Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan kim tuyến (anoectochilus blume)

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong mn ngàn lồi hoa đua hương khoe sắc mà thiên nhiên ban tặng cho người, hoa lan người Châu Á liệt vào hàng “vương giả chi hoa”- vua loài cỏ có hoa - vẻ đẹp đặc sắc mn màu muôn vẻ, hương thơm nhẹ nhàng vô quyến rũ Nó tượng trưng cho tình u vẻ đẹp, có ý nghĩa cao mà quý phái, tất thuộc phái yếu, duyên dáng lịch Bên cạnh, giá trị đem lại mặt tinh thần hoa lan cịn nguồn ngun liệu cho số ngành sản xuất Cụ thể như: nguồn hương liệu cho sản xuất nước hoa, chất làm tăng hương vị thực phẩm, nguyên liệu để điều chế keo, chất nhũ tương, chất thuộc da… Một số lồi lan cịn biết đến nguồn dược liệu có giá trị nhiều tiềm Đặc biệt, điều kiện mức sống người dân ngày tăng lên nhu cầu sử dụng nguồn dược liệu nói chung, lan dược liệu nói riêng vào cơng tác y- dược để tăng cường sức khoẻ người trọng Vì vậy, việc nhân giống tạo số lượng lớn nguồn dược liệu quý việc làm cần thiết để bảo vệ số lượng loài tự nhiên hứa hẹn mang lại hiệu kinh tế cao.Thực tế ghi nhận hiệu kinh tế to lớn mà việc trồng kinh doanh phong lan đem lại Số liệu năm 2000, kim ngạch xuất hoa lan giới đạt 150 triệu USD Ở Việt Nam mà cụ thể thành phố Hồ Chí Minh, theo thống kê Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan đạt 200-300 tỷ VNĐ đến 2005 số 600-700 tỷ VNĐ đến đầu năm 2006 đạt 400 tỷ VNĐ.[21] Trước kia, công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật nước ta chưa phát triển việc nhân giống lồi lan gặp nhiều khó khăn phương pháp nhân giống sinh dưỡng truyền thống có nhiều hạn chế thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều hệ, khả lây truyền bệnh cao, chất lượng khơng đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ Hơn nữa, hạt lan lại nhỏ, có phơi; nảy mầm cần có mặt nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm tự nhiên thấp Ngày phát triển khoa học- công nghệ, kỹ thuật nhân giống in vitro áp dụng phổ biến thành công nhiều đối tượng việc nhân nhanh lồi hoa lan trở nên thuận lợi Bằng phương pháp này, tạo với số lượng lớn đồng kiểu hình, chất lượng đảm bảo, bệnh, giá thành phù hợp không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết Nhờ đáp ứng nhu cầu khơng ngừng tăng lên thị trường Nói đến chi lan Kim tuyến Anoectochilus với 12 lồi, lồi lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume biết đến nhiều không giá trị làm cảnh hoa đẹp mà cịn giá trị làm thuốc Theo tài liệu y học giới, lan Kim tuyến lồi thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phịng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thơng, chữa bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn người ta phát khả phòng chống ung thư loại thảo dược Như vậy, lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume loại thảo dược có giá trị có tiềm lớn.Tuy nhiên, Việt Nam số lượng loài tự nhiên phát cịn mà lại bị thu hái với số lượng lớn để bán làm thuốc (500.000VNĐ/ kg tươi) loài lan bị đe doạ mạnh đứng trước nguy tuyệt chủng khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Kim tuyến xếp nhóm IA Nghị định 32/2006/CP; nhóm thực vật nguy cấp EN A1a, c, d Sách Đỏ Việt Nam 2007 Mặc dù nay, nước ta chưa có cơng trình nghiên cứu kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài quý cơng bố Do vậy, nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận ý nghĩa mặt thực tiễn Xuất phát từ vấn đề trên, cho phép Bộ môn Giống& Công nghệ sinh học- khoa Lâm Học- trường Đại học Lâm Nghiệp thời gian thực tập tốt nghiệp, tiến hành đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro lồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) ” nhằm góp phần nhân giống bảo tồn loài lan quý Việt Nam Từng bước đưa chúng thoát khỏi tình trạng bị đe doạ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO 1.1.1 Khái niệm: Nhân giống in vitro thuật ngữ mô tả phương thức nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường xác định điều kiện vô trùng Môi trường có chất dinh dưỡng thích hợp muối khống, vitamin, hoocmon sinh trưởng đường 1.1.2 Sơ lược lịch sử phát triển: Nhân giống in vitro khởi xướng vào cuối kỷ 19, trải qua 100 năm phát triển Quá trình phát triển dó khái quát qua giai đoạn sau: *Giai đoạn 1: Giai đoạn khởi sướng ( 1898-1930) Gottlieb Haberlandt (1902), nhà thực vật học người Đức, đặt móng cho ni cấy mơ tế bào thực vật Ơng đưa giả thuyết tính toàn tế bào sách “Thực nghiệm nuôi cấy tế bào tách