Xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen trên giống dưa chuột việt nam (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN TRÊN GIỐNG DƯA CHUỘT VIỆT NAM (CUCUMIS SATIVUS L.) Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thành Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Đỗ Tiến Phát GS TS Phan Hữu Tôn HÀ NỘI 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng báo cáo Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc giúp đỡ cảm ơn Sinh viên thực Nguyễn Thị Thành i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài tốt nghiệp này, em nhận giúp đỡ từ nhiều thầy cô, anh chị Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban lãnh đạo Học viện nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện giúp em thực khóa luận tốt nghiệp Qúy thầy khoa Cơng nghệ sinh học góp ý hỗ trợ em q trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy TS Đỗ Tiến Phát trực tiếp gợi ý định hướng đề tài, tận tình góp ý lên kế hoạch hỗ trợ em hồn thành khóa luận thời hạn Cảm ơn thầy GS.TS Phan Hữu Tôn, người quan tâm thường xun góp ý giải thích cho em hướng kiến thức trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Lý Khánh Linh chị Hoàng Thị Huyền Trang, chị trực tiếp dạy em từ ngày Các anh chị cán làm việc Viện công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp góp ý để em ngày hồn thiện báo cáo Một lần nữa, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Thành ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC BẢNGDANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ v DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.1.1 Mục đích đề tài 1.1.2 Yêu cầu đề tài Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu dưa chuột 2.1.1 Nguồn gốc, phân loại phân bố 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc tính sinh học 2.1.4 Giá trị dinh dưỡng giá trị sử dụng dưa chuột 2.2 Một vài nét tình hình nghiên cứu, sản xuất tiêu thụ dưa chuột giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất tiêu thụ dưa chuột giới 2.2.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất tiêu thụ dưa chuột Việt Nam 11 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tái sinh in vitro 13 2.3.1 Điều kiện khử trùng 13 2.3.2 Điều kiện môi trường 14 2.3.3 Điều kiện vật lý 17 2.3.4 Mẫu nuôi cấy 17 2.4 Kỹ thuật chuyển gen thực vật 18 2.4.1 Lịch sử phát triển kỹ thuật chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium thực vật 19 2.4.2 Phương thức chuyển gene gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium 20 2.4.3 Thành tựu kỹ thuật chuyển gen thực vật 23 iii Chương 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 3.1.2 Hóa chất 24 3.1.3 Thiết bị 24 3.2 Nội dung nghiên cứu 25 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng hocmon sinh trưởng đến khả tái sinh dưa chuột 25 3.2.2 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng 25 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn A.tumefaciens đến hiệu chuyển gen gus 26 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen gus 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.4 Các tiêu theo dõi phương pháp xử lý số liệu 26 3.4.1 Các tiêu theo dõi 26 3.4.2 Phương pháp xử lý số liệu 27 3.5 Điều kiện thí nghiệm 27 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Ảnh hưởng hocmon sinh trưởng đến khả tái sinh dưa chuột 28 4.2 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng 31 4.3 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A.tumefaciens đến hiệu chuyển gen gus 32 4.