Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro lan trầm rồng đỏ (dendrobium nestor o’brien)

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu

- Mục tiêu chung: Xây dựng được kỹ thuật nhân giống in vitro lan Trầm rồng đỏ (Dendrobium nestor O’Brien)

+ Xác định được công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro

Nghiên cứu này xác định rõ ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi Việc áp dụng các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp không chỉ tăng cường quá trình nhân nhanh chồi mà còn cải thiện khả năng ra rễ, từ đó giúp tạo ra cây hoàn chỉnh với chất lượng tốt hơn.

+ Xác định được ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây con ở giai đoạn vườn ươm.

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh in vitro

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây con ở giai đoạn vườn ươm.

Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống lan Trầm rồng đỏ (Dendrobium nestor O’Brien) do công ty TNHH hoa Đan Phượng cung cấp

Hình 2.1 Cây và hoa lan Trầm rồng đỏ

- Vật liệu nghiên cứu: Chồi nhánh lan chọn từ cây khỏe mạnh, mập mạp, không bị sâu bệnh

Môi trường nuôi cấy cơ bản MS được cải tiến bằng cách bổ sung đường sucrose làm nguồn cacbon, agar để làm cứng, khoai tây và các chất điều hòa sinh trưởng như Auxin và Cytokin Trước khi thêm agar, pH của môi trường được điều chỉnh về mức 5,8 và sau đó được khử trùng ở nhiệt độ 118 độ C trong 20 phút.

- Thời gian: Từ tháng 01/2022 đến tháng 5/2023.

Phương pháp nghiên cứu

- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu: chia thành các công thức khác nhau, phải có công thức đối chứng

- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: đảm bảo tính đồng nhất giữa các công thức trong thí nghiệm

- Số mẫu thí nghiệm đủ lớn (≥ 30)

- Thí nghiệm phải lặp lại ≥ 3 lần

2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể

Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành

Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp

Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo với các chế độ:

- Thời gian chiếu sáng: 10 - 12 h/ngày

2.4.2.1 Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro từ chồi nhánh

- Mục đích: Xác định được công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro

- Vật liệu: Chồi nhánh lan chọn từ cây khỏe mạnh, mập mạp, không bị sâu bệnh

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 30 bình/1 lần lặp

- Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sạch, số mẫu sạch nảy mầm Thời gian thu thập số liệu: Sau 4 - 8 tuần nuôi cấy và theo dõi

Chồi nhánh lan Trầm rồng đỏ được khử trùng thô bằng cách sử dụng xà phòng pha loãng Quy trình này bao gồm việc lắc mẫu trong 5 phút, sau đó xả lại dưới vòi nước sạch để loại bỏ hoàn toàn xà phòng Quá trình này được thực hiện lặp lại 3 lần để đảm bảo mẫu được khử trùng hiệu quả.

Quá trình khử trùng trong tủ hút vô trùng được thực hiện bằng cách sử dụng các loại hóa chất khử trùng khác nhau với thời gian khác nhau Nghiên cứu này áp dụng cồn 70ᵒ trong 1 phút, sau đó sử dụng dung dịch HgCl2 0,1% hai lần liên tiếp, với thời gian khử trùng lần lượt là 5 phút, 7 phút và 9 phút cho lần đầu, và 2 phút cho lần hai Tiếp theo, mẫu được khử trùng bằng dung dịch kháng sinh cefotaxime 400 mg/l trong 10 phút Sau mỗi lần khử trùng, mẫu được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần.

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch CTTN

Thời gian khử trùng (phút)

Cồn 70ᵒ HgCl 2 0,1% HgCl 2 0,1% Cefotaxime 400 mg/l

Chuẩn bị panh, kéo, đĩa và dao đã được khử trùng ở nhiệt độ 118°C trong 20 phút, sau đó cho vào tủ hút vô trùng và đốt 2-3 lần bằng cồn 70° để đảm bảo vô trùng Tiếp theo, dùng dao cắt đốt thân chứa mắt ngủ và cấy vào bình chứa môi trường nuôi cấy khởi đầu, bao gồm các thành phần: MS + 0,3 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,2 mg/l NAA + 20g/l đường + 5g/l agar + 100ml/l dịch chiết khoai tây, với pH là 5,8.

2.4.2.2 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng nhân nhanh thể chồi (protocorm) a) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

- Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

- Vật liệu: Thể chồi được lấy ra từ môi trường tạo thể chồi với kết quả tốt nhất

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 30 bình/1 lần lặp

- Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân nhanh thể chồi, đặc điểm của thể chồi Thời gian thu thập số liệu: Sau 4 - 6 tuần nuôi cấy và theo dõi

Thể chồi in vitro có khả năng nhân nhanh trong môi trường thích hợp với điều kiện ánh sáng phù hợp, dẫn đến sự phát triển của chồi lan Việc cấy chuyển chồi lan sang các môi trường nhân nhanh khác nhau, như MS với 20g/l sucrose, 100ml/l dịch chiết khoai tây, 5,0 g/l agar, cùng với các chất điều hòa sinh trưởng (NAA từ 0,1mg/l đến 0,3mg/l; BAP từ 0,2mg/l đến 0,5mg/l; Kinetin từ 0,2mg/l đến 0,5mg/l) sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của chồi.

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi

Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)

CT4 0,2 0,5 0,5 b) Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

- Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

Vật liệu thể chồi được thu thập từ môi trường tối ưu để đạt kết quả tốt nhất, sau đó được nuôi trồng dưới ba điều kiện ánh sáng đèn khác nhau.