rời” Đây tảng lí thuyết ni cấy mơ- tế bào sau Tuy nhiên, thí nghiệm Haberlandt với tế bào mơ mềm, biểu bì bị thất bại chúng khơng thể phân chia Nhưng sau Garrison (1904-1907) nuôi thành công tế bào thần kinh ếch huyết tương.Trên sở đó, nhà khoa học thực vật tiến nuôi tế bào môi trường dinh dưỡng tự nhiên chiết từ thực vật không thành cơng Sau thời gian dài nhà nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu môi trường nuôi cấy tự nhiên tổng hợp Năm 1922, Kotte học trò Haberlandt với Robbins lặp lại thí nghiệm Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ ngô Hai tác giả nuôi thời gian ngắn (12 ngày) môi trường lỏng có chứa đường glucose muối khống thu hệ rễ nhỏ Từ đầu rễ ni hồn thiện mơi trường ni cấy *Giai đoạn 2: Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950) Giai đoạn đánh dấu thành công White (1934) trì sinh trưởng của đầu rễ cà chua thời gian dài môi trường lỏng có chứa đường, số muối khống dịch chiết nấm men Theo hướng khác, Gautherets thành công nuôi cấy mô tượng tầng gỗ tìm mơi trường thích hợp Cũng giai đoạn này, vai trị thúc đẩy sinh trưởng ni cấy hàng loạt vitamin nhóm B phát như: thiamin (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), nicotinic (vitamin B3)…Ni cấy mơ- thực vật có nhiều thuận lợi Went Thimann tìm chất kích thích sinh trưởng đầu tiên, sau xác định axit indole axetic (IAA) Kogl tách chiết thành công Trong thời gian 1941-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin ni cấy tổng hợp thành công: axit napthalen axetic (NAA), axit 2.4 D- dichlorophenoxy axetic (2.4 D)… Năm 1954, Skoog phát chế phẩm thuỷ phân tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trưởng rõ rệt nuôi cấy mảnh mô thân thuốc Một năm sau, chất tổng hợp thành cơng Skoog gọi Kinetin có tác dụng kích thích phân bào Việc phát NAA, 2.4 D, Kinetin với loại vitamin nước dừa bước tiến có ý nghĩa giai đoạn thứ nuôi cấy mô- tế bào thực vật *Giai đoạn 3: Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1957-1960) Skoog Miller (1957) chứng minh biệt hoá rễ, chồi nghiên cứu nuôi cấy mô tuỷ thuốc phụ thuộc vào nồng độ tương đối auxin/cytokinin từ đưa quan niệm điều khiển hoocmon trình hình thành quan thực vật Thành công Skoog Miller dẫn đến nhiều phát quan trọng mở đầu cho giai đoạn thứ nuôi cấy mô- tế bào thực vật Trong khoảng thời gian từ 1954 -1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn phát triển hồn thiện dần Melcher Beckman ni cấy tế bào đơn bình dung tích lớn có sục khí bổ sung chất dinh dưỡng định kỳ Khả nuôi cấy tế bào thực vật tái tạo hoàn chỉnh từ tế bào mở triển vọng cho chọn dòng đột biến, sản xuất chất trao đổi thứ cấp *Giai đoạn 4: Giai đoạn nghiên cứu di truyền (từ 1960 đến nay) Là giai đoạn ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật vào công tác giống nghiên cứu di truyền Các thành tựu bật giai đoạn gồm: Năm 1960, nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Morel tạo protocorm từ địa lan Khi để điều kiện định, protocorm phát triển thành lan bệnh Cũng năm đó, Coocking trường Đại học Tổng hợp Nottingham thu tế bào trần (protoplast) nhờ xử lý với enzyme cellulase Năm 1966, Guha & cộng tạo đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cà độc dược Sau Bourin & Nitsch (1967) thành công với thuốc Việc tạo đơn bội thành cơng nhiều lồi thực vật thơng qua ni cấy bao phấn hạt phấn đóng góp lớn cho nghiên cứu di truyền lai tạo giống Từ năm 1970 trở đi, nhà khoa học ý vào triển vọng kỹ thuật nuôi cấy protoplast, tác giả người Nhật Nagata Takebe thành công việc làm cho protoplast thuốc tái tạo cellulose Melchers cộng (1978) lai tạo thành công protoplast cà chua với protoplast khoai tây, mở triển vọng lai xa thực vật Ngoài ra, điều kiện định, protoplast có khả hấp thụ phân tử lớn, quan tử từ bên ngồi, chúng đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu di truyền thực vật Ngày nay, nuôi cấy mô - tế bào thực vật ứng dụng rộng rãi nhân giống nhiều lồi thực vật, chọn dịng chống chịu, lai xa, chuyển gen vào trồng 1.1.3 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô- tế bào thực vật: Kỹ thuật kỹ thuật nhân giống in vitro phát triển sở lý thuyết tế bào học sở sinh lý thực vật 1.1.3.1 Tính tồn (Totipotence) tế bào: Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đặt móng cho ni cấy mơ tế bào thực vật Ơng đưa giả thuyết tính toàn tế bào sách "Thực nghiệm nuôi cấy tách rời" Theo ông: “Tế bào thể sinh vật mang tồn lượng thơng tin di truyền (DNA) cần thiết đủ sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh” Tính tồn tế bào mà Haberlandt nêu sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, nhà khoa học chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ 1.1.3.2 Sự phân hoá phản phân hoá: Sự phân hoá tế bào chuyển hoá tế bào thành mơ chun hố, đảm nhận chức khác thể Tuy nhiên, tế bào phân hố thành mơ chức chúng hồn tồn khả phân chia Trong điều kiện mơi trường thích hợp, chúng lại trở dạng tế bào phôi sinh phân chia mạnh mẽ tế bào hợp tử ban đầu cho tế bào có khả tái sinh thành hồn chỉnh Q trình gọi phản phân hoá tế bào Hai trình biểu thị sơ đồ sau: Phân hố tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Về chất phân hố phản phân hố q trình điều hồ hoạt hố gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể có số gen hoạt hố (mà vốn trước bị hạn chế) để tạo tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chương trình mã hố cấu trúc phân tử DNA tế bào Mặt khác cho tế bào nằm khối mô thể thường bị ức chế tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào giảm kích thước khối mô tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt hố gen tế bào, q trình hoạt hoá xảy theo cấu trúc định sẵn có gen 1.1.3.3 Sự trẻ hoá : Khả chồi, rễ thành phần khác khác Vì để chọn mẫu cấy phù hợp phải vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu Trong nuôi cấy in vitro, mẫu non trẻ có phản ứng với điều kiện môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt nuôi cấy mô sẹo, phơi Ngồi mơ non trẻ hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh 1.1.4 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.1.4.1 Điều kiện vô trùng: Đây điều kiện tiên thành cơng q trình ni cấy mơ-tế bào Nếu không mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn thối chết  Vô trùng dụng cụ môi trường: Trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật, thao tác mẫu cấy tiến hành tủ cấy vô trùng Để vô trùng dụng cụ môi trường ni cấy, sử dụng phương pháp sau: - Khử trùng khô: phương pháp dùng cho dụng cụ kim loại, thuỷ tinh, dụng cụ có tính chịu nhiệt Thiết bị dùng khử trùng khơ lị sấy - Khử trùng ướt: phương pháp áp dụng hiệu phổ biến vô trùng môi trường dụng cụ nuôi cấy Thiết bị sử dụng nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thường dùng 1210C - Màng lọc: dùng để loại bỏ tác nhân gây nhiễm có kích thước 0.025-10µm khỏi mơi trường ni cấy Đây phương pháp phù hợp với môi trường mà thành phần bị phân huỷ nhiệt độ cao  Vô trùng mẫu cấy: Với loại mẫu cấy khác loại mẫu cấy vị trí khác phương pháp khử trùng mẫu cấy khác Phương pháp phổ biến vô trùng mẫu cấy sử dụng hoá chất có khả tiêu diệt vi sinh vật Hiệu khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hoá chất khử trùng Một hoá chất lựa chọn để vô trùng phải đảm bảo thuộc tính: có khả diệt vi sinh vật tốt khơng độc mẫu thực vật Các hố chất hay sử dụng là: hypoclorit canxi (nồng độ 5-15% w/v), hypoclorit natri (nồng độ 10- 20% v/v), oxy già (nồng độ 10-12% v/v), thuỷ ngân clorua (nồng độ 0,1-1% w/v), chất kháng sinh (50-100 mg/l) Để tăng tính linh động hố chất diệt khuẩn,người ta thường sử dụng thêm chất làm tăng sức căng bề mặt Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol phối hợp xử lý với cồn 700 Một số trường hợp khó vơ trùng mẫu cấy xử lý vơ trùng bề mặt khơng đạt hiệu hồn tồn Trong trường hợp nhà nghiên cứu thêm chất diệt khuẩn, nấm vào môi trường nuôi cấy 1.1.4.2 Ánh sáng nhiệt độ Các mẫu nuôi cấy thường đặt phịng ni ổn định ánh sáng nhiệt độ Tất trường hợp nuôi cấy cần có ánh sáng trừ số trường hợp ni cấy tạo mơ sẹo, q trình nhân giống chúng cần có ánh sáng Nhiệt độ phịng ni thường trì từ 25-28 0C nhờ máy điều hồ nhiệt độ 1.1.5 Mơi trường ni cấy in vitro 1.1.5.1 Thành phần hóa học mơi trường Thành phần môi trường nuôi cấy mô- tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô quan nuôi cấy Đối với loại mơ, quan mục đích ni cấy khác mơi trường ni cấy khác Mơi trường ni cấy cịn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng phát triển mẫu cấy Mặc dù có đa dạng thành phần chất môi trường nuôi cấy gồm thành phần sau:  Thành phần vô cơ: Bao gồm muối khoáng (đa lượng vi lượng) bổ sung vào mơi trường ni cấy - Trong muối khống đa lượng nguyên tố cần phải cung cấp nitơ, photpho, kali + Nitơ vô đưa vào môi trường hai dạng nitrat (NO3-) amon (NH4+) Đa số mơi trường có chứa dạng nitrat nhiều dạng amon Trong môi trường MS, amon cung cấp dạng NH4NO3, cịn mơi trường B5 có amon dạng muối (NH4)2SO4 + Photpho thường