thị Xuân Mai, Nguyễn Thị Hồng Nhung Trần Đình Giỏi (2012) Đa dạng sinh học số loài lan rừng thuộc chi Dendrobium kỹ thuật RAPD Tạp chí Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, (22a), trang 186-192 Chiang C H., Tsong A Y., Shu F L, Chao L K., and Wen H P (2012) Molecular Authentication of Dendrobium Species by Multiplex Polymerase Chain Reaction and Amplification Refractory Mutation System Analysis J Amer Soc Hort Sci 137(6), p 438–444 Leitch I J., Kahandawala I., Suda J., Hanson L., Ingrouille M J., Chase, M W., and Fay M.F (2009) Genome size diversity in orchids: consequences and evolution Annals of Botany, (104), pp 469-481 Liu Y T., Chen R K., Lin S J., L, Chen Y C., Chin S W., Chen F C., and Lee C Y (2014) Analysis of sequence diversity through internal transcribed spacers and simple sequence repeats to identify Dendrobium species Gentics and Molecular Research 13 (2): 2709-2717 Paromik B and Suman K (2014) Molecular characterization of Dendrobium nobile Lindl., an endangered medicinal orchid, based on randomly amplified polymorphic DNA Plant Syst Evol DOI 10.1007/s00606-014-1065-1 Parab G V and KrishmanS (2008) Assessment of gentic variation among populations of Rhynchostylis retusa, an epiphytic orchid from Goa, India using ISSR and RAPD Indian Journal of Biotechnology, (7), pp 313-319 Posada, D (2008) jModelTest: phylogenetic model averaging Molecular Biology and Evolution 25(7), 1253-1256 10 Prattana Phuekvilai, Pradit Pongtongkam and Surin Peyachoknagul (2009) Development of Microsatellite Markers for Vanda Orchid Kasetsart J (Nat Sci.), (43), pp 1-10 11 Sharma S K., Dkhar J., Kumaria S., Tandon P., and Rao S R (2012) Assessment of phylogentic inter-relationships in the genus Cymbidium (Orchidaceae) based on internal transcribed spacer region of rDNA Gen, 495(1), pp.10-15 12 Singh, H K., Parveen, I., Raghuvanshi, S & Babbar, S B (2012) The loci recommended as universal barcodes for plants on the basis of floristic studies may not work with congeneric species as exemplified by DNA barcoding of Dendrobium species BMC Res Notes 5, 42 13 Swati Das (Sur)., Surya S D., and Parthadeb G (2014) Analysis of gentic diversity in some black gram cultivars using ISSR European Journal of Experimental Biology 4(2), pp 30-34 14 Takamiya, T., Wongsawad, P., Tajima, N., Shioda, N., Lu, J F., Wen, C L., Wu, J B., Handa, T., Iijima, H., Kitanaka, S & Yukawa, T (2011) Identification of Dendrobium species used for herbal medicines based on ribosomal DNA internal transcribed spacer sequence Biol Pharm Bull 34(5), 779-82 15 Tran Duy Duong, Khuat Huu Trung, La Tuan Nghia, Nguyen Thi Thanh Thuy, Pham Bich Hien, Nguyen Truong Khoa, Tran Hoang Dung, Do Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 5/2021 17 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Van Trung and Tran Dang Khanh (2018) Identification of Vietnamese Native Dendrobium Species Based on Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer Sequence Advanced Studies in Biology, Vol 10, 2018, no 1, – 12 16 Tsai C C., Huang S C., Huang P L., Chen Y S., and Chou C H (2002) Phylogenetic relationship and identification of subtribe Onchidiinae genotypes by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers Sci Hort, (96), pp 303-312 17 Wang F., Wang L J., Zhou Y., and Sun H (2011) Gentic Diversity of the Selected 64 Potato Germplasms Revealed by AFLP Markers Mol Plant Breeding, (4), pp 22-29 18 Williams J G K, Kubelik A R, Livak K J, Rafalski J A., and Tingey S V (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as gentic markers Nucleic Acids Res, (18), pp.6531-6535 19 Vilgalys, R., J S Hopple, Jr., and D S Hibbett, 1994 Phylogenetic implications of generic concepts in fungal taxonomy: the impact of molecular systematic studies Mycol Helv 6:73-91 20 Xu, S., Li, D., Li, J., et al., 2015 Evaluation of the DNA barcodes in Dendrobium (Orchidaceae) from mainland Asia PloS one 10 (1) 1-12 21 Zhang, K Y B., Ngan F N., Wang Z T., But P P H., Shaw P C, and Wang J (1999) Random primed polymerase chain reaction differentiates Codonopsis pilosula from different localities Planta Med.(65), pp 157- 160 MOLECULAR DIVERSITY OF DENDROBIUM ANOSMUM SPECIES BY INTERNAL TRANSCRIBED SPACER (ITS) SEQUENCING Khuat Huu Trung1, Truong Quoc Chinh2, Tran Duy Duong1, Kieu Thi Dung1, Tran Dang Khanh1* Institute of Agricultural Genetics (AGI) Chinh Truong Orchid Resort * Email: tdkhanh@vaas.vn Summary The Dendrobium anosmum orchids available on the market are very diverse and complex and it is difficult to distinguish between one variety and another because their appearance is very similar before flowering In this study, 118 samples of Dendrobium anosmum from were collected from different regions were amplified and successfully resolved for ITS1, 5.8S and ITS2 (Internal Transcribed Spacer) regions with lengths from 700 to 800 bp Based on the attained results of the sequencing, ITS has identified two distinct varieties, L28 (Dendrobium aphyllum) and L35 (Dendrobium parishii) varieties and other varieties belong to the Dendrobium anosmum species Comparing the ITS segments, most Vietnamese native Dendroium anosmum have high similarity to compare with the world's samples Some different nucleotide positions ranged from the 592-646 segments, so it is difficult to distinguish the differences between the cultivars within the same species Therefore, in order to accurately identify each variety in the same species of Dendrobium anosmum in Vietnam, it is necessary to continue to use other advanced techniques such as SSR or ISSR marker or whole-genome sequencing of varieties in the group Keywords: Orchids, Dendrobium parishii, Dendrobium anosmum, Dendrobium aphyllum, ITS (Internal Transcribed Spacer), DNA barcoding Người phản biện: PGS.TS Lã Tuấn Nghĩa Ngày nhận bài: 22/01/2021 Ngày thông qua phản biện: 22/02/2021 Ngày duyệt đăng: 01/3/2021 18 Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 5/2021 ... sau gửi giải trình tự Kết đọc trình tự 118 mẫu giống lan Hồng Thảo Phi Điệp rõ hai trình tự xi trình tự ngược Sau có trình tự, kết mẫu giống trình tự đem so sánh với trình tự hoa lan Hoàng Thảo. .. điện di đoạn ITS 118 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp khuếch đại PCR với cặp mồi ITS1 ITS4 L1-L118: Các mẫu giống lan Phi điệp M: 100b ladder 3.2 Kết phân tích trình tự mẫu giống hoa lan. .. THáNG 5/2021 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ 3.3 Kết so sánh trình tự đoạn ITS số mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo địa Việt Nam giới Để so sánh khác biệt trình tự mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Phi Điệp (D anosmum)