 (AS1) Đèn huỳnh quang: ánh sáng trắng

 (AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh: 7 sáng đỏ

 (AS3) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 1 sáng xanh: 5 sáng đỏ: 1 sáng trắng

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 10 bình/1 lần lặp

- Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân nhanh thể chồi, đặc điểm của thể chồi

- Thời gian thu thập số liệu: Sau 6 tuần nuôi cấy và theo dõi

Từ công thức nhân nhanh thể chồi lan tốt nhất, tiến hành đưa mẫu vào nuôi trong môi trường ánh sáng khác nhau

Theo dõi và ghi nhận kết quả ở các môi trường khác nhau

2.4.2.3 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng nhân nhanh chồi a) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi

- Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

Vật liệu để nhân nhanh chồi in vitro bao gồm môi trường thích hợp với thời gian nuôi cấy đủ dài và điều kiện ánh sáng phù hợp, giúp tạo ra chồi lan Những chồi này sẽ được cấy vào môi trường nhân nhanh chồi, bao gồm: MS + 20g/l sucrose + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 5,0g/l agar cùng với các chất điều hòa sinh trưởng như được trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 30 bình/1 lần lặp

Hệ số nhân nhanh chồi và đặc điểm của chồi là các chỉ tiêu quan trọng trong nghiên cứu Thời gian thu thập số liệu diễn ra sau 4 - 8 tuần nuôi cấy và theo dõi Nghiên cứu cũng tập trung vào ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh chồi.

- Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh chồi

- Vật liệu: Từ công thức nhân nhanh chồi lan tốt nhất, tiến hành đưa mẫu vào nuôi trong môi trường gồm 3 ánh sáng đèn khác nhau:

 (AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh : 7 sáng đỏ

Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, 30 chồi/1 lần lặp

- Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân nhanh chồi, đặc điểm của chồi Thời gian thu thập số liệu: Sau 4 - 8 tuần nuôi cấy

2.4.2.4 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh a) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh

- Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh

Chồi lan đạt tiêu chuẩn sẽ được sử dụng trong thí nghiệm nghiên cứu tác động của môi trường nuôi cấy đến khả năng ra rễ và hình thành cây hoàn chỉnh.

Chồi lan được cấy vào môi trường MS với thành phần dinh dưỡng bao gồm 100ml/l dịch chiết khoai tây, 100ml/l dịch chuối, 20g/l đường, 5g/l agar và chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) với nồng độ khác nhau.

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 30 chồi/1 lần lặp

- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ chồi ra rễ, đặc điểm của rễ/cây con

Thời gian thu thập số liệu: Sau 4 - 8 tuần nuôi cấy và theo dõi b) Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh

- Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh

Từ công thức ra rễ lan tốt nhất, tiến hành đưa mẫu vào nuôi trong môi trường gồm 3 ánh sáng đèn khác nhau:

(AS1) Đèn huỳnh quang - sáng trắng

(AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh: 7 sáng đỏ

(AS3) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 1 sáng xanh: 5 sáng đỏ: 1 sáng trắng

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 30 chồi/1 lần lặp

- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ chồi ra rễ, đặc điểm của rễ/cây con Thời gian thu thập số liệu: Sau 4 - 8 tuần nuôi cấy và theo dõi

2.4.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây con ở giai đoạn vườn ươm

- Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây con ở giai đoạn vườn ươm

Các cây đạt tiêu chuẩn được huấn luyện, sau đó được rửa sạch, đem trồng trên các loại giá thể khác nhau

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây con

CTTN Tỷ lệ giá thể (phần)

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 30 giỏ trồng cây/1 lần lặp

- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ sống của cây Thời gian thu thập số liệu: Sau 3-8 tuần nuôi cấy và theo dõi.

Phương pháp thu thập và xử lí số liệu

Số liệu được thu thập sau khi mẫu tái sinh tạo thể chồi

Số liệu được thu thập bằng phương pháp quan sát, đo đếm trực tiếp Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm tạo mẫu sạch:

 Tỉ lệ mẫu sạch (%) = Tổng số 𝑏ì𝑛ℎ 𝑚ẫ𝑢 𝑠ạ𝑐ℎ,𝑛ả𝑦 𝑚ầ𝑚

𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố bình 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 𝑥 100 Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm nhân nhanh thể chồi:

 Hệ số nhân nhanh thể chồi (lần) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑏ì𝑛ℎ 𝑡ℎể 𝑐ℎồ𝑖

 Đặc điểm thể chồi: Kích thước và màu sắc thể chồi

Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi:

Hệ số nhân chồi (lần) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑏ì𝑛ℎ 𝑐ℎồ𝑖

 Đặc điểm chồi: Khích thước và màu sắc chồi

Chỉ tiêu cho ra rễ cây:

 Tỉ lệ chồi ra rễ (%) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑟𝑎 𝑟ễ

Chỉ tiêu thu thập đánh giá ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây:

 Tỷ lệ sống của cây (%) = Tổng số cây sống

Tổng số cây cấy ban đầu

Phương pháp xử lý số liệu được đưa vào phần mềm Excel và SPSS để tính toán phân tích kết quả

So sánh các công thức thí nghiệm dựa trên các tiêu chí như tỉ lệ mẫu tạo thể chồi, tỉ lệ mẫu sạch, tỉ lệ chồi ra rễ và tỷ lệ số cây sống được thực hiện thông qua tiêu chuẩn bình phương (χ2) Những chỉ tiêu này giúp đánh giá hiệu quả của từng công thức thí nghiệm, từ đó xác định phương pháp tối ưu trong việc phát triển cây trồng Việc phân tích tỉ lệ này không chỉ cung cấp cái nhìn sâu sắc về sự phát triển của cây mà còn hỗ trợ trong việc cải thiện quy trình thí nghiệm.