đưa vào môi trường dạng muối photphat, hai loại hợp chất hay dùng NaH2PO4 KH2PO4 Hàm lượng photpho môi môi trường nuôi cấy từ 0,15-0,40 mM + Kali cung cấp cho môi trường nuôi cấy dạng KNO3, KCl KH2PO4 Nồng độ sử dụng từ 2- 25 mM - Yêu cầu muối khoáng vi lượng mô thực vật nuôi cấy phức tạp nghiên cứu Chúng cần thiết để thúc đẩy sinh trưởng phát triển mẫu nuôi cấy Đây nguyên tố sử dụng nồng độ < 30 ppm Các nguyên tố vi lượng Fe, Cu, Zn, Bo, Co, Iot Các ngun tố đóng vai trị quan trọng hoạt động enzyme + Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein lại làm tăng ADN axit amin tự làm cho tế bào không phân chia + Bo: thiếu Bo môi trường nuôi cấy thường gây lên biểu thừa Auxin Mơ ni cấy có biểu tạo mơ sẹo hố mạnh thường mô xốp, mọng nước, tái sinh  Thành phần hữu cơ: - Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol: + Vitamin: vitamin hay sử dụng vitamin nhóm B (B1, B3, B6), ngồi mơi trường ni cấy cịn sử dụng số vitamin khác vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E với nồng độ khác nhau: Vitamin B1: 0,1- 5,0 mg/l Vitamin B6: 0,1- 1,0 mg/l Vitamin H: 0,01- 1,0 mg/l + Myo-inositol có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng phát triển giống vitamin nhiều trường hợp có vai trị nguồn cacbon môi trường nuôi cấy Hàm lượng sử dụng 100 mg/l môi trường + Các aminoaxit amit: Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường phải bổ sung aminoaxit, amit chúng có vai trị quan trọng phát sinh hình thái Theo Skoog & Milles (1957) tất dạng tự nhiên amino axit dạng L dễ đàng mô nuôi cấy hấp thụ, L-arginin dùng cho nuôi cấy rễ, L- tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi, Lserin dùng cho nuôi cấy hạt phấn Nồng độ sử dụng loại 10- 100 mg/l - Thành phần hữu phức hợp: dùng môi trường nuôi cấy để cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin khoáng chất Chúng sử dụng mơi trường khống xác định không đạt kết mong muốn sinh trưởng phát triển mẫu nghiên cứu + Cazein thuỷ phân: có chứa nhiều aminoaxit Theo Klein (1970) casein thuỷ phân có chứa khoảng 18- 20 aminoaxit Hàm lượng sử dụng nuôi cấy 0,050,10 % w/v + Dịch chiết nấm men: chứa hàm lượng cao nhiều vitamin nhóm B, nồng độ sử dụng 0,025 - 0,20 % w/v + Dịch chiết hoa quả, củ: nước ép cà chua, nước ép cam, nước ép chuối xanh nước dừa  Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hồ sinh trưởng thành phần khơng thể thiếu mơi trường ni cấy, có vai trị quan trọng phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu tác động chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại nồng độ chất điều hồ sinh trưởng sử dụng ni cấy - Nhóm Auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sinh trưởng giãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính (Epstein&cs, 1989) Các loại auxin thường sử dụng cho nuôi cấy: + IAA (Indole acetic acid) + IBA (Indole butyric acid) + NOA (Naphthoxy acetic acid) + α- NAA (α- Naphthaleneacetic acid) + 2.4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid) IAA sử dụng bền với nhiệt ánh sáng, dùng hàm lượng cao 1,0-30 mg/l (Dodds & Robert, 1999) Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,12,0 mg/l - Nhóm Cytokinin: kích thích phân chia tế bào, hình thành sinh trưởng chồi in vitro (Miller, 1962) Các cytokinin có biểu ức chế tạo rễ sinh trưởng mô sẹo có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phơi vơ tính mẫu ni cấy Các loại cytokinin thường dùng nuôi cấy mô là: + Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine) 10 Vì đánh giá hệ số nhân chồi ta có hai hướng đánh giá Với phạm vi đề tài hệ số nhân chồi đánh giá sau lần cấy chuyển 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn gốc chồi đến khả nhân nhanh chồi:  Theo hướng tạo đa chồi: Đây hướng chủ đạo để nhân nhanh nghiên cứu hướng cho hệ số nhân cao thời gian ngắn khác với theo hướng cắt đốt cần nhiều thời gian Các chồi phát sinh có nguồn gốc khác cấy vào cơng thức môi trường nhân nhanh chồi: Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + g/l agar Phương pháp thí nghiệm tiến hành theo thí nghiệm Kết thí nghiệm bảng 3.13 Bảng 3.13: Ảnh hưởng nguồn gốc nguồn gốc chồi đến nhân nhanh theo hướng tạo đa chồi: Loại vật liệu Hệ số nhân Đặc điểm chồi phát sinh Chồi đỉnh 1,17 Xanh, chồi dài, trung bình 2,5cm Chồi nách 3,5 Xanh/ xanh, chồi ngắn, trung bình 1,2cm Kết xử lý thống kê cho thấy Ftính (=19,6)> F0,05(=7,7) Do có khác biệt hệ số nhân hai loại chồi có nguồn gốc khác Theo đó, hệ số nhân chồi chồi có nguồn gốc chồi nách (3,5 lần) cao so với hệ số nhân chồi chồi có nguồn gốc từ chồi đỉnh (1,17 lần) Điều giải thích chất hai loại chồi Ở chồi nách không bị chi phối tượng ưu chồi đỉnh dễ phát sinh nhiều chồi bên, chồi đỉnh chủ yếu phát triển theo hướng kéo dài tạo nhiều đốt  Theo hướng kéo dài tăng số đốt: Đặc thù lồi lan Kim tuyến có thân gồm nhiều đốt đốt mang chồi ngủ mắt đốt có khả tái sinh để hình thành chồi Do nghiên cứu việc nhân chồi theo hướng tạo đa chồi, chúng tơi cịn nhân theo hướng kéo dài làm tăng số đốt từ cắt đốt để tạo hệ số nhân 55 Môi trường sử dụng cho nghiên cứu M1 (MS+0,5mg/l BAP +0,5 g/l AC + 100ml/l ND +100g/l khoai tây + 20g/l sucrose + 7g/l agar) Bảng 3.14 Ảnh hưởng loại vật liệu đến khả kéo dài đốt Loại vật liệu Hệ số nhân TB Đặc điểm chồi phát sinh Chồi đỉnh 2,8 chồi dài, trung bình 2,4 cm Chồi nách 1,2 chồi ngắn, trung bình 0,96cm Kết xử lý thống kê hàm Anova hai nhân tố thu Ftính(=50)> F0,05(=7,7) Do có khác biệt hệ số nhân hai loại chồi có nguồn gốc khác Theo bảng 3.14, hệ số nhân đốt chồi đỉnh trung bình 2,8 lần hệ số nhân đốt chồi nách nửa (1,2 lần) Có khác biệt chiều cao hai loại chồi này, chồi đỉnh có chiều cao trung bình 2,4 cm chồi nách chiều cao trung bình có 0,96 cm Như vậy, chồi có nguồn gốc từ chồi đỉnh nguồn vật liệu thích hợp cho hướng nhân cắt đốt với hệ số nhân 2,8 lần Nghiên cứu tương tự với lan Hài hồng tiến hành theo hai hướng hướng cắt đốt thử nghiệm (Dương Tấn Nhựt, 2004) với hệ số nhân lần 56 A B Hình Chồi đỉnh (A) chồi nách (B) lan Kim tuyến 3.3.2 Ảnh hưởng độ tuổi thể chồi đến khả nhân nhanh thể chồi lan Kim tuyến in vitro Khả nhân nhanh thể chồi nhân giống lan đánh giá yếu tố dịnh hệ số nhân quy trình Đây bước tạo nguồn vật liệu dồi cho q trình tạo chồi, hồn chỉnh sau Trong nghiên cứu nhân nhanh thể chồi A setaceus, chúng tơi có tiến hành đánh giá ảnh hưởng yếu tố độ tuổi đến khả nhân nhanh Thể chồi tuần tuổi, tuần tuổi 10 tuần tuổi (được tính từ hạt bắt đầu gieo vào môi trường) cấy vào công thức môi trường nhân nhanh thể chồi: Knud* + 0,3 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + g/l agar Sau bốn tuần cấy chuyển đến môi trường nhân tiến hành đánh giá hệ số nhân cho bình có nguồn gốc từ thể chồi độ tuổi khác Bảng 3.15: Ảnh hưởng độ tuổi thể chồi đến khả nhân nhanh thể chồi Độ tuổi thể chồi tuần tuần Đặc điểm thể chồi nhiều, nhỏ, trắng xanh thể chồi nhiều, mập, xanh, xuất số lông tơ mọc từ gốc thể chồi 57 Hệ số nhân thể chồi 4,00 5,33 10 tuần thể chồi nhiều, mập, có lông tơ xuất Xanh đậm thể chồi tuần tuổi 3,33 Hình Đồ thị ảnh hưởng tuổi phôi hạt đến khả nhân nhanh thể chồi Kết cho thấy thể chồi có độ tuổi tuần nguyên liệu thích hợp để nhân nhanh thể chồi với hệ số nhân cao 5,3 lần, tiếp đến thể chồi độ tuổi tuần với hệ số nhân lần Cuối với độ tuổi 10 tuần hệ số nhân có 3,3 lần Cùng với hệ số nhân chất lượng thể chồi nhân từ thể chồi độ tuổi tuần tốt tuần tuổi Thể chồi nhiều, mập, xanh, xuất số lông tơ mọc từ gốc thể chồi thể chồi có nguồn gốc tuần thể chồi cịn nhỏ, màu trắng xanh Thể chồi có độ tuổi tuần có hệ số nhân cao độ tuổi 10 chất lượng thể chồi lại không Như rút rằng, với A setaceus độ tuổi thích hợp cho nhân nhanh tuần tuổi hệ số nhân nhanh cao đồng thời thể chồi tạo có chất lượng tốt thuận lợi cho việc việc phát sinh hình thái mẫu sau.Ở độ tuổi (6 tuần tuổi) phôi bắt đầu phát triển sử dụng để nhân nhanh hệ số nhân chưa cao Còn độ tuổi nhiều (10 tuần tuổi) thể chồi thiên hướng tạo chồi khơng thích hợp cho việc nhân nhanh Dù chất lượng thể chồi tương đương thể chồi có nguồn gốc tuần 10 tuần Vậy thể chồi tuần tuổi thích hợp để nhân nhanh thể chồi, cho hiệu kinh tế cao rút ngắn thời gian thực quy trình nhân giống 58 tuần 8tuần 10 tuần Hình Thể chồi lan Kim tuyến với độ tuổi khác 3.4 Ảnh hƣởng loại nồng độ chất điều hoà sinh trƣởng chế độ nuôi cấy đến khả nhân nhanh thể chồi: 3.4.1 Ảnh hưởng loại nồng độ chất điều hoà sinh trưởng đến khả nhân nhanh thể chồi Nhân nhanh thể chồi bước định hiệu trình nhân giống bước tạo số lượng lớn nguồn vật liệu in vitro Thể chồi tuần tuổi lựa chọn làm vật liệu cho thí nghiệm Thể chồi vào môi trường: Knud* + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + g/l agar bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng với hàm lượng khác (bảng 2.9) Kết thu bảng 3.16 Bảng 3.16: Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh thể chồi CTTN Hệ số nhân thể chồi (lần) Chất lượng thể chồi CTTN1 2,11 + 59 CTTN2 1,78 ++ CTTN3 5,33 +++ CTTN4 4,11 ++ CTTN5 1,67 + CTTN6 2,00 ++ CTTN7 4,00 +++ CTTN8 3,22 ++ Ghi chú: (+) Chất lượng thể chồi trung bình (++) Chất lượng thể chồi (+++) Chất lượng thể chồi tốt Ở bốn công thức đầu (CTTN5, CTTN6, CTTN7, CTTN8) có: nồng độ o,3 mg/l Kinetin khác nồng độ NAA BAP Trên sở phân tích số liệu thống kê cho bốn công thức đầu hàm Anova hai nhân tố lặp lần, ta thấy: Ftính(=9)> F0,05(=5) Do có khác biệt hệ số nhân thể chồi công thức nghiên cứu Từ bảng 3.16 cho thấy: CTTN3 (bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin+ 0,1mg/l NAA) cho hệ số nhân thể chồi cao với 5,33 lần, thấp công thức CTTN2 với hệ số nhân thể chồi đạt 1,78 lần CTTN4 (0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA) có hệ số nhân 4,11 lần Cơng thức CTTN1 có hàm lượng BAP 0,3 mg/l hệ số nhân thể chồi đạt 2,11 lần Như vậy, qua kết thấy hàm lượng BAP thích hợp bổ sung vào môi trường nhân thể chồi 0,5 mg/l, NAA 0,1 mg/l Ở công thức cho hệ số nhân chồi cao mà thể chồi tạo cịn có chất lượng tốt, xanh, mập, khơng có phát sinh thể chồi bất thường Trong cơng thức cịn lại (CTT1, CTTN2) thể chồi tạo nhỏ, sinh trưởng chậm, màu xanh nhạt Ở bốn cơng thức sau (CTTN5, CTTN6, CTTN7, CTTN8) có: 0,5 mg/l Kinetin, khác nồng độ BAP NAA 60 Kết xử lý số liệu thống kê thấy cơng thức thí nghiệm có khác biệt rõ rệt đến hệ số nhân thể chồi Sự khác biệt hệ số nhân thể chồi cơng thức có khác biệt hàm lượng BAP NAA tổ hợp với 0,5 mg/l Kinetin Trong tổ hợp (0,5 mg/l BAP+ 0,1 mg/l NAA) với 0,5 mg/l Kinetin CTTN7 cho hệ số nhân chồi cao (4 lần), tiếp sau CTTN8 với hệ số 3,22 lần Các cơng thức có hàm lượng BAP thấp cho hệ số nhân chồi nhỏ hơn: 1,67 (CTTN5) (CTTN6) Qua phân tích số liệu thống kê hai cặp công thức rút hàm lượng thích hợp BAP NAA cho ni cấy nhân nhanh thể chồi 0,5 mg/l BAP 0,1 mg/l NAA Ở công thức chất lượng thể chồi tạo tốt, mập, phát triển khoẻ Trên sở phân tích số liệu thống kê thu công thức từ CTTN3 CTTN7) thấy hàm lượng Kinetin phù hợp cho nhân thể chồi 0,3 mg/l Chúng rút tổ hợp chất điều hồ sinh trưởng thích hợp cho nhân nhanh thể chồi lan Kim tuyến 0,5 mg/l BAP+ 0,3mg/l Kinetin+0,1 mg/l NAA Vậy, công thức mơi trường thích hợp để nhân nhanh thể chồi lan Kim tuyến là: Knud*+ 0,5 mg/l BAP+ 0,3mg/l Kinetin+ 0,1 mg/l NAA +100ml/l ND + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + g/l agar 3.4.2 Ảnh hưởng chế độ nuôi cấy đến khả nhân nhanh thể chồi: Trong thí nghiệm chúng tơi tiến hành cấy chuyển thể chồi độ tuổi (8 tuần tuổi) môi trường nhân thể chồi: Knud*+ 0,5 mg/l BAP+ 0,3mg/l Kinetin+ 0,1 mg/l NAA +100ml/l ND + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose có bổ sung 7g/l agar (môi trường đặc) không bổ sung agar (môi trường lỏng) Đối với môi trường lỏng, sau cấy thể chồi vào phải nuôi điều kiện máy lắc 50 vịng/phút để giúp cho q trình thơng khí mơi trường diễn tốt, mẫu khơng bị chết thiếu khí Bảng 3.17: Ảnh hưởng chế độ nuôi cấy đến khả nhân nhanh thể chồi Chế độ nuôi cấy Đặc Hệ số nhân thể chồi sau tuần Chất lượng thể chồi Màu sắc thể chồi ++ Xanh 5,33 61 Lỏng, lắc 6,33 +++ Trắng - xanh nhạt Ghi chú: (++) Chất lượng thể chồi (+++) Chất lượng thể chồi tốt Trong hai chế độ ni cấy thể chồi ni cấy môi trường lỏng cho hệ số nhân thể chồi cao hẳn so với thể chồi môi trường đặc Hệ số nhân thể chồi môi trường lỏng kết hợp nuôi cấy lắc 6,33 lần Trong môi trường đặc hệ số 5,33lần Kết quan sát mẫu môi trường nuôi cấy sau hai tuần thấy mẫu cấy sinh trưởng môi trưởng lỏng có xu hướng vừa nhân vừa kéo dài, thể chồi mập, sức sống hẳn thể chồi nuôi cấy môi trường đặc Nguyên nhân khác biệt giải thích ni cấy mơi trường lỏng có máy lắc khả tiếp xúc mẫu với môi trường nuôi cấy nhiều khả hấp thụ chất dinh dưỡng nhiều hơn, đồng thời chất ức chế sản xuất trình sinh trưởng mẫu cấy khuếch tán vào môi trường Do vậy, công thức môi trường nuôi cấy hệ số nhân nhanh thể chồi chất lượng chồi môi trường lỏng lại tốt môi trường đặc Theo số nghiên cứu thấy rằng: sinh trưởng mô thực vật môi trường lỏng tốt môi trường đặc (Etienne and Berthouly, 2002) [] A 62 B Hình Thể chồi ni mơi trường lỏng (A) môi trường đặc (B) sau tuần nuôi cấy 3.