Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilussetaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, lan biết đến loài hoa quý phái, hoa bậc vua chúa vương giả Lan phát vào năm 40 kỷ VIII, có 15.000 loại lan trồng khác trên giới Tại Việt Nam, hoa lan vô đa dạng phong phú, có khoảng 1.000 lồi hoa loại, chúng sinh sản vùng rừng, núi Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, lan Việt Nam đẹp cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có nhiều quý có trước thấy mọc Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati) Họ lan (Orchidaceae) số họ thực vật đa dạng Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi Thơng thường lan sử dụng làm cảnh Ngồi ra, có nhiều lồi lan cịn sử dụng làm thuốc Chi lan Kim tuyến Anoectochilus Việt Nam thống kê 12 lồi, có lồi lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall ex Lindl phân bố rộng hầu hết tỉnh nước, biết đến nhiều giá trị làm cảnh, mà giá trị làm thuốc Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ lâu, nên loài lan Kim tuyến bị đe dọa nghiêm trọng, bị tuyệt chủng ngồi tự nhiên khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Kim tuyến cấp báo Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng mục đích thương mại nhóm thực vật rừng nguy cấp EN A1a,c,d, sách đỏ Việt Nam 2007 Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến - Anoectochilus setaceus Blume triển khai cung cấp sở khoa học thực tiễn để tạo hàng loạt ổn định mặt di truyền nhằm bảo tồn phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí Xuất phát từ sở đó, chúng tơi lựa chọn thực nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý” CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Lan Kim tuyến Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) gọi lan trang sức vẻ đẹp hấp dẫn nó, Carlvon Blume mô tả năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae Trên giới thống kê 51 loài Ở Việt Nam thống kê 12 lồi, loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Đồng danh (Anoectochilus roxburghi Wall.) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Bộ: Phong lan (Orchidales) Đây loài đơn thân, mọc đất, có thân rễ mọc dài; thân đất mọng nước có nhiều lơng mềm, mang - mọc xoè sát đất Lá hình trứng, gần trịn gốc, chóp nhọn có mũi ngắn, cỡ - x - cm, mặt màu nâu thẫm có vệt vàng màu hồng nhạt gân, mặt màu nâu nhạt Cuống dài - cm Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - cm; môi dài đến 1,5 cm, bên gốc mang - dải hẹp, chẻ đôi thành thuỳ hình thn trịn Bầu dài 13mm, có lông thưa Mùa hoa tháng 2, tháng Tái sinh chồi từ thân rễ hạt ít, sinh trưởng chậm Là loại ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới độ cao 500 - 1600m Mọc rải rác vài ba đất ẩm, giàu mùn rụng Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng) Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,… Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến lồi thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thơng, có tính kháng khuẩn, chữa bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh Lồi lan dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến) Trước đó, lan Kim tuyến (A setaceus) dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi nóng gan (Tạ A Mộc Trần Kiến Đào, 1958) Hơn người ta phát khả phòng chống ung thư loại thảo dược Theo tài liệu nghiên cứu Trung Quốc công bố gần kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột kỹ thuật quang phổ phân lập, xác định cấu trúc hố học thử hoạt tính sinh học số hợp chất có lồi lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363) Bằng kỹ thuật quang phổ xác định hợp chất hố học Các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả làm giảm gốc tự thể, nên có khả phịng bệnh tốt Đặc biệt có hai axít hữu phân lập Olenolic acid Ursolic acid có khả chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn… 1.1.1 Đặc điểm hình thái Lan Kim tuyến thảo, mọc đất, có thân rễ mọc dài; thân đất mọng nước, mang mọc xòe sát đất a Thân rễ Lan Kim tuyến thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đơi nghiêng, bị dài Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình 7,87 cm Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình 3,17 mm Số lóng thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình 4,03 lóng Chiều dài lóng từ 1-6 cm, trung bình 1,99 cm Thân rễ thường có màu xanh trắng, đơi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, khơng phủ lơng b Thân khí sinh Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng mặt đất, mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình cm Đường kính thân khí sinh từ 3- mm, trung bình 3,08 cm Thân khí sinh mang nhiều lóng, lóng có chiều dài khác Số lóng thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình 2,87 