+ Nếu Sig (xác suất của χ2) nhỏ hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm

+ Nếu Sig (xác suất của χ2) lớn hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng không có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm

- So sánh giữa các công thức thí nghiệm về hệ số nhân chồi, số rễ TB/ cây bằng chỉ tiêu phân tích phương sai một nhân tố

+ Nếu Sig (xác suất của H hoặc F) nhỏ hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm

+ Nếu Sig (xác suất của H hoặc F) lớn hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng không có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro từ chồi nhánh

Khử trùng mẫu vật là một bước quan trọng và tốn thời gian, thường không thành công ngay lần đầu Việc chọn hóa chất và thời gian khử trùng phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý của cây, mùa lấy mẫu và tính nhạy cảm của cây Để đạt kết quả nuôi cấy mô cao, việc tạo mẫu sạch là yếu tố tiên quyết, ảnh hưởng lớn đến thành công của quá trình nhân giống Mẫu sạch in vitro là nguồn vật liệu cần thiết cho các bước tiếp theo trong quy trình nuôi cấy.

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, việc duy trì môi trường nuôi cấy vô trùng là rất quan trọng do nồng độ đường cao tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển nhanh chóng Những vi sinh vật này có thể cạnh tranh và phá hoại mẫu cấy, do đó, mục tiêu chính là đảm bảo tỷ lệ nhiễm khuẩn thấp hoặc không có, đồng thời duy trì tỷ lệ mẫu sống cao nhất và đảm bảo mô tồn tại, phân hóa, và sinh trưởng tốt.

Giai đoạn khử trùng là bước đầu tiên và quan trọng nhất trong quy trình nhân giống in vitro của cây Trong thí nghiệm này, chồi nhánh Lan Trầm rồng đỏ được làm sạch và khử trùng bằng các hóa chất khác nhau như Cồn 70ᵒ, HgCl2 0,1% và Cefotaxime 400 mg/l Thời gian khử trùng được thực hiện khác nhau: Cồn 70ᵒ trong 1 phút; dung dịch HgCl2 0,1% được sử dụng trong các khoảng thời gian 5 phút, 7 phút và 9 phút.

Quá trình khử trùng được thực hiện trong tủ hút vô trùng với Cefotaxime 400 mg/l trong thời gian 10 phút và 2 phút cho một số mẫu khác Kết quả tạo mẫu sạch được trình bày trong bảng 3.1 dưới đây.

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và tỷ lệ tái sinh của mẫu

CTTN Tổng số mẫu cấy

Số mẫu sạch tái sinh

Tỷ lệ mẫu sạch tái sinh (%)

Sau 8 tuần theo dõi, kết quả thí nghiệm khử trùng tạo mẫu sạch ở bảng 3.1 cho thấy sự ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng khác nhau là khác nhau đến khả năng tạo mẫu sạch và khả năng tái sinh của mẫu sạch

Sử dụng cồn 70ᵒ khử trùng trong 1 phút và dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% hai lần, lần đầu 5 phút và lần hai 2 phút, cùng với Cefotaxime 400 mg/l trong 10 phút, đạt tỷ lệ mẫu sạch là 74,4%.

Sử dụng cồn 70ᵒ khử trùng trong 1 phút, kết hợp với dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% hai lần (lần 1 trong 7 phút và lần 2 trong 2 phút) cùng với Cefotaxime 400 mg/l trong 10 phút, đạt được tỷ lệ mẫu sạch lên đến 85,6%.

Sử dụng cồn 70ᵒ khử trùng trong 1 phút, kết hợp với dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% hai lần, lần đầu 9 phút và lần hai 2 phút, cùng với Cefotaxime 400 mg/l trong 10 phút, cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 91,1%.

Thời gian khử trùng dài giúp tăng cường khả năng làm sạch mẫu, loại bỏ hiệu quả các chất bẩn, vi khuẩn và nấm bám trên bề mặt chồi nhánh trong môi trường tự nhiên Ngoài việc cải thiện độ sạch, thời gian khử trùng còn ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của chồi nhánh.

Thời gian khử trùng có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ tái sinh của mẫu sạch Cụ thể, trong công thức KT1, khi sử dụng dung dịch HgCl2 để khử trùng trong 5 phút, tỷ lệ tái sinh đạt 68,9%.

Thời gian khử trùng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tái sinh của mẫu, với 7 phút đạt 74,4% và 9 phút chỉ đạt 54,4% Sự khác biệt này cho thấy rằng thời gian khử trùng lâu hơn có thể gây tổn thương hoặc độc hại cho chồi nhánh, làm giảm khả năng phục hồi của mẫu.

Bảng 3.1 cho thấy rằng các công thức khử trùng chồi lan Trầm rồng đỏ có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo mẫu sạch (F > F crit) Thời gian khử trùng cũng ảnh hưởng đến kết quả tạo mẫu sạch và tái sinh của chồi; nếu thời gian quá ngắn, không thể tiêu diệt hoàn toàn các mầm bệnh, trong khi nếu thời gian quá dài, các mầm bệnh có thể bị loại bỏ nhưng lại gây tổn thương hoặc độc hại cho mẫu.

Công thức khử trùng hiệu quả nhất để đạt được mẫu sạch và khả năng tái sinh cao là công thức KT2, bao gồm khử trùng bằng cồn 70° trong 1 phút, HgCl2 0,1% trong 7 phút và Cefotaxime 400 mg/l trong 10 phút Thời gian này đảm bảo tỷ lệ mẫu sạch cao và đồng đều, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo Mặc dù khi tăng thời gian khử trùng, tỷ lệ mẫu sạch có thể đạt 91,1%, nhưng tỷ lệ mẫu tái sinh lại giảm xuống chỉ còn 54,4%.

Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo thể chồi

Sau khi cấy mẫu sạch vào môi trường khởi đầu, mẫu sẽ được chuyển sang môi trường cảm ứng để tạo thể chồi Môi trường nuôi cấy này chứa các thành phần cần thiết cho sự phát triển của thể chồi.