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng đƣờng đến khả phát sinh chồi từ thể chồi Thể chồi độ tuổi (8 tuần tuổi) môi trường nhân thể chồi: Knud*+ 0,5 mg/l BAP+ 0,3mg/l Kinetin+ 0,1 mg/l NAA +100ml/l ND + 100 g/l khoai tây + 7g/l agar bổ sung đường sucrose với hàm lượng khác (bảng 2.10) Kết thu bảng 3.18 Bảng 3.18 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả phát sinh chồi từ thể chồi Tỷ lệ phát sinh Tỷ lệ phát sinh chồi sau tuần chồi sau tuần (%) (%) 10 g/l 10 19,17 + 20 g/l 26,67 51,67 ++ 30 g/l 40 95,83 +++ 40 g/l 39,17 95,83 +++ Hàm lượng đường Chất lương chồi sau tuần Kết xử lý thống kê hàm Anova nhân tố cho tỷ lệ phát sinh chồi sau tuần nuôi cấy thấy: Ftính(=56)> F0,05(=4) Như vậy, hàm lượng có ảnh hưởng rõ rệt đến khả phát sinh chồi Theo bảng 3.18: tỷ lệ chồi phát sinh có xu hướng tăng hàm lượng đường môi trường tăng lên, điều cho thấy đường yếu tố cần thiết cho phát triển biệt hoá thể chồi để tạo thành chồi Khi hàm lượng đường thấp (10 g/l) tỷ lệ chồi hình thành thấp (10% sau tuần 19,17% sau tuần) Điều chứng tỏ hàm lượng đường thấp tạo giới hạn cho phát chồi từ thể chồi Với bốn hàm lượng đường sử dụng thí nghiệm (10, 20, 30 40 g/l) cho thấy có ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả phát sinh chồi từ thể chồi Trong mơi trường có hàm lượng đường thấp 10g/l tỷ lệ phát sinh chồi sau tuần 10 % phải đến sau hai tuần thí tỷ lệ phát sinh chồi lên đến 19,17 % Khi tăng hàm lượng đường lên CTTN2 với 20g/l đường sau tuần nuôi cấy tỷ lệ phát sinh chồi 26,67 %, tỷ lệ cao tỷ lệ 63 chồi phát sinh sau tuần môi trường có 10 g/l đường Và với hàm lượng đường sau tuần ni cấy số chồi phát sinh 51,67% Hàm lượng đường bổ sung mức nhiều công thức CTTN3, CTTN4 với 30g/l 40 g/l đường tỷ lệ phát sinh chồi sau tuần 40% 39,17 % Và tỷ lệ sau bốn tuần đạt 95,83%, tức gần 100% thể chồi phát sinh thành chồi Đồng thời, ta thấy hàm lượng đường thấp kéo theo chất lượng chồi tạo thấp, chồi nhỏ, ngắn, lá, phát triển chậm Chất lượng chồi tăng lên rõ rệt hàm lượng đường bổ sung môi trường tăng lên (CTTN3, CTTN4) Chồi tạo khoẻ, dài mâp, xanh, thường có hai xoè cụp Như vậy, hàm lượng đường có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ phát sinh chồi, tỷ lệ rõ rệt sau tuần nuôi cấy Chất lượng chồi tăng lên ta sử dụng hàm lượng đường mức 30 g/l 40 g/l thay 10 hay 20 g/l Vậy, cơng thức mơi trường bổ sung 30 g/l đường thích hợp để ni cấy chồi phát sinh từ thể chồi (cho tỷ lệ phát sinh chồi cao 95,53 % sau tuần nuôi cấy) Nghiên cứu tương tự Tiến sĩ Nguyễn Văn Kết hàm lượng đường cho nhân nhanh, kéo dài nuôi cấy in vitro lan A fomosanus cho thấy hàm lượng đường thích hợp cho 20 g/l Hình : Ảnh hưởng hàm lượng đường đến tỷ lệ phát sinh chồi từ thể chồi 64 Hình Chồi lan Kim tuyến phát sinh môi trường bổ sung 30 g/l (A) 20 g/l (B) đường sucrose sau tuần nuôi cấy 3.6 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Năm 1956, Skoog Miller có nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ Cytokinin/Auxin môi trường dinh dưỡng tới phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy Năm 1933, Rhojwani Razda khẳng định rằng, việc tạo chồi auxin có tác dụng tích cực phối hợp với Cytokinin nồng độ thích hợp [] Trên sở lý thuyết chúng tơi thử nghiệm cơng thức phối hợp hai loại chất nhằm tìm cơng thức nuôi cấy tốt để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến Chồi có đốt cấy vào mơi trường: MS + 100g/l khoai tây +100ml/l ND + 0,5 g/l than hoạt tính + 20 g/l sucrose + g/l agar bổ sung chất ĐHST với hàm lượng khác Kết thu sau tuần nuôi cấy, trình bày bảng 3.19 Bảng 3.19: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi CTTN Hệ số nhân chồi (lần) Số đốt thân ĐC NK1 1,2 2,67 NK2 1,93 3,67 NK3 1,27 2,33 65 NK4 2,33 NK5 1,2 2,67 NK6 1,07 2,33 NK7 1,93 NK8 1,33 2,33 NK9 2,47 2,33 NK10 4,13 2,33 NK11 3,53 Trong từ công thức đến công thức bố trí thí nghiệm kiểm chứng tác dụng riêng lẻ BAP so với TDZ hàm lượng khác (0,3 – 1,0 mg/l) đến khả nhân chồi Trong TDZ thử nghiệm thành cơng nghiên cứu tương tự tiến sĩ Nguyễn Văn Kết [11] Kết nghiên cứu bảng cho thấy: việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy BAP hàm lượng khác từ 0,3; 0,5 1,0 mg/l cho hiệu nhân chồi khác rõ rệt cao cơng thức đối chứng Trong hàm lượng 0,5 mg/l cho hệ số nhân cao 1,93 lần Kết việc sử dụng TDZ dạng riêng lẻ cho thấy nồng độ 0,5 mg/l hệ số nhân chồi thu cao Nhưng so sánh với kết thi nghiệm thu sử dụng BAP 0,5 mg/l tiêu chuẩn thống kê thấy rõ việc sử dụng BAP hiệu hẳn để nhân nhanh chồi theo hướng kéo dài chồi tạo nhiều đốt thân Trên sở chúng tơi sử dụng BAP hàm lượng 0,5 mg/l cho nghiên cứu Ở thí nghiệm tiếp sau, chúng tơi nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA tổ hợp với 0,5 mg/l BAP rút hàm lượng sử dụng thích hợp cho nhân chồi NAA 0,3 mg/l với hệ số nhân 1,93 lần nồng độ 0,5 mg/l hệ số nhân chồi lại giảm xuống 1,33 Sau