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen gus 35 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 44 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Năm quốc gia có sản lượng dưa chuột hàng đầu giới Bảng 2.2: Sản lượng tiêu thụ dưa chuột bình quân đầu người nước có sản lượng dưa chuột lớn Bảng 4.1 : Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng lên khả tạo cụm đa chồi mẫu dưa chuột 29 Bảng 4.2 : Tỷ lệ sống sót ba loại giá thể 31 Bảng 4.3 :Ảnh hưởng mật độ khuẩn thời gian đồng nuôi cấy đến khả biểu chuyển gen 33 Bảng 4.4 :Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen gus 35 v DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Sản lượng dưa chuột giới từ năm 2005-2019 Hình 4.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến khả tạo cụm đa chồi 30 Hình 4.2 Tạo dưa chuột hồn chỉnh 32 Hình 4.3 Ảnh hưởng mật độ khuẩn đến hiệu chuyển gen gus 34 Hình 4.4 Kết nhuộm Gus nồng độ OD = 1,0 35 Hình 4.5 Mẫu nhuộm gus chồi chuyển gen OD=1,0 ngày đồng nuôi cấy 36 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA Acid Abscisic AS Acetosyrigone BAP 6-benzyladenine CT Công thức DNA Deoxyribonucleic Acid DMSO Dimethyl sulfoxide Gus β –Glucuronidase gene MS Murashige and Skoog OD Optical density T-ADN Transfer –DNA Ti-Plasmid Tumor inducing plasmid Vir Virulence Region X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide YEP Yeast extract pepton vii TÓM TẮT Dưa chuột (Cucumis sativus L.) loại rau ăn quen thuộc đời sống người Được trồng sử dụng phổ biến toàn giới giá trị sử dụng lẫn giá trị dinh dưỡng dưa chuột đem lại Do nhu cầu cải thiện chất lượng giống dưa chuột ngày tăng Trong việc ứng dụng cơng nghệ sinh học vào trình giúp đẩy nhanh tốc độ cải thiện giống nhờ kỹ thuật liên quan đến kỹ thuật di truyền liệu pháp gen Tuy nhiên, để ứng dụng thành công công nghệ chuyển gen vào chọn tạo giống bước phải xây dựng hệ thống tái sinh thử nghiệm khả chuyển gen Vì vậy, tơi xin thực đề tài “Xây dựng hệ thống tái sinh chuyển gen giống dưa chuột Việt Nam (Cucumis sativus L.)” Nghiên cứu ảnh hưởng hai loại hocmon BAP ABA đến khả tái sinh dưa chuột Kết cho thấy, môi trường tối ưu cho trình tái sinh dưa chuột từ mảnh mầm MS + 2,5g/L Gellan + 30g/L sucrose + 1,5mg/L BAP + 1,0mg/L ABA, pH = 5,8 Nhằm hoàn thiện quy trình tái sinh, tơi sử dụng tái sinh hoàn chỉnh in vitro đem trồng ba loại giá thể khác Kết thu loại giá thể thích hợp cho trình 100% giá thể trơ Sau xây dựng quy trình tái sinh, tơi tiến hành thí nghiệm chuyển gen vào mảnh mầm dưa chuột nhằm xác định ảnh hưởng mật độ khuẩn thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen gus Kết thu cho thấy khả biểu gus tạm thời đạt ngưỡng cao mật độ khuẩn có OD = 1,0 với thời gian đồng nuôi cấy ngày viii Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Rau xanh nhu cầu thiết yếu bữa ăn ngày người chúng tạo nên bữa ăn cân đối đủ đầy mặt dinh dưỡng Đi kèm với việc xã hội ngày phát triển, đời sống vật chất tinh thần người khơng ngừng cải thiện việc chuyển biến nhu cầu từ ăn ngon sang ăn uống cho lành mạnh xu hướng người vô quan tâm Rau cung cấp chất cần thiết cho tồn phát triển thể protein, lipit, muối, axit hữu cơ,… vitamin (A, B1, B2, C, E ) chất khống (Ca, Fe…) Vì vậy, người thường đưa loại thức ăn có nguồn gốc thực vật rau, củ vào thực đơn gia đình Dưa chuột (Cucumis sativus L.), thuộc họ bầu bí Cucurbitaceae, trồng đem lại giá trị kinh tế cao trồng nhiều nước giới Đây loại chứa nhiều thành phần dinh dưỡng chất đạm, chất béo, nước, protein, carbohydrate, vitamin khống tố khác Ngồi giá trị dinh dưỡng, dưa chuột mang lại giá trị kinh tế cao làm nguồn nguyên liệu cho nhà máy chế biến có nhiều cơng dụng làm đẹp trang trí nghệ thuật Tuy nhiên, suất sản lượng dưa chuột lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố đặc tính giống, điều kiện môi trường, kỹ thuật canh tác Dưa chuột trồng mẫn cảm với sương giá, khó thích ứng với điều kiện bất thuận hạn úng Cùng với sản xuất dưa chuột phải đối mặt với nhiều bệnh hại gây nấm, virus vi khuẩn gây thiệt hại lớn suất hiệu kinh tế Chính vậy, việc tạo giống dưa chuột có suất cao, ổn định, có khả thích nghi rộng với điều kiện thời tiết khí hậu cần thiết Trong đó, ứng dụng cơng nghệ sinh học tạo giống trồng ưu tiên phát triển hàng đầu nay, giúp nâng cao hiệu quả, đồng thời rút ngắn Do đó, tơi sử dụng loại nồng độ khuẩn khác gồm 0,3; 0,5; 0;8 1,0 Vật liệu sử dụng mảnh mầm dưa chuột (kích thước 0,3*0,3cm) vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 mang gen thị gus gen kháng kháng sinh Kanamycin Kết thu sau: Bảng 4.3 :Ảnh hưởng mật độ khuẩn thời gian đồng nuôi cấy đến khả biểu chuyển gen Nồng Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ biểu Số Tỷ lệ mẫu mẫu nhiễm (%) 15 ngày 20 ngày 25 ngày (%) 0,3 90 47,78 63,33 87,78 17,77±1,923 0,5 90 56,67 71,11 92,22 21,11±1,924 0,8 90 64,44 81,11 93,33 40,01±3,33 1,0 90 72,22 87,78 97,78 52,22±5,09 Đ/C 20 0 0 độ OD 600nm GUS Với dải nồng độ OD 600nm biến thiên từ 0,3-1,0, thời điểm khác q trình ni cấy, mẫu dưa chuột cho tỷ lệ tạo mô sẹo khác Tỷ lệ tạo mô sẹo thấp nồng độ OD 600nm = 0,3 (87,78% tạo mô sẹo tỷ lệ biểu gus 17,77%) cao nồng độ OD 600nm = 1,0 (97,78% tạo mô sẹo tỷ lệ biểu gus lên đến 52,22%) Lựa chọn nồng độ OD=1,0 nồng độ OD thích hợp Ở mẫu đối chứng, tỷ lệ tạo mô sẹo tỷ lệ mẫu biểu gen gus 0% khơng có xâm nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens Mơ sẹo xuất vị trí bị loại bỏ đỉnh sinh trưởng mảnh dưa chuột, cụ thể vị trí bị tổn thương q trình lây nhiễm vi khuẩn Sau nhuộm với dung dịch nhuộm X-Gluc quan sát, thấy chấm nhỏ màu xanh xuât khu vực tạo mô sẹo Màu xanh đậm cho thấy hiệu chuyển gen cao ngược lại 33 Từ kết trên, định sử dụng nồng độ OD 600nm = 1,0 làm sở để tiến hành thí nghiệm a b c d e Hình 4.3 Ảnh hưởng mật độ khuẩn đến hiệu chuyển gen gus a: Đối chứng, b: OD=0,3, c: OD=0,5, d: OD=0,8, e: OD=1,0 34 4.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen gus Bên cạnh nồng độ vi khuẩn thời gian lây nhiễm nhân tố vô quan trọng, ảnh hưởng đến khả xâm nhiễm vi khuẩn Do tơi tiến hành đồng nuôi cấy mẫu dưa chuột lây nhiễm với dung dịch vi khuẩn A.tumefaciens thời điểm ngày, ngày ngày mật độ OD 600nm = 1,0 Sau rửa khuẩn nhuộm mẫu với dung dịch nhuộm X-Gluc thu kết sau: Bảng 4.4 :Ảnh hưởng thời gian đồng ni cấy đến hiệu chuyển gen gus Thí nghiệm Chuyển Số mẫu Tỷ lệ biểu gus tạm thời (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm ngày 90 52,22±3,14 22,22±1,92 38,88±12,62 20 0 0 gen PBI121 Đối chứng Tỷ lệ biểu gus cao ngày đồng nuôi cấy (tỷ lệ đạt 52,22%) biểu thấp ngày (22,22%) Vì tơi định chọn thời gian đồng nuôi cấy ngày làm sở cho thí nghiệm Hình 4.4 Kết nhuộm Gus nồng độ OD = 1,0 a: Là mẫu nhuộm gus ngày đồng nuôi cấy; b: mẫu nhuộm gus ngày đồng nuôi cấy; c: mẫu nhuộm gus ngày đồng nuôi cấy 35 Kiểm tra quy trình tối ưu Sau xác định mật độ OD tối ưu 1,0 thời gian đồng nuôi cấy ngày, em tiến hành thí nghiệm chuyển gen với mật độ OD=1,0 thời gian đồng nuôi cấy ngày nhằm tạo chuyển gen đem nhuộm mơ hóa tế bào, từ xác định khả chuyển gen quy trình tối ưu Hình 4.5 Mẫu nhuộm gus chồi chuyển gen OD=1,0 ngày đồng nuôi cấy 36 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trong công thức môi trường sử dụng nuôi cấy tái sinh dưa chuột in vitro, công thức môi trường bao gồm MS + 1,5 mg/L BAP + mg/L ABA + 30g sucrose +2,5 g/L gellan, pH=5,8 cho tỷ lệ tái sinh tối ưu sau 10 tuần nuôi cấy Đã thành công tạo hoàn chỉnh từ nguyên liệu mảnh mầm giống dưa chuột Choka-F1 Chọn lựa thành phần giá thể cho tỷ lệ sống bên điều kiện tự nhiên cao trồng 100% giá thể trơ (tỷ lệ sống 66.67%) Xác định ngưỡng mật độ thời gian đồng ni cấy tối ưu cho q trình chuyển gen OD 600nm = 1,0 Xác định ngưỡng thời gian đồng ni cấy thích hợp ngày 5.2 Kiến nghị Tiếp tục hoàn thiện hệ thống nuôi cấy, tái sinh đánh giá hoạt động gen gus từ dòng thu sau chuyển gen Áp dụng quy trình chuyển gen để chuyển gen mục tiêu vào dưa chuột thuộc giống ChoKaf1 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Trần Anh Tuấn, Trần Thị Minh Hằng (2016) “Đặc điểm sinh trưởng sinh lý số mẫu giống dưa chuột địa Việt Nam (Cucumis sativus L.) bị hạn giai đoạn con” Tạp chí KH Nơng nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 9: pp 1305-1311 Trần Thị Lệ, Nguyễn Hồng Phương (2009), “Nghiên cứu khả thay phần phân đạm vô số chế phẩm (phân) sinh học cho dưa leo (Cucumis sativus L.) đất thịt nhẹ vụ xuân 2009 Quảng Trị” Tạp chí khoa học, số 55, pp.13-23 Phạm Mỹ Linh, Ngơ Thị Hạnh, Lê Thị Tình, Nguyễn Tuấn Dũng (2013), “Kết nghiên cứu chọn tạo giống dưa chuột lai F1 GL1-2”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam, 2013 Tr 1-17 Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Qúy (2004), sách “Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gen chọn giống trồng”, nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, năm 2004 Dương Huỳnh Ngọc Trân, Lê Thị Diễm, Võ Thị Bạch Mai (2020), “Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến tạo rễ ni cấy in vitro sâm bố (Abelmoschus Sagittifolius Kurz)” Tạp chí phát triển khoa học Cơng nghệ - Khoa học tự nhiên, tập 4, số 2:556-566 Trần Văn Minh (1994) Giáo trình “Ni cấy mơ, tế bào thực vật” TTKHTN Công nghệ Quốc gia – Viện Sinh học nhiệt đới – Phân viện Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh Đỗ Tiến Phát (2009) “Xây dựng quy trình tái sinh thử nghiệm khả chuyển gen gus vào thông nhựa (Pinus merkusii jungh & de veries)” Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Đại học nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Thị Thu Trang, Vũ Thị Đào, Bùi Minh Trí (2017), “Xây dựng quy trình chuyển gen đơn giản hiệu để cảm ứng tạo rễ tóc khổ qua rừng 38 (Momordica charantia L var abbreviata Ser.)” Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2017, tập 15, số 1: 92-99 Hoàng Thị Giang, Mai Đức Chung, Nguyễn Thị Huế, Jérémy Lavarenne, Mathieu Gonin, Nguyễn Thanh Hải, Đỗ Năng Vịnh, Pascal Gantet (2015) “Hồn thiện quy trình chuyển gen cho giống lúa Taichung 65 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Tạp chí Khoa học Phát triển 2015, tập 13, số 5: 764-773 10 Trần Danh Sửu, Hồ Thị Minh,Trần Thị Thu Hoài, Hà Minh Loan, Lê Xuân Vị, Mai Văn Quân, “Đánh giá khả kháng bệnh tập đồn dưa chuột”, Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, Trung tâm Tài nguyên thực vật, Viện Bảo vệ thực vật tr 1-9 11 Trần Anh Tuấn, Trần Thị Minh Hằng (2016), “Đặc điểm sinh trưởng sinh lý số mẫu giống dưa chuột địa Việt Nam (Cucumis sativus L.)”, Tạp chí KH Nơng nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 9: 1305-1311 Tài liệu nước 12 Elmahdy M, Mohame K (2015) “Evaluation of Selected Cucumis sativus Accessions for Resistance to Pseudoperonospora cubensis in Egypt” Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 51: pp 68-74 13 Z K Punja, N Abbas, G G Sarmento & F A Tang (1990), “Regeneration of Cucumis sativus var sativus and C sativus var hardwickii, C melo, and C metuliferus from explants through somatic embryogenesis and organogenesis”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture volume 21, pp 93–102 14 