Chiều dài lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, khơng phủ lơng; thường có màu xanh trắng, đơi có màu hồng nhạt c Rễ Rễ lan Kim tuyến mọc từ mẫu thân rễ Đôi rễ hình thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thơng thường mẫu có rễ, đơi có vài rễ hình thành từ mấu thân rễ Số lượng kích thước rễ thay đổi tuỳ theo cá thể Số rễ thường từ - 10, trung bình 5,4 Chiều dài rễ thay đổi từ 0,5 - cm, rễ dài trung bình 6,07cm ngắn trung bình 1,22 cm, chiều dài trung bình rễ 3,82 cm d Lá Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè mặt đất Lá hình trứng, gần trịn gốc, đầu nhọn có mũi ngắn, thường dài từ - cm, trung bình 4,03 cm rộng từ - cm, trung bình 3,12 cm Lá có màu nâu đỏ mặt phủ lông mịn nhung Hệ gân mạng lưới lông chim, thường có gân gốc Các gân thường có màu hồng mặt rõ Đôi gân có màu vàng nhạt Mặt có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với gân gốc rõ Các gân bên phía rìa rõ, gân ở mặt không rõ Cuống dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn có màu trắng xanh, đơi đỏ tía bẹ Bẹ rõ nhẵn Số thay đổi từ - 6, thông thường có Kích thước thay đổi, thường có kích thước khác rõ rệt e Hoa, Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 - 20 cm thân, mang - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài - 10 mm, màu hồng Các mảnh bao hoa dài khoảng mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, bên gốc mang - dải hẹp, đầu chẻ đôi Mùa hoa tháng 10 - 12 Mùa chín tháng 12 - năm sau Thân khí sinh Thân ngầm A B Hình 2.1 Cây (A) hoa (B) lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.2.1 Phân bố theo kiểu rừng: Kết điều tra rằng, lan Kim tuyến hầu hết phân bố kiểu rừng kín rộng thường xanh nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có tầng gỗ Đơi gặp lan Kim tuyến kiểu rừng kín rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới - Tầng ưu sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với loài gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v Chiều cao tầng A2 từ 15-25 m - Tầng gỗ A3: Bao gồm loài tầng cịn nhỏ lồi tầng như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v Chiều cao tầng A3 từ 815m - Tầng bụi B: Gồm loài thực vật Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v… Ớt rừng - Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dị (Costus speciosus), Mía dị bắc (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lịng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v… - Thực vật ngoại tầng: Bao gồm loài thuộc chủ yếu họ Mã Tiền (Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bịng bong (Schizaeaceae) Điển hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bị (Bauhinia sp.), Bịng bong loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v… - Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến thấp, trung bình khoảng 20 cây/ha Chúng phân bố rải rác số điểm thuộc khu vực nghiên cứu 1.1.2.2 Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng sinh cảnh - Theo trạng thái rừng: Kết điều tra khẳng định, lan Kim tuyến phân bố tập trung chủ yếu trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi Vườn quốc gia Độ tán che trạng thái rừng từ 85-90% Đặc điểm bụi thảm tươi khu vực Lan Kim tuyến phân bố thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao lớp bụi thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ khu vực Lan Kim tuyến thường phân bố nơi bụi thảm tươi dày đặc Chúng nằm lớp thảm mục rừng bị phân huỷ - Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố đất, chúng mọc sát bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm độ xốp cao, thống khí; chí lớp thảm mục rừng phân huỷ Đôi chúng mọc tảng đá ẩm, đoạn thân gỗ mục, gốc Có thể bắt gặp lan Kim tuyến rừng nơi ẩm ướt, ven khe suối, tán rừng gỗ lớn, rừng trúc, rừng sặt, đường mòn lại rừng 1.1.2.3 Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình đai cao - Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng hầu hết dạng địa hình, chân núi, sườn núi, đỉnh núi - Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố đai cao 735m, tập trung chủ yếu độ cao 970m, quanh núi Rùng Rình 1.2 Nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) Nhân giống in vitro lĩnh vực ứng dụng cơng nghệ tế bào thực vật mang lại hiệu kinh tế lớn (Lê Trần Bình, 1997) Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ mục đích sau: Duy trì nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác tạo giống Nhân nhanh trì cá thể đầu dịng tốt để cung cấp hạt giống loại trồng khác lương thực có củ, loại rau, hoa, cảnh, dược liệu thuộc nhóm thân thảo Nhân nhanh kinh tế kiểu gen quý giống lâm nghiệp gốc ghép nghề trồng ăn quả, cảnh thuộc nhóm thân gỗ Nhân nhanh điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với làm virus Bảo quản tập đồn giống nhân vơ tính loại giao phấn ngân hàng gen 1.2.1.1 Cơ sở khoa học nhân giống in vitro Tính tồn tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật để chứng minh cho tính tồn tế bào thực vật Theo ơng, tế bào lấy từ quan sinh vật đa bào có khả tiềm tàng phát triển thành thể hoàn chỉnh Khả tế bào chứa gen mang thông tin di truyền toàn thể, đặt vào mơi trường thích hợp tế bào có khả giống hợp tử ban đầu Một đặc tính quan trọng khác, làm sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật khả biệt hóa phản biệt hóa tế bào Khả biệt hóa biến đổi tế bào từ tế bào phơi thành tồn tế bào chức quan thể Ngược lại, đặt vào mơi trường thích hợp, tế bào chuyên hóa thể trở lại trạng thái tế bào sinh – tế bào phơi Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu chứng minh, khả phản biệt hóa tế bào khác nhau, tế bào chuyên hóa sâu tế bào hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả biệt hóa khó xảy Đối với thực vật, khả hình thành quan hay thể giảm dần theo chiều từ xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974) Trong tự nhiên, tất loài sinh vật tồn tiềm sinh sản dù vơ tính hay hữu tính, lồi trì kiểu gen mình, chiến thắng q trình tiến hóa Nhưng từ đời, công nghệ nuôi cấy mô trở thành cơng cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống người Vậy lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta xem xét ý nghĩa to lớn mà mang lại cho nhân loại CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Hình 2.1 Cây Lan Kim tuyến tự nhiên Mẫu chồi tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thu từ Địa điểm thời gian nghiên cứu + Địa điểm: Trung tâm CNSH – Công ty TNHH MTV Giống Cây Trồng Số – Trảng Bom – Đồng Nai + Thời gian: 2.2 Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng loại auxin: 2.3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn 2.3.1 Ý nghĩa khoa học - Khóa luận cung cấp dẫn liệu khoa học loài lan (Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến - Cung cấp sở khoa học quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume - Các kết nghiên cứu bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho cơng tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) 2.3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất Anoectochilus setaceu Blume nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao 2.4 Nội dung nghiên cứu 2.4.1 Nghiên cứu mơi trường thích hợp cho rễ, tạo hoàn chỉnh 2.5.Phương pháp nghiên cứu Điều kiện nuôi cấy - Mẫu cấy môi trường khử trùng 1,4 atm, 1210C - pH mơi trường là: 5,4 - Nhiệt độ phịng nuôi: 25±20C - Cường độ ánh sáng: 2000 lux - Thời gian chiếu sáng: 16 chiếu sáng/ngày đêm 2.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm A Nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh Khi chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 cấy chuyển sang môi trường rễ Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng môi trường (không có chất điều tiết sinh trưởng) than hoạt tính đến rễ Mỗi cơng thức bố trí lần nhắc lại, lần nhắc lại mẫu, cơng thức 18 mẫu Thí nghiệm Ảnh hưởng môi trường (môi trường dinh dưỡng bản) đến rễ CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar 2.5.2 Phương pháp đánh giá kết xử lý số liệu Các tiêu theo dõi Σ Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số mẫu sống Tỷ lệ mẫu sống ( %) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số mẫu tạo chồi Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100 Σ Số mẫu cấy ban đầu Σ Số mẫu thu Hệ số nhân (lần) = Σ Số mẫu cấy ban đầu Σ Chiều cao chồi Chiều cao TB chồi (cm) = Σ Chồi theo dõi Σ Số chồi thu Số chồi (chồi/mẫu) = Σ Số mẫu ban đầu Σ Số đốt Số đốt (đốt/chồi) = Σ Số chồi Σ Số Số (lá/chồi) = Σ Số chồi Σ Số mẫu tạo rễ Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = x 100 Σ Số mẫu theo dõi Σ Số rễ 10 Số rễ (rễ/chồi) = Σ Số chồi Σ Chiều dài rễ 11 Chiều dài TB rễ (cm) = Σ Số rễ\ Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý theo chương trình MICROSOFT EXCEL IRRISTART 5.0 máy vi tính 12 Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống con, đặc điểm Số sống Tỷ lệ sống = x 100 Tổng số trồng ban đầu Đặc điểm (màu sắc lá, hình thái rễ) 13 Thời gian thu thập: tuần quan sát ghi số liệu lần CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... như: D? ?y hoa d? ?? (Desmos chinensis), D? ?y d? ??t na (Desmos spp.), D? ?y kim cang loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), D? ?y sưa (Dalbergia... Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata),... nhạt Cuống d? ?i - cm Cụm hoa d? ?i 10 - 15 cm, mang - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, d? ?i 8-10 mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, d? ?i 2,5 - cm; môi d? ?i đến 1,5 cm, bên gốc mang - d? ??i hẹp, chẻ