cùng, sở tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng (0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l NAA) đồng thời bổ sung Kinetin nồng độ khác để tìm mơi trường hiệu cho nhân nhanh theo hướng phát sinh đa chồi 66 Sau phân tích kết thấy: chúng tơi thay đổi nồng độ NAA hiệu nhân chồi có thay đổi Tác động tổ hợp BAP, NAA, Kinetin hàm lượng cho hiệu cao hẳn công thức trước hệ số nhân chồi theo hướng đa chồi Trong tổ hợp mơi trường NK10 (bổ sung: 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l NAA+ 0,5 mg/l Kinetin) cho hệ số nhân chồi cao hẳn 4,13 lần Ở công thức NK11 với nồng độ Kinetin 1,0 mg/l hệ số nhân khơng tăng, mức 3,53 lần Như cơng thức thí nghiệm trên, cơng thức NK10 phù hợp để nhân nhanh chồi theo hướng phát sinh đa chồi (tạo chồi mới) Mặt khác, chồi phát sinh có số đốt khác cơng thức thí nghịêm Ở cơng thức đầu NK1, NK2, NK3, NK4, NK5, NK6 cho số đốt thường cao cơng thức có phối hợp BAP Auxin (NK7, NK8, NK9, NK10, NK11) Trong đó, công thức sử dụng BAP hàm lượng 0,5 mg/l cho số đốt nhiều với trung bình 3,67 đốt Công thức NK1 NK5 cho số đốt trung bình 2,67 đốt Các cơng thức cịn lại số đốt trung bình khoảng - 2,33 đốt Số đốt nhiều nguồn vật liệu để nhân chồi theo hướng cắt đốt Một hướng thường sử dụng nhân đối tượng áp dụng phương pháp nhân khác gặp khó khăn Như vậy, qua kết thí nghiệm trên: mơi trường phù hợp cho nhân chồi theo hướng nhân nhanh môi trường: MS + 0,5 mg/l BAP+ 0,3 mg/l NAA+ 0,5 mg/l Kinetin+ 0,5 g/l AC + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây Môi trường phù hợp cho nhân chồi theo hướng cắt đốt MS + 0,5 mg/l BAP + 0,5 g/l AC + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây A B Hình Chồi lan Kim tuyến môi trường nuôi cấy NK10(A) NK2 (B) 67 CHƢƠNG KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: Dựa vào kết thu đƣợc từ thí nghiệm chúng tơi thu đƣợc kết sau: Phƣơng pháp tạo mẫu in vitro: Phương pháp khử trùng thích hợp cho loại mẫu cấy là: + Thân ngầm: cồn 70% lần 1:1 phút + HgCl20,1%lần 2:7 phút + NaOCl 20%lần 3: 10 phút Tỷ lệ tạo mẫu 22,22%, tái sinh cao 26,67% + Thân khí sinh: cồn 70% lần 1: phút + HgCl2 0,1% lần 2: phút + NaOCl 20% lần 3: 13 phút + HgCl2 0,1% lần 4: phút Tỷ lệ tạo mẫu 20%, tỷ lệ mẫu tái sinh cao 26,67% + Quả: cồn 70% lần 1:1 phút + HgCl20,1% lần 2: phút + NaOCl 20% lần 3: 10 phút Với tỷ lệ mẫu 88,89%, tỷ lệ mẫu tái sinh 88,89% Mơi trƣờng ni cấy khởi đầu thích hợp: - Cho mẫu sinh dưỡng: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l Kinetin+ 0,25mg/l NAA+100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 0,5 g/l AC + 20 g/l sucrose + g/l agar cho tỷ lệ tái sinh 50% - Mơi trường thích hợp cho tái sinh phơi hạt: Knud* + 0,3mg/l TDZ + 0,5 mg/lBAP + 0,5 mg/l Kinetin +100ml/l ND + 100g/l khoai tây + 0,5 g/l AC + 20 g/l sucrose + g/l agar, cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao 88,89% Loại chồi thể chồi để nhân nhanh: - Loại chồi sử dụng để nhân nhanh theo hướng nhân tạo đa chồi chồi có nguồn gốc từ chồi nách với hệ số nhân 3,3 lần Loại chồi sử dụng để nhân nhanh theo hướng kéo dài tạo nhiều đốt chồi có nguồn gốc từ chồi đỉnh, với hệ số nhân đốt 2,8 lần - Thể chồi lựa chọn để nhân nhanh chồi có độ tuổi với hệ số nhân 5,33 lần Nhân nhanh thể chồi, chế độ nuôi cấy 68 - Cơng thức mơi trường thích hợp cho nhân nhanh thể chồi: Knud*+ 0,5 mg/l BAP+ 0,3 mg/l Kinetin +0,1 mg/l NAA +100ml/l ND + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + g/l agar) - Môi trường lỏng nuôi máy lắc cho hệ số nhân nhanh thể chồi (6,33 lần) cao nuôi cấy môi trường đặc (5,33 lần) sau Ảnh hƣởng hàm lƣợng đƣờng: Hàm lượng đường thích hợp cho phát sinh chồi từ thể chồi môi trường bổ sung 30 g/l đường với hệ số nhân 95, 83% Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi Môi trường phù hợp cho nhân chồi theo hướng nhân nhanh môi trường: MS + 0,5 mg/l BAP+ 0,3 mg/l NAA+ 0,5 mg/l Kinetin+ 0,5 g/l AC + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây Môi trường phù hợp cho nhân chồi theo hướng cắt đốt MS + 0,5 mg/l BAP + 0,5 g/l AC + 100ml/l ND + 100g/l khoai tây 4.2 Tồn tại: Do thời gian ngắn quy trình nhân giống lan Kim tuyến chưa hồn thiện, q trình nghiên cứu chưa có điều kiện để bố trí nhiều thí nghiệm phục vụ cho nội dung Nguồn mẫu cung cấp cịn q khơng ổn định, ảnh hưởng đến trình nghiên cứu Gây khó khăn cho cơng tác bố trí thí nghiệm 4.3 Kiến nghị: Có thời gian điều kiện để tiếp tục hồn thành nội dung cịn lại quy trình nhân giống lan Kim tuyến 69