MS + 20g/l đường + 5g/l agar, bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (NAA, BAP, Kinetin) với các nồng độ khác nhau Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo thể chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)

CTTN Tổng số mẫu cấy

Số mẫu tạo thể chồi

Tỷ lệ mẫu tạo thể chồi (%) Đặc điểm thể chồi

CT1 90 54 60,00 ± 0,03 Thể chồi nhỏ, vàng

CT2 90 70 77,78 ± 0,05 Thể chồi nhỏ, xanh

CT3 90 67 74,44 ± 0,04 Thể chồi nhỏ, xanh nhạt

CT4 90 81 90,00 ± 0,11 Thể chồi mập, xanh đậm

Nghiên cứu cho thấy rằng chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng cảm ứng tạo thể chồi Cụ thể, khi sử dụng nồng độ BAP và Kinetin thấp (CT1), khả năng tạo chồi được cải thiện rõ rệt.

Tỷ lệ mẫu tạo chồi thấp với thể chồi nhỏ và màu vàng ở CT3 Khi áp dụng công thức kết hợp 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l Kinetin, tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nhất đạt 90%, với thể chồi mập và màu xanh đậm Do đó, công thức CT4: MS + 0,2 mg/l cho kết quả khả quan hơn.

NAA + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 20g/l đường sucrose + 5g/l agar cho kết quả tốt nhất

Hình 3.2 Thể chồi hình thành trong các công thức môi trường sau 4

Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng nhân nhanh thể chồi (protocorm)

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi Để thu được số lượng cây lớn trong thời gian ngắn thì khả năng nhân nhanh thể chồi trong nhân giống lan nói chung và giống lan Trầm rồng đỏ nói riêng được đánh giá là yếu tố quyết định hệ số nhân của cả quy trình Đây là bước tạo nguồn nguyên liệu cho quá trình nhân giống, tạo cây hoàn chỉnh về sau Việc nghiên cứu các yếu tố hoá lí sao cho phù hợp để đạt được hệ số nhân chồi tối ưu là yếu tố quyết định cho kết quả thành công của quy trình nhân giống

Việc gieo phôi hạt trong môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng vẫn có thể hình thành thể chồi, nhưng quá trình này diễn ra chậm, dẫn đến thể chồi không đồng đều, kích thước nhỏ, chất lượng kém và hệ số nhân thấp Để tăng cường hiệu quả nhân giống, cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy, giúp kích thích tế bào phôi hạt phân chia nhanh, tăng cường sức sinh trưởng và nâng cao khả năng tạo thể chồi.

Hooc môn sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích phôi tạo thể chồi nhanh chóng Sự kết hợp giữa Auxin (NAA, IBA) và Cytokinin (Kinetin; BAP) ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi Nồng độ điều chỉnh của các loại hooc môn này quyết định mức độ hình thành chồi Sau khi tái sinh trên môi trường nuôi cấy ban đầu, thể chồi lan sẽ được nuôi cấy tiếp cho đến khi đạt đủ điều kiện để chuyển sang môi trường nhân nhanh thể chồi.

Thể chồi được hình thành từ giai đoạn cảm ứng sẽ được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi Thí nghiệm được thiết kế với nhiều công thức khác nhau, bao gồm môi trường MS có bổ sung 100ml/l dịch chiết khoai tây, 20g/l đường, 5g/l agar, cùng với các chất điều hòa sinh trưởng như NAA, BAP và Kinetin với hàm lượng khác nhau.

Bảng 3.3 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi sau 6 tuần nuôi cấy

Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)

Hệ số nhân thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi NAA BAP Kinetin

NN1 0,2 0,3 0,3 90 4,12 ± 0,04 Thể chồi nhỏ, vàng

NN2 0,2 0,3 0,5 90 6,62 ± 0,05 Thể chồi mập, xanh đậm

NN3 0,2 0,5 0,3 90 4,55 ± 0,02 Thể chồi nhỏ, xanh nhạt NN4 0,2 0,5 0,5 90 4,07 ± 0,04 Thể chồi nhỏ, vàng

Số liệu bảng 3.3 cho thấy chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng nhân nhanh thể chồi của lan Trầm rồng đỏ

Môi trường nuôi cấy với thành phần MS + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP và bổ sung Kinetin (0,3 mg/l và 0,5 mg/l) có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân thể chồi và chất lượng thể chồi Cụ thể, môi trường bổ sung 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin cho hệ số nhân thể chồi thấp nhất (4,07 lần) với thể chồi nhỏ và màu vàng Điều này có thể do nồng độ chất điều hòa sinh trưởng cao gây ức chế quá trình nhân nhanh thể chồi.

Như vậy, môi trường MS + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP + 0,5 mg/l

Kinetin kết hợp với 100ml/l dịch chiết khoai tây, 20g/l đường sucrose và 5,0 g/l agar là công thức tối ưu cho nhân nhanh thể chồi lan Trầm rồng đỏ Trong quá trình nhân giống in vitro, nhiều loại cây trồng chỉ thích hợp với các chất thuộc nhóm cytokinin, nhưng sự kết hợp giữa cytokinin và auxin có thể nâng cao hiệu quả nhân giống.

Hình 3.2 Thể chồi trong các công thức môi trường nhân nhanh sau 6 tuần nuôi cấy

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

Từ công thức tốt nhất để nhân nhanh thể chồi lan Trầm rồng đỏ, ta đem vào nuôi trong môi trường gồm 3 ánh sáng đèn khác nhau:

 (AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh: 7 sáng đỏ

Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Cường độ ánh sáng là yếu tố then chốt trong quá trình quang hợp, ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi và hàm lượng chlorophyll của thể chồi Cả cường độ ánh sáng cao và thấp đều có tác động rõ rệt đến các yếu tố này.

Khi gặp điều kiện ánh sáng yếu, cây có xu hướng tổng hợp nhiều chlorophyll để tăng cường khả năng quang hợp Kết quả này hoàn toàn phù hợp với những gì chúng tôi đã quan sát được Đánh giá kết quả sau 6 tuần nuôi cấy được trình bày trong các bảng dưới đây.