H G Ashok Kumar, H N.Murthya, K.Y.Paek (2003), “Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L.)”, Scientia Horticulturae, Volume 98, Issue 3, pp 213-222 15 Paula P Chee (1990), “Transformation of Cucumis sativus tissue by Agrobacterium tumefaciens and the regeneration of transformed plants”, Plant Cell Reports volume 9, pp 245–248 39 16 S Nishibayashi , T Hayakawa, T Nakajima, M Suzuki, H Kaneko (1996) “CMV protecton in transgenic cucumber plants with an introduced CMV-O cp gene” Theoretical and Applied Genetics volume 93, pp 672–678 17 Zhimin Yin, Grzegorz B “Cucumber transformation methods–the review” Biotechnologia 1(68), pp 95-113 18 Murashige, T (1974) “Plant Propagation through Tissue Cultures” nnual Review of Plant Physiology, 25, pp 135-166 19 Li Z, Upadhyaya NM, Meena S, Gibbs AJ, Waterhouse PM (1997), “Molecular and cytogenetic analysis of stably and unstably expressed transgene loci in tobacco Plant cell vol.9, pp 1251-1264 20 Salas MG, Park SH, Srivatanakul A, Smith RH (2001) “Temperature influence on stable T-DNA integration in plant cells” Plant cells reports 20, pp 701-705 21 Zambre M, Terryn N, De Clercq J, De Buck S, Dillen W, Montagu MV, Straeten DVD, Angenon G (2003), “Light strongly promotes gene transfer from Agrobacterium tumefaciens to plant cells”, Planta 216, pp 580-586 22 Paula M Olhoft, Lex E Flagel, Christopher M Donovan, David A Somers (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”, Planta 216, pp 723-735 23 Sharawat AK & Lorz H (2006), “Agrobacterium-mediated transformation of cereals: a promising approach crossing barriers”, Plant Biotechnol Journal 4, pp 575-60 24 Tzfira T & Citovsky V (2006), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology”, Current Opinion in Biotechnology 17(2): pp 147-54 25 Omid Karami (2008) “Factors affecting Agrobacterium-mediated transformation of plants” Global science book pp 127-134 40 26 Amoah BK, Wang H, Sparks C, Jones HD (2001) “Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescenece tissue Journal of Experimental Botany 52, pp 1135-1142 27 Mondal TK, Bhattacharya A, Ahuja PS, Chand PK (2001), “Transgenic tea [Camellia sinensis (L.) O Kuntze cv Kangra Jat] plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos” Plant Cell Reports 20(8): pp 712-720 28 K Sharma, Vanamala Anjaiah (2000) “An efficient method for the production of transgenic plants of peanut (Arachis hypogaea L.) through Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation” Plant Science 159 (1), pp 7-19 29 Ebrahim Firoozabady, David L DeBoer, Donald J Merlo, Edward L Halk, Lorraine N Amerson, Kay E Rashka & Elizabeth E Murray “Transformation of cotton (Gossypium hirsutum L.) by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenic plants” Plant Molecular Biology vol 10, pages105– 116 30 Yukoh Hiei Shozo Ohta Toshihiko Komari Takashi Kumashiro (1994) “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T‐DNA” The plant journal 6(2), pp 271-282 31 Aldemita RR & Hodges TK (1996) “Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties” Planta vol 199, pp 612– 617 32 Ayres NM & Park WD (1994) “Genetic transformation of rice Crit Rev” Plant sci, 13(3), pp 219-239 33 S H T Raharjo, M O Hernandez, Y Y Zhang & Z K Punja (1996) “Transformation of pickling cucumber with chitinase-encoding genes using Agrobacterium tumefaciens” Plant Cell Reports volume 15, pp 591–596 41 34 Dong Chunhai, Wang Shanping, Wei Zhiming, Shen Zhende, Xu Zhihong (1993) “Effect of introducing isopentenyl transferase gene on endogenous hormones in transgenic cucumber (Cucumis sativus L.)” Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 19(2): pp.149-154 35 Sureshkumar et al., 2005 Sureshkumar P, N Selvaraj, A Ganapathi, S Kasthuriengan, A Vasudevan, V R Anbazhagan “Assessment of factors influencing Agrobacterium mediated transformation in cucumber (Cucumis Sativus L.)” Journal of Plant Biotechnology, 74 (2005), pp 225-231 36 Ding Z.S, Zhao M, Jing Y.X, Li L.B and Kuang T.Y (2006), “Efficient Agrobacterium – Mediated transformation of Rice by Phosphomannose Isomerase/Mannose selection”, Plant Molecular Biology Reporter, (24), pp 295-303 37 Gelvin S.B (2003), “Agrobacterium - mediated plant transformation the biology behind the “Gene - jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(1), pp 16-37 38 DeClercq J, M Zambre, M Van Montagu, W Dillen & G Angenon (2002) “An optimized Agrobacterium-mediated transformation procedure for Phaseolus acutifolius A Gray” Plant Cell Reports volume 21, pp 333–340 39 Ditt R F., Nester E., Comai L (2005) “The plant cell defense and Agrobacterium tumefaciens” FEMS Microbiol Lett 247, pp 207–213 Jefferson, Richard A (1987) “Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system” Plant Molecular Biology Reporter (5): pp 387-405 40 VÍCTOR M JIMÉNEZ (2001) “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of Endogenous hormones” Rev Bras Fisiol Veg vol.13 no.2: pp 196-223 42 Bell LM, Trigiano RN, Conger BV (1993) “Relationship of abscisic acid to somatic embryogenesis in Dactylis glomerata” Environ Exp Bot 33: pp 495– 499 41 Rajasekaran K, Hein MB, Vasil IK (1987) “Endogenous abscisic acid and indole-3-acetic acid and somatic embryogenesis in cultured leaf explants of Pennisetum purpureum Schum.: effects in vivo and in vitro of glyphosate, fluridone, and paclobutrazol” Plant Physiol 84: pp 47–51 42 Zhenxian zhang, Xin Li, Si Ma, Nan Shan, Xiaolan Zhang, Xiaolei Sui “2017” “A Protocol for Agrobacterium-mediated Transformation of Cucumber (Cucumis sativus L.) from cotyledon explants”, pp 1-19 Tài liệu internet 43 http://camnangcaytrong.com/cay-dua-chuot-dua-leo-cd29.html Truy cập ngày 12/01/2021 44 https://www.worldatlas.com/articles/the-world-leaders-in-cucumber- production.html Truy cập ngày 12/01/2021 45 https://www.atlasbig.com/en-us/countries-cucumber-production Truy cập ngày 14/01/2021 46 https://www.tridge.com/intelligences/cucumber/production Truy cập ngày 13/01/2021 47 http://www.thuvientailieu.vn/tai-lieu/tong-quan-ve-nguyen-lieu-dua-leo- 28222/ Truy cập ngày 19/01/2021 48 https://cocobio.com.vn/san-pham/chat-dieu-hoa-sinh-truong-bap/ Truy cập ngày 19/01/2021 49 https://www.nuoicaymothucvat.net/2018/05/acid-abscisic-la-gi-va-vai-tro- cua-acid.html Truy cập ngày 26/01/2021 50 https://www.slideshare.net/hanhhien77/k-thut-nui-cy-in-vitro-v-thc-hnh-trncy-hoa-cc Truy cập ngày 01/02/2021 43 PHỤ LỤC Phụ lục bảng Thành phần loại môi trường sử dụng thí nghiệm Bảng 1: Thành phần mơi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Nhóm Hóa chất Hàm lượng (mg/L) KNO 1900 NH NO 1650 Đa lượng CaCl Vi lượng Vitamin 332,02 MgSO 180,54 KH PO 170 H BO 6,2 MnSO 22,3 ZnSO 8,6 KI 0,83 Na MoO 0,25 CuSO 0,025 CoCl 0,025 Na EDTA 37,3 FeSO 7H O 27,8 Glysin Nicotinic acid 0,5 Myo-Inositol 100 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine HCl 0,1 Bảng 2: Thành phần môi trường YEP (Yeast Extract Pepton) Hóa chất Bacto-yeast extract NaCl Pepton Hàm lượng (mg/L) 10 10 44 Phụ lục hình ảnh: Một số hình ảnh q trình thực khóa luận tốt nghiệp Hình ảnh 1: Gieo hạt dưa chuột Chokaf1 45 Hình ảnh 2: Ni cấy mơ dưa chuột Hình ảnh 3: Ni cấy vi khuẩn mơi rường thạch Hình ảnh 4: Ly tâm vi khuẩn 46 Hình ảnh 5: Nhuộm biểu gus với mẫu chuyển gen 47