Bảng 3.4 Kết quả ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi

Nguồn ánh sáng Hệ số nhân nhanh thể chồi (lần) Đặc điểm của thể chồi

AS 1 4,24 Thể chồi nhỏ, yếu, vàng

AS 2 5,26 Thể chồi mập, xanh đậm

AS 3 4,62 ± 0,03 Thể chồi bình thường

Sau 6 tuần theo dõi, kết quả cho thấy các điều kiện ánh sáng khác nhau thì ảnh hưởng đến hệ số nhân nhanh thể chồi và đặc điểm của thể chồi lan Ánh sáng LED có tác động đáng kể số lượng và toàn bộ hình thái thể chồi lan Trầm rồng đỏ Tổ hợp ánh sáng LED xanh và LED đỏ có ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi lan Trong khi ánh sáng huỳnh quang không có khả năng kích thích số lượng thể chồi cao hơn so với công thức đèn LED xanh và đèn LED đỏ Qua bảng 3.4 cho ta thấy điều kiện ánh sáng khác nhau sẽ tác động khác nhau đến sự tạo thể chồi trong quá trình nhân giống Ở mẫu cây nuôi trong môi trường ánh sáng (AS2): Đèn LED tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh: 7 sáng đỏ số thể chồi cao hơn, chồi mập và sinh trưởng phát triển tốt hơn, màu xanh đậm so với nuôi dưới ánh sáng trắng huỳnh quang Protocorm nuôi cấy trong ba điều kiện ánh sáng đều có hệ số nhân cao hơn so với đối chứng Protocorm được nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng tổ hợp đèn LED cho hệ số nhân protocorm cao nhất với hệ số nhân là 5,26 lần Môi trường sử dụng ánh sáng huỳnh quang cho hệ số thấp nhất (chỉ đạt 4,24 lần) Đồng thời đặc điểm protocorm thu được trong những điều kiện ánh sáng khác nhau cũng có sự khác biệt

Hình 3.3 Thể chồi lan dưới các điều kiện ánh sáng khác nhau

Kết luận cho thấy rằng điều kiện ánh sáng ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành chồi trong quá trình nhân giống cây Cụ thể, mẫu cây được nuôi trong môi trường ánh sáng (AS2) với đèn LED kết hợp 3 ánh sáng xanh và 7 ánh sáng đỏ cho số lượng chồi cao hơn, chồi mập và phát triển tốt hơn, đồng thời có màu xanh đậm hơn so với cây nuôi dưới ánh sáng trắng huỳnh quang.

3.4 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng nhân nhanh chồi

3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi

Kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro nhằm tạo ra số lượng lớn cá thể đồng nhất về di truyền, sinh trưởng và phát triển đồng đều, với đặc điểm giống hệt cá thể mẹ Trong giai đoạn này, ngoài các chất dinh dưỡng cần thiết, môi trường nuôi cấy cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Liều lượng của các chất điều hòa sinh trưởng như NAA, BAP, và Kinetin là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng tạo thể chồi của mô, cũng như sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi.

Nhân nhanh chồi là giai đoạn quyết định trong quá trình nhân giống, tạo ra số lượng lớn vật liệu in vitro Môi trường dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng, và việc bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của chồi Sau 4-8 tuần, thể chồi sẽ phát triển thành chồi lan, được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu ảnh hưởng của ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi lan.

Nhân nhanh chồi là giai đoạn quan trọng trong việc tạo ra cây con đạt tiêu chuẩn trồng ngoài vườn ươm Môi trường MS được sử dụng với các thành phần bổ sung như 100ml/l dịch chiết khoai tây, 100ml/l dịch chuối, 20g/l đường sucrose, 5g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng BAP, Kinetin, NAA với nồng độ khác nhau để nghiên cứu khả năng kích thích tăng trưởng và nhân nhanh chồi Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng kích thích tăng trưởng và nhân nhanh chồi lan Trầm rồng đỏ

Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Tổng số mẫu cấy

Hệ số nhân chồi (lần)

Chiều cao trung bình của chồi (cm) Đặc điểm của chồi NAA BAP Kinetin

NC1 0,1 0,3 0,3 90 2,42±0,06 2,23±0,05 Chồi nhỏ, ngắn, vàng

NC2 0,1 0,3 0,5 90 3,16±0,07 2,97±0,07 Chồi nhỏ, ngắn, xanh

Chồi mập, dài, xanh đậm

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) với nồng độ khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng kích thích tăng trưởng và nhân nhanh chồi lan Trầm rồng đỏ Cụ thể, ở NC1 với NAA 0,1 mg/l, BAP 0,3 mg/l và Kinetin 0,3 mg/l, hệ số nhân chồi đạt 2,42 lần, chồi nhỏ, ngắn, vàng, chiều cao trung bình 2,23 cm Tại NC2, giữ nguyên NAA và BAP, tăng Kinetin lên 0,5 mg/l, hệ số nhân chồi tăng lên 3,16 lần, chồi nhỏ, ngắn, xanh, chiều cao trung bình 2,97 cm Ở NC3, giữ nguyên NAA và Kinetin, tăng BAP lên 0,5 mg/l, hệ số nhân chồi đạt 3,64 lần, chồi nhỏ, ngắn, xanh, chiều cao trung bình 3,46 cm Cuối cùng, ở NC4, giữ nguyên NAA, tăng BAP và Kinetin lên 0,5 mg/l, hệ số nhân chồi tăng lên 4,53 lần, chồi mập, xanh đậm, dài, chiều cao trung bình 4,33 cm.

Hình 3.4 Chồi lan Trầm rồng đỏ trong các môi trường nhân nhanh sau 3 tuần nuôi cấy

Hình 3.5 Bình chồi lan Trầm rồng đỏ trong các môi trường nhân nhanh sau 6 tuần nuôi cấy Kết luận:

Công thức NC4 có thành phần MS + 100 ml/l dịch chiết khoai tây +

Công thức tối ưu cho việc nhân giống chuối bao gồm 100ml/l dịch chuối, 20g/l đường sucrose, 5g/l agar, 0,1mg/l NAA, 0,5mg/l BAP và 0,5mg/l Kinetin Công thức này mang lại hệ số nhân chồi cao nhất lên tới 4,53 lần, với chồi phát triển mập, dài và có màu xanh đậm.

Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh

3.5.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh

Sau khi tạo ra số lượng chồi lớn, bước tiếp theo trong phương pháp nuôi cấy mô tế bào là tạo cây con hoàn chỉnh Giai đoạn này được xem là bước cuối cùng của quá trình nhân giống cây, đảm bảo rằng chồi phát triển ra rễ đồng đều và có tỷ lệ sống cao khi được đưa ra trồng.

Auxin đóng vai trò quyết định trong việc điều hòa sinh trưởng ở giai đoạn này, đặc biệt là khả năng hình thành rễ của mẫu mô nuôi cấy Chất này giúp kích thích sự phát triển và hình thành rễ, góp phần quan trọng trong quá trình nhân giống và phát triển cây trồng.

Tiến hành cấy chuyển chồi lan đạt tiêu chuẩn chất lượng và kích thước vào môi trường MS, kết hợp với 100ml/l dịch khoai tây, 100ml/l dịch chuối, 20g/l đường, 5g/l agar và bổ sung chất ĐHST ở các nồng độ khác nhau Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ lan Trầm rồng đỏ sau 6 tuần nuôi cấy

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

Số rễ trung bình/cây

Chiều dài trung bình/rễ (cm) Đặc điểm của rễ

R2 0,3 90 100 5,41±0,10 3,55±0,08 Rễ dài, mập, màu xanh đậm

R3 0,5 90 100 4,50±0,08 2,78±0,07 Rễ dài, nhỏ, màu trắng

R4 0,7 90 100 3,05±0,06 2,21±0,05 Rễ ngắn, nhỏ, màu trắng

Dựa trên số liệu từ bảng 3.7, khả năng ra rễ của lan Trầm rồng đỏ đạt 100%, cho thấy sự phát triển mạnh mẽ của loại cây này Tuy nhiên, có sự khác biệt rõ rệt về số lượng rễ trung bình mỗi cây và chiều dài rễ trung bình mỗi cây giữa các công thức thí nghiệm.

Qua kết quả thống kê được, cho thấy nhóm auxin chiếm phần rất quan trọng đến khả năng ra rễ của cây

Khi nồng độ auxin gia tăng, các chỉ số R1 và R2 cũng tăng theo Tuy nhiên, nếu nồng độ auxin vượt quá mức cho phép, điều này sẽ ức chế quá trình ra rễ và ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng rễ, như được thể hiện trong công thức R3 và R4 Do đó, công thức R2: MS + là rất quan trọng để duy trì sự cân bằng trong quá trình phát triển của rễ.

Công thức tối ưu cho sự phát triển rễ cây bao gồm 100ml/l dịch chiết khoai tây, 100ml/l dịch chuối, 20g/l đường, 5g/l agar và 0,3 mg/l NAA Công thức này cho thấy số rễ trung bình đạt 5,41 rễ/cây, với chiều dài rễ là 3,55 cm, tạo ra những rễ dài, mập và có màu xanh đậm.

Hình 3.8 Rễ cây lan Trầm rồng đỏ trong các loại môi trường khác nhau

Hình 3.91 Cây lan Trầm rồng đỏ trong môi trường ra rễ R2

3.5.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh

Từ công thức ra rễ lan Trầm rồng đỏ tối ưu nhất, ta đem vào nuôi trong môi trường gồm 3 ánh sáng đèn khác nhau:

 (AS2) Đèn LED tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh: 7 sáng đỏ

Đèn LED tổ hợp ánh sáng (AS3) với 1 sáng xanh, 5 sáng đỏ và 1 sáng trắng có ảnh hưởng đáng kể đến hình thái của mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500 lux thường được sử dụng trong nuôi cấy nhiều loại mô Khi cường độ ánh sáng vượt quá mức này, sự sinh trưởng của chồi sẽ chậm lại, nhưng quá trình tạo rễ lại được thúc đẩy Trong nuôi cấy in vitro, ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Kết quả đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy sẽ được thống kê trong bảng sau.

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ của Lan Trầm rồng đỏ

Nguồn ánh sáng Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

Chiều dài trung bình của rễ (cm) Đặc điểm của rễ

(AS1) 94,60±0,18 3,93±0,05 Rễ ngắn, nhỏ, màu trắng (AS2) 97,25±0,20 4,72±0,06 Rễ ngắn, nhỏ, màu trắng

Ánh sáng có ảnh hưởng đáng kể đến hình thái chồi và sự phát triển của rễ cây lan Cụ thể, rễ lan có chiều dài trung bình là 99,33±0,22 mm và đường kính khoảng 5,34±0,08 mm, với đặc điểm là rễ dài, mập và màu xanh đậm.

Trong các thí nghiệm, cây trồng phát triển dưới ánh sáng LED cho thấy sự khác biệt rõ rệt về số lượng rễ trên mỗi cây, với tỷ lệ rễ trên mỗi chồi khá cao.

Kết quả từ bảng 3.8 chỉ ra rằng điều kiện ánh sáng khác nhau ảnh hưởng đến quá trình ra rễ trong nhân giống Cụ thể, nghiệm thức sử dụng đèn LED tổ hợp ánh sáng với một bóng sáng xanh (AS3) cho thấy hiệu quả rõ rệt.

Trong nghiên cứu, ánh sáng đỏ (AS3) cho thấy tỉ lệ chồi ra rễ cao nhất đạt 99,33%, cùng với sự phát triển dài và khỏe của rễ, có màu xanh đậm và mập mạp Điều này chứng minh rằng ánh sáng với bước sóng thích hợp là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của bộ rễ.

Bên cạnh đó lá của cây lan in vitro dưới (AS3) nhiều hơn và xanh hơn hẳn so với nghiệm thức AS2 và AS1

Với kết quả trên đã phần nào chứng minh được ánh sáng tổ hợp đèn LED có tác động đến quá trình ra rễ của lan Trầm rồng đỏ

Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng cho thấy rằng ánh sáng có tác động đáng kể đến khả năng ra rễ của lan Trầm rồng đỏ Bên cạnh đó, kết quả cũng chỉ ra rằng giá thể đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao khả năng sống sót của cây con trong giai đoạn vườn ươm.

Cây con hoàn chỉnh có chiều cao từ 4 - 5 cm, với 5 - 6 rễ mập, được huấn luyện dưới ánh sáng tán xạ trong khoảng 1 - 2 tuần trước khi cấy ra vườn ươm Sau khi rửa sạch thạch bám ở rễ, cây con được cấy vào các giá thể khác nhau đã qua xử lý Kết quả sau 3 tuần cho thấy sự phát triển mạnh mẽ của cây.

8 tuần ra ngôi được thể hiện ở bảng 3.9 và bảng 3.10

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giá thể đến khả năng sống của cây mô giai đoạn vườn ươm sau 3 tuần ra ngôi

(phần) Tổng số mẫu cấy (cây)

Tỷ lệ cây sống sót (%) Đặc điểm của cây

GT1 1 1 90 78,2±0,14 Cây yếu, rễ mới bám giá thể

GT2 1 2 90 92,5±0,20 Cây khỏe, thân cứng, xuất hiện lá mới, rễ bám giá thể tốt

Giá thể ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống của cây mô lan Trầm rồng đỏ trong giai đoạn vườn ươm Cụ thể, giá thể vỏ thông và rêu rừng theo tỷ lệ 1:1 (GT1) cho tỷ lệ sống thấp nhất là 78,2%, với cây yếu và rễ mới bám Trong khi đó, giá thể trộn vỏ thông và rêu rừng theo tỷ lệ 1:2 (GT2) đạt tỷ lệ sống cao nhất là 92,5%, với cây khỏe mạnh, thân cứng và rễ bám tốt Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ rêu rừng ở công thức GT3, tỷ lệ sống giảm, cây trở nên yếu và rễ mới bám không chắc Điều này có thể do tỷ lệ rêu rừng cao làm giảm khả năng thoát nước, tạo môi trường quá ẩm, từ đó ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của rễ.

Hình 3.11 Cây mô lan Trầm rồng đỏ trên các giá thể ra cây khác nhau sau 3 tuần ra ngôi

Sau 8 tuần ra ngôi, giá thể ra ngôi cây mô lan Trầm rồng đỏ vẫn có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cây con ở giai đoạn vườn ươm Giá thể vỏ thông và rêu rừng theo tỷ lệ 1:1 (GT1) cho tỷ lệ cây sống thấp nhất (chỉ đạt 74,4 %), cây yếu, thân nhỏ, rễ mới bám vào giá thể Giá thể trộn vỏ thông và rêu rừng theo tỷ lệ 1:2 (GT2) cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ cây sống sót là 90,8%, cây khỏe, thân cứng, xuất hiện lá mới, rễ bám vào giá thể tốt Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giá thể đến khả năng sống của cây mô giai đoạn vườn ươm sau 8 tuần ra ngôi dược thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3 12 Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giá thể đến khả năng sống của cây mô giai đoạn vườn ươm sau 8 tuần ra ngôi

Tổng số mẫu cấy (cây)

GT1 1 1 90 74,4±0,14 Cây yếu, thân nhỏ, rễ mới bám giá thể

Cây khỏe, thân cứng, xuất hiện lá mới, rễ bám giá thể tốt

GT3 1 3 90 80,2±0,16 Cây yếu, thân nhỏ, rễ mới bám giá thể

Giá thể trộn vỏ thông và rêu rừng theo tỷ lệ 1:3 (GT3) cho tỷ lệ cây sống sót là 80,2%, cây yếu, thân nhỏ, rễ mới bám vào giá thể

Hình 3.12 Cây mô lan Trầm rồng đỏ trên các giá thể ra cây khác nhau sau 8 tuần ra ngôi

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Dựa trên kết quả thu được từ các thí nghiệm trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, nghiên cứu đã tập trung vào kỹ thuật nhân giống in vitro cây lan Trầm rồng đỏ, nhằm tối ưu hóa quy trình và nâng cao tỷ lệ sống sót của cây giống Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc bảo tồn loài lan quý hiếm mà còn mở ra cơ hội phát triển kinh tế bền vững cho ngành nông nghiệp.

(Dendrobium nestor red Dragon)” tôi đưa ra kết luận như sau:

Công thức khử trùng mẫu sạch hiệu quả nhất để đạt tỷ lệ tái sinh cao là sử dụng cồn 70ᵒ trong 1 phút, HgCl2 0,1% trong 7 phút, và Cefotaxime 400 mg/l trong 10 phút.

Công thức môi trường tối ưu cho việc nhân nhanh thể chồi lan Trầm rồng đỏ bao gồm: môi trường MS kết hợp với 0,2 mg/l NAA, 0,3 mg/l BAP, 0,5 mg/l Kinetin, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 20 g/l đường sucrose và 5 g/l agar.

Công thức môi trường tối ưu để nhân nhanh chồi lan Trầm rồng đỏ bao gồm: môi trường MS, 100ml/l dịch chiết khoai tây, 100ml/l dịch chuối, 20g/l đường sucrose, 5g/l agar, 0,1mg/l NAA, 0,5mg/l BAP và 0,5mg/l Kinetin.

Công thức môi trường R2 (MS + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 100ml/l dịch chuối + 20g/l đường + 5g/l agar + 0,3 mg/l NAA) được xác định là công thức ra rễ tốt nhất, với số rễ trung bình mỗi cây đạt 5,41 và chiều dài rễ trung bình là 3,55 cm Các rễ phát triển dài, mập, có màu xanh đậm, cho thấy hiệu quả vượt trội của công thức này trong việc kích thích sự ra rễ.

Giá thể trồng cây hiệu quả nhất là hỗn hợp vỏ thông và rêu rừng theo tỷ lệ 1:2 (GT2), đạt tỷ lệ sống sót của cây lên tới 92,5% sau 3 tuần và 90,8% sau 8 tuần Cây phát triển khỏe mạnh, với thân cứng cáp, lá mới xuất hiện và rễ bám chắc vào giá thể.

Kiến nghị

Nghiên cứu tiếp tục tập trung vào ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, các chất điều hòa sinh trưởng và tổ hợp ánh sáng đèn LED đơn sắc đến khả năng tạo thể chồi và ra rễ của lan Trầm rồng đỏ.

1 Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009) Nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium anosmum, Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô và nghiên cứu các loại giá thể trồng lan Dendrobium mini thích hợp

2 Nguyễn Thị Hồng Gấm và cộng sự (2007) Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhychostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Viện Công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp

3 Phan Thị Kim Hạnh và cộng sự (2008) Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Đai Châu (Rhynchostylis gigantea)

4 Vũ Ngọc Lan và cs, 2010 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng đến quá trinh sinh trưởng của lan Hoàng thảo trúc đen trên 3 loại giá thể: gỗ nhãn, than củi, xơ dừa

5 Nguyễn Thị Loan (2010) Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan

Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) qua phôi hạt bằng phương pháp nhân giống in vitro Trường Đại học Lâm nghiệp

6 Phạm Thị Liên (2002) Nghiên cứu nhân giống in vitro đối với một số loài địa lan

7 Ngọc Minh và cộng sự (2022) Nghiên cứu các biện pháp thử nghiệm nhân giống và trồng lan Trầm rồng đỏ (Dendrobium nestor O’Brien)

8 Lê Minh Nguyệt và cộng sự (2009) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và chất điều hoà sinh trường đến khả năng tái sinh và nhân nhanh giống

Hoàng lan thuộc chi lan Kiếm (Cymbidium)

9 Dương Tấn Nhựt và các cộng sự (2006) Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy đến sự hình thành thể chồi và rút ngắn thời gian sinh trường của hai giống địa lan (cymbidium spp.) Vàng Mỳ và Tím Hột

10 Vũ Thị Phan, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2019) Nghiên cứu nhân giống in vitro lan trầm tím (Dendrobium nestor) Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp, 3 (1): 38- 43

11 Nguyễn Thị Thuận (2020) “Nghiên cứu tác động của một số yếu tố hóa - lý trong nhân giống ba dòng lan Cattleya bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”

Khóa luận tốt nghiệp- Trường Đại học Lâm nghiệp

12 Nguyễn Đức Thuấn “Nghiên cứu tuyển chọn và phát triển một số loài địa lan kiếm bản địa có giá trị kinh tế cao vùng miền núi phía Bắc”

13 Lê Thị Thúy, Trần Thị Anh Thoa (2017) “Ảnh hưởng cuả đèn Led lên sinh trưởng của Dendrobium lituiflorum Lindl và Dendrobium Shavin White” Tạp chí Khoa học công nghệ và Thực phẩm, 13 (1) 68-73

14 Khuất Hữu Trung và cộng sự (2005) Nghiên cứu nhân nhanh phong lan

Hồ Điệp từ phát hoa và chóp rễ Viện Di truyền Nông nghiệp Hà Nội

15 Nguyễn Văn Việt (2017) Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro trong nhân giống lan Hoàng thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindley) Tạp chí Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp, 4: 39 - 45

16 Hahn et al (2000) Effect of light quality on stem elongation of

17 Kubota, S and K Yoneda 1993 Effect of light intensity preceding day- night temperatures on the sensitivity of Phalaenopsis to flower J Japan Soc

18 So-young, P., Hosakatte, N M và Kee-yoeup, P (2002) Rapid propagation of Phalaenopsis from floral stalk-derived leaves In Vitro Cell

19 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

20 https://www.bluenanta.com/detail/hybrid/

22 http://www.orchidkb.com/images/mapbig.gif

Phụ biểu 1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và tỷ lệ tái sinh của mẫu

Số mẫu sạch tái sinh

Tỷ lệ mẫu sạch tái sinh (%)

Phụ biểu 2 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo thể chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)

CTTN Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Tổng số mẫu cấy

Số mẫu tạo thể chồi

Tỷ lệ mẫu tạo thể chồi (%) Đặc điểm thể chồi NAA BAP Kinetin

Thể chồi nhỏ, xanh nhạt

Thể chồi mập, xanh đậm

Phụ biểu 3 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi sau 6 tuần nuôi cấy

CTTN Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Tổng số mẫu cấy

Hệ số nhân thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi

NN2 0,2 0,3 0,5 90 6,62 ± 0,05 Thể chồi mập, xanh đậm

NN3 0,2 0,5 0,3 90 4,55 ± 0,02 Thể chồi nhỏ, xanh nhạt

Phụ biểu 4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng kích thích tăng trưởng và nhân nhanh chồi lan Trầm rồng đỏ

Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Tổng số mẫu cấy

Hệ số nhân chồi (lần)

Chiều cao trung bình của chồi (cm) Đặc điểm của chồi NAA BAP Kineti n

NC1 0,1 0,3 0,3 90 2,42±0,06 2,23±0,05 Chồi nhỏ, ngắn, vàng

NC4 0,1 0,5 0,5 90 4,53±0,12 4,33±0,10 Chồi mập, dài, xanh đậm

Phụ biểu 5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ lan Trầm rồng đỏ sau 6 tuần